周文旭，吳曉燕，施秉銀，倪 寧，丁晨光，管智慧，姜亞卓，項和立

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西西安 710061；2.西安交通大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，陜西西安 710049)

樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)的來源及分化發(fā)育的成熟度與其功能關(guān)系緊密。人體內(nèi)DC具有成熟和未成熟兩種形態(tài)，前者是早期免疫應(yīng)答強有力的抗原遞呈細(xì)胞(APC)，后者能誘導(dǎo)免疫耐受[1]。致耐受性樹突狀細(xì)胞(tDC)是誘導(dǎo)機體特異性免疫耐受的強有力工具。然而，由于DC在體內(nèi)含量極微，無法從活體組織直接分離獲得足量DC。造血干細(xì)胞(HSC)具有高度自我更新的能力和多能分化的潛能，是分化為DC的主要造血前體細(xì)胞，骨髓中的HSC含量遠(yuǎn)高于脾臟和外周血[2]。近年來，國內(nèi)外研究報道，使用特定的細(xì)胞因子組合方案可以有效誘導(dǎo)小鼠骨髓HSC體外擴增并向DC定向分化[3]。免疫磁珠法具有分選純度高、高效快速、操作簡單等優(yōu)點[4]。

雌性BALB/C小鼠是目前主要的Graves病(GD)動物模型。GD是器官特異性自身免疫性疾病，發(fā)病率高，可累及全身多個系統(tǒng)，對人類生命健康危害很大。近年來，機體免疫系統(tǒng)對某些自身成分免疫耐受的誘導(dǎo)和重建是自身免疫性疾病研究備受關(guān)注的焦點，維持或重建機體對自身抗原TSH受體(TSHR)的有效免疫耐受，可能成為一種防治甲狀腺功能亢進(jìn)癥的新方法。DC仍然是GD免疫應(yīng)答中的主要APC[5]。由于DC在免疫耐受誘導(dǎo)中的重要作用，建立一種能長期穩(wěn)定地獲得BALB/C小鼠骨髓源性DC并進(jìn)行鑒定的有效方法成為GD免疫耐受相關(guān)研究的關(guān)鍵。目前尚沒有應(yīng)用免疫磁珠法自BALB/C小鼠中分離純化誘導(dǎo)未成熟DC(imD)的研究報道。

本研究應(yīng)用免疫磁珠法，自BALB/C小鼠骨髓中分離、純化CD117+HSC，再加入相應(yīng)的細(xì)胞因子促進(jìn)HSC體外擴增，并誘導(dǎo)HSC定向分化為DC，最后進(jìn)行形態(tài)、功能及表面標(biāo)志鑒定，建立DC前體細(xì)胞的儲備庫，為進(jìn)一步行基因修飾DC誘導(dǎo)GD免疫耐受研究奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 SPF級別健康雌性BALB/C 8周齡小鼠，體質(zhì)量20～25 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑 重組小鼠細(xì)胞因子：干細(xì)胞因子(rmSCF)、白細(xì)胞介素3(rmIL-3)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、白細(xì)胞介素4(rmIL-4)、白細(xì)胞介素10(rmIL-10)、腫瘤壞死因子α(rmTNF-α)購自美國R&D公司(貨號分別為455-MC-010、403-ML-010、415-ML-010、404-ML-010、417-ML-025、410-MT-010)。FITC標(biāo)記的流式細(xì)胞計數(shù)抗體(FITC anti-mouse CD11c、FITC anti-mouse CD40、FITC anti-mouse CD80、FITC anti-mouse CD86、FITC anti-mouse I-A/I-E)及FITC標(biāo)記的同型對照抗體(FITC Armenian Hamster IgG、FITC Armenian Hamster IgM、FITC Armenian Hamster IgG、FITC Rat IgG2a、FITC Rat IlgG2b)購自美國BioLegend公司(貨號分別為117305、124608、104705、105109、107606)。脂多糖(LPS)購自美國Invitrogen公司(貨號tlrl-pglps)。小鼠IL-12 ELISA檢測試劑盒購自美國BioSource公司(貨號HZ-E0644m)。

1.1.3主要儀器 免疫磁珠分離系統(tǒng)：德國MiltenyiBiotec GmbH公司專利產(chǎn)品MiniMACS & MidiMACS。倒置相差顯微鏡：日本NIKON公司TE2000-U型。掃描電子顯微鏡：日本電子(JEOL)公司JSM-840。透射電子顯微鏡：日本日立(HITACHl)公司H-600。流式細(xì)胞儀：美國BD公司FACS Calibur。酶聯(lián)免疫檢測儀：美國Biokit公司Elx800。

1.2 方法

1.2.1BALB/C小鼠骨髓來源的CD117+HSC分離純化及體外增殖 將BALB/C小鼠斷頸處死，于超凈工作臺中取出股骨，用含雙抗1640培養(yǎng)基注入骨髓腔反復(fù)沖洗，用100目篩網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，離心、重懸、細(xì)胞計數(shù)。利用免疫磁珠分離系統(tǒng)(MACS)自小鼠骨髓中分離、純化CD117+HSC，接種于6孔板中，每孔加入25 ng/mL的rmSCF以及rmIL-3培養(yǎng)7 d，刺激HSC擴增，對比擴增前后細(xì)胞數(shù)量，了解擴增倍數(shù)。

1.2.2HSC定向誘導(dǎo)分化為DC 加入相應(yīng)的細(xì)胞因子，使HSC定向分化為DC。將上述擴增所得的造血干細(xì)胞加入基礎(chǔ)因子rmGM-CSF(50 ng/mL)及rmIL-4(20 ng/mL)，以后每3 d以半量添加[6]。3 d后，將所得的造血干細(xì)胞分為兩組：擬分化為未成熟DC(imDC)組和擬分化為成熟DC(mDC)組。在rmGM-CSF及rmIL-4基礎(chǔ)上，imDC組中加入rmIL-10(20 ng/mL)抑制成熟[7]，mDC組中加入rmTNF-α(20 ng/mL)促其分化為成熟[8]。以后每3 d以半量添加。同時追加細(xì)胞因子rmIL-4和rmGM-CSF。每日在倒置相差顯微鏡下觀察，比較兩組細(xì)胞在形態(tài)學(xué)方面的差異，總計培養(yǎng)7～9 d。

1.2.3DC的超微結(jié)構(gòu)及吞噬功能檢查 培養(yǎng)第9天，收獲兩組細(xì)胞(imDC和mDC)，分別制作標(biāo)本行掃描及透射電子顯微鏡檢查，觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)以及吞噬功能。其中imDC組于第9天提取部分細(xì)胞，加入凋亡細(xì)胞，共培養(yǎng)2 h，制作標(biāo)本后行電鏡檢查，觀察其吞噬功能。

1.2.4DC表型分析 培養(yǎng)第9天，收獲DC(imDC和mDC)，加入死活染料去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，將imDC和mDC分別根據(jù)所加入的不同標(biāo)記抗體分組。收集細(xì)胞，800 r/min離心5 min，PBS洗滌細(xì)胞2次并重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL，加入1 mL預(yù)冷的40 g/L多聚甲醛，4 ℃固定40 min，800 r/min離心5 min，再用PBS重懸細(xì)胞，每管細(xì)胞1×106個，體積為100 μL。分裝，然后逐一加入不同的FITC標(biāo)記抗體及其對照抗體，避光孵育后用PBS緩沖液沖洗，重懸成單細(xì)胞懸液，制作流式細(xì)胞計數(shù)標(biāo)本，將標(biāo)記好的樣品置入流式細(xì)胞儀，激發(fā)光波長488 nm檢測FITC熒光，應(yīng)用流式細(xì)胞計數(shù)(FACS)比較兩組細(xì)胞在表面標(biāo)志表達(dá)方面的差異。

1.2.5DC功能檢測 檢測脂多糖(LPS)刺激對DC細(xì)胞因子分泌量的影響。培養(yǎng)第8～9天，收獲兩組DC(imDC和mDC)。兩組DC細(xì)胞再分為A、B兩組，A組DC(imDC和mDC)培養(yǎng)液中分別加入10 μg/mL LPS培養(yǎng)24 h；B組DC(imDC和mDC)繼續(xù)原培養(yǎng)方案，不加LPS刺激，作為對照。分別于LPS刺激前以及刺激后24 h收集4組細(xì)胞的培養(yǎng)上清，應(yīng)用IL-12試劑盒，采取ELISA法測定IL-12的濃度，以此比較4組細(xì)胞在LPS刺激前后上述細(xì)胞因子分泌量的變化，以及刺激組和未刺激組之間的差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。分類變量采用數(shù)字或者百分比表示，連續(xù)變量采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用方差分析及SNK兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BALB/C小鼠骨髓來源的CD117+HSC分離純化及體外增殖情況在倒置相差顯微鏡下計數(shù)，自每只BALB/C小鼠股骨骨髓中可得到4×107～6×107個有核細(xì)胞，經(jīng)MACS系統(tǒng)分離、純化的CD117+HSC有3×105～5×105個，純度在95%以上。加入HSC刺激因子mSCF及mIL-3后，觀察HSC體外增殖情況。結(jié)果表明，mSCF加mIL-3方案可以有效刺激HSC擴增，細(xì)胞數(shù)在接種第3、5、7天分別可達(dá)到接種時的(10.34±1.43)倍、(22.65±2.71)倍、(54.39±3.08)倍。對兩組小鼠造血干細(xì)胞進(jìn)行凍存與復(fù)蘇，復(fù)蘇后細(xì)胞回收率達(dá)(84.04±2.83)%。

2.2 定向分化的DC形態(tài)學(xué)表現(xiàn)在光鏡下和電鏡下比較兩組細(xì)胞，mDC和imDC在光鏡(圖1)和掃描電鏡下(圖2)的形態(tài)有明顯差異，主要表現(xiàn)在樹突的密度、長度方面，mDC組細(xì)胞樹突相對較為粗大，呈樹枝狀或星狀，imDC組細(xì)胞樹突相對短小，呈毛刺狀；透射電鏡下(圖3)imDC核深染，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，近膜側(cè)有較多吞飲泡，可見吞噬凋亡細(xì)胞現(xiàn)象。

倒置相差顯微鏡顯示，imDC細(xì)胞表面出現(xiàn)少量的毛刺狀突起，形態(tài)稍不規(guī)則(圖1A)；mDC細(xì)胞表面有粗大的樹枝狀或星狀突起，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則(圖1B)。

圖1 BALB/C小鼠骨髓來源的DC培養(yǎng)(倒置相差顯微鏡, ×400)Fig.1 DC culture from bone marrow of BALB/C mice (inverted phase contrast microscope, ×400)A：未成熟DC(imDC)；B：成熟DC(mDC)。

掃描電鏡顯示，imDC細(xì)胞呈球形或不規(guī)則形，細(xì)胞表面不光滑，可見到許多短小的突起(圖2A)；mDC的細(xì)胞形態(tài)基本同imDC，其表面粗糙，細(xì)胞表面突起較長且多，呈毛刺狀、樹枝狀或星形突起(圖2B)。

圖2 BALB/C小鼠骨髓來源的DC(掃描電鏡, ×4 000)Fig.2 DCs from bone marrow of BALB/C mice (scanning electron microscope, ×4 000)A：未成熟DC(imDC)；B：成熟DC(mDC)。

透射電鏡顯示，imDC細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞表面有較多的微絨毛樣突起；核深染，細(xì)胞核不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)邊集，核仁可見；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)核糖體豐富，線粒體較小，嵴結(jié)構(gòu)清晰；近膜側(cè)有較多吞飲泡，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)還可見到被吞噬的細(xì)胞碎片及細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象(圖3A)。mDC細(xì)胞形態(tài)仍然不規(guī)則，細(xì)胞表面的突起較多，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富，線粒體數(shù)量較imDC組明顯增多，未見到凋亡細(xì)胞及細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象(圖3B)。

圖3 BALB/C小鼠骨髓來源的DC(透射電鏡, ×4 000)Fig.3 ImDCs and mDCs from bone marrow of BALB/C mice (TEM, ×4 000)A：未成熟DC(imDC)；B：成熟DC(mDC)。

2.3 DC表型分析DC表型分析的流式圖見圖4。流式細(xì)胞計數(shù)結(jié)果以百分比的形式表示。CD11c在imDC與mDC中均呈較高水平表達(dá)，兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。CD40、CD80、CD86、I-A/I-E在imDC中呈低水平表達(dá)，而在mDC的表達(dá)水平明顯增加，呈中水平或高水平表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表現(xiàn)為特征性的成熟DC表型(圖4)。

圖4 流式細(xì)胞計數(shù)檢測imDC及mDC細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)Fig.4 FACS of the expressions of imDC and mDC cell surface markers

2.4 DC功能檢測應(yīng)用LPS刺激DC，比較imDC和mDC在LPS刺激前、后以及未刺激狀態(tài)下IL-12分泌量變化。結(jié)果表明(圖5)，在LPS刺激前(A1)，imDC組及mDC組IL-12分泌量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.025)。使用LPS刺激24 h后，imDC組(A2)的IL-12分泌量較刺激前(A1)輕度升高(P=0.037)，與LPS未刺激組(B)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.064)；而mDC組IL-12分泌量在LPS刺激后24 h(A2)較刺激前(A1)明顯升高(P=0.007)，與未刺激組(B)比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)。imDC組及mDC組兩組細(xì)胞在LPS刺激后IL-12分泌量差值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)。結(jié)果表明，LPS刺激在促進(jìn)DC成熟上與TNF-α有協(xié)同作用，imDC在LPS刺激后其IL-12分泌量的上調(diào)不如mDC顯著，可能與IL-10的作用有關(guān)。

圖5 LPS刺激前后各組DC的IL-12分泌量Fig.5 IL-12 secretion of DCs before and after LPS stimulation

3 討 論

不同DC亞群的免疫功能有不同特點，機體imDC主要來源于骨髓中的HSC[9]，如何在體外分離培養(yǎng)獲得足夠數(shù)量和純度的功能性DC成為相關(guān)領(lǐng)域研究進(jìn)展的瓶頸。雌性BALB/C小鼠是目前主要的GD動物模型。研究表明，HSC的分化能力在幼年小鼠優(yōu)于老年小鼠[10]。因此，本研究采用健康雌性4～6周齡幼年BALB/C小鼠，自BALB/C小鼠股骨骨髓中分離DC的前體細(xì)胞。

HSC形態(tài)學(xué)上缺乏特異性，目前只能借助于其表面標(biāo)志進(jìn)行分選純化。CD117(c-kit)即HSC生長因子受體(SCFR)，高水平表達(dá)于多能干細(xì)胞表面，干細(xì)胞因子結(jié)合CD117后促進(jìn)HSC增殖分化，CD117是目前公認(rèn)的小鼠HSC分選的重要標(biāo)志[11]。目前有多種HSC分選方法，主要包括組織培養(yǎng)瓶貼壁、親和吸附柱、熒光活化細(xì)胞分選系統(tǒng)(FACS)、免疫磁珠分離系統(tǒng) (MACS)等。前2種方法DC的產(chǎn)率和純度不高、影響細(xì)胞活力、易于污染且費時費力。FACS和MACS均是免疫學(xué)細(xì)胞分選方法，能快速高效地分離純化體內(nèi)含量極少的一些細(xì)胞群。但FACS分選速度較慢(每小時處理約2.0×107個細(xì)胞)、技術(shù)要求高、儀器設(shè)備昂貴；MACS應(yīng)用單克隆抗體熒光染色法與免疫吸附細(xì)胞分離技術(shù)相結(jié)合，能直接從大樣本中分離純化特定細(xì)胞，并且可以高純度地分選出稀有細(xì)胞[4]，具備不影響細(xì)胞活性、分選效率高、回收率高、分離純度好、高效快速、操作步驟簡便等優(yōu)點。本研究采用德國Miltenyi Biotec GmbH公司的專利產(chǎn)品CD117單克隆抗體標(biāo)記的免疫磁珠陽性選擇法體外分離純化HSC。經(jīng)MACS系統(tǒng)分離、純化得到的CD117+HSC 5×105～6×105，占骨髓有核細(xì)胞總數(shù)0.9%左右，與文獻(xiàn)報道相符[11]。CD117+HSC純度在95%以上，解決了以往方法所分選的HSC純度低這一缺陷。

既往研究表明，細(xì)胞因子不同的組合方案以及不同濃度時，HSC擴增效果會有顯著差異[12]。在本研究中，使用SCF加IL-3細(xì)胞因子組合對HSC進(jìn)行培養(yǎng)擴增，結(jié)果表明，加入SCF和IL-3可以有效刺激HSC擴增，較以往研究節(jié)約了培養(yǎng)成本[12]。

體外條件下，DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)必須通過細(xì)胞因子刺激其生長，針對不同前體細(xì)胞加入不同細(xì)胞因子和不同培養(yǎng)條件，能夠改變DC的表型及功能。GM-CSF可以調(diào)控HSC向DC、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分化，而IL-4有利于HSC向DC定向分化，并使DC維持在未成熟狀態(tài)[13]。研究表明，小鼠骨髓HSC在GM-CSF和IL-4刺激后24～48 h即能分化為DC[3]。IL-10可使DC維持于未成熟狀態(tài)，并促進(jìn)Th1 細(xì)胞分化，誘導(dǎo)T 細(xì)胞無能[14]。TNF-α是在體外培養(yǎng)中促進(jìn)HSC分化而且促進(jìn)DC成熟的必備因子[15]。一些免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)如LPS、PGE2等可以促進(jìn)DC成熟[16]。本研究參考以往的研究[6]，聯(lián)合應(yīng)用rmGM-CSF和rmIL-4體外誘導(dǎo)HSC定向分化為DC，并加入不同的細(xì)胞因子控制DC的成熟度。結(jié)果顯示，聯(lián)合應(yīng)用rmGM-CSF(50 ng/mL)及rmIL-4(20 ng/mL)可以有效誘導(dǎo)DC定向分化，所培養(yǎng)細(xì)胞具有典型的DC形態(tài)特征，均明顯有別于單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并且隨著時間的推移這種變化越來越明顯(圖1，圖2，圖3)。FACS細(xì)胞表型分析證實所培養(yǎng)的DC為淋巴系DC。在體外誘導(dǎo)分化的過程中，相比以往研究[16]，本研究的GM-CSF用量相對較小，表明低劑量GM-CSF有利于保持DC的未成熟狀態(tài)。

DC具有異質(zhì)性，而人類及小鼠的DC表面，無論成熟狀態(tài)如何，CDllc表達(dá)均為陽性(人類漿細(xì)胞DC除外)[17]。CD830、CD80、CD86及CD40分子是成熟DC表面代表性的標(biāo)志物，DC成熟活化時，上述分子的表達(dá)上調(diào)[17]。除CD11c+外，imDCs缺乏特異性表面標(biāo)志[17]。本研究結(jié)果表明，未成熟DC組和成熟DC組均高表達(dá)CD11c，證實所培養(yǎng)的DC為淋巴系DC。加入了TNF-α刺激培養(yǎng)的mDC組，細(xì)胞表面標(biāo)志CD40、CD80、CD86及I-A/I-E(MHC-Ⅱ類分子)的表達(dá)明顯增強，表現(xiàn)為特征性的成熟DC表型；而imDC組低水平表達(dá)CD40、CD80、CD86及MHC-Ⅱ類分子，與文獻(xiàn)報道的imDC表型特征一致[17]。所獲得的imDC在細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志表達(dá)、功能上均符合imDC的生物學(xué)特征，證實在GM-SCF和 IL-4 誘導(dǎo)HSC向DC定向分化的基礎(chǔ)上加入IL-10培養(yǎng)方案可以有效誘導(dǎo)小鼠imDC定向分化。

IL-12對DC的發(fā)育成熟及功能發(fā)揮關(guān)鍵作用。imDCs能分泌少量IL-12，DC在成熟過程中會大量分泌IL-12。有研究認(rèn)為，LPS可以刺激DC成熟，誘導(dǎo)DC分泌IL-12，并上調(diào)IL-10和TNF-α的分泌[16]。本研究表明，LPS與TNF-α在刺激DC成熟上有協(xié)同作用，LPS刺激后imDC和mDC所分泌的細(xì)胞因子量存在顯著差異，可利用這一點進(jìn)行DC功能鑒定。

綜上所述，本研究證明，使用特定的細(xì)胞因子組合方案可以有效誘導(dǎo)小鼠骨髓HSC向DC定向分化，并可以較精確地控制DC的成熟度。小鼠mDC及imDC在細(xì)胞形態(tài)、表面標(biāo)志物、功能及LPS刺激后細(xì)胞因子分泌量方面存在顯著差異，利用這些指標(biāo)可以鑒定DC的成熟度。本研究成功建立了一套自GD模型動物雌性BALB/C小鼠中長期穩(wěn)定地獲得DC特別是imDC并對其進(jìn)行鑒定的有效方法，為誘導(dǎo)小鼠免疫耐受預(yù)防甲狀腺功能亢進(jìn)癥的實驗研究提供了必要的實驗基礎(chǔ)。