徐世浩，孟凡旭，趙宏光，徐波，張學(xué)敏，劉景玲，梁宗鎖，4，5*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.陜西天士力植物藥業(yè)股份有限公司，陜西 商洛726000；3.天津天士力現(xiàn)代中藥資源有限公司，天津300410；4.天津市現(xiàn)代中藥資源研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300410；5.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州3100384）

決明子為中醫(yī)藥臨床中常使用的原料之一，是豆科植物決明（Cassia obtrusively L.）或者小決明（Cassia tera L.）的干燥成熟種子，其味苦，性微寒，可潤(rùn)腸通便，降脂明目［1，2］。決明種子的藥用成分主要是橙黃決明素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等蒽醌類(lèi)物質(zhì)［3，4］。在我國(guó)決明的種植范圍廣，但不同產(chǎn)地的決明種子中蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量差異較大［5］，且市售決明種子中蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量不能滿足生產(chǎn)的需要，因而培育有效成分含量高的決明新品種顯得格外重要。太空誘變技術(shù)與普通誘變處理相比具有變異率高、周期短的特點(diǎn)［6］，因而成為選育決明優(yōu)良品種的重要技術(shù)手段。農(nóng)藝性狀與植物內(nèi)在的生理生化特征息息相關(guān)且便于觀察測(cè)量，是植物種質(zhì)資源評(píng)價(jià)的重要措施之一［7］。本試驗(yàn)以太空誘變技術(shù)處理的決明種子為材料，基于農(nóng)藝性狀及其種子中蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量等指標(biāo)，探討決明主要農(nóng)藝性狀與其種子中蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量之間的關(guān)系，以期為進(jìn)一步篩選優(yōu)良品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

決明種子由商洛天士力植物藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)浙江理工大學(xué)鑒定為決明種子。將決明種子分為兩份，一份進(jìn)行太空搭載試驗(yàn)（SP），一份留作地面對(duì)照（CK）。經(jīng)過(guò)7 代的田間培育，得到4份優(yōu)質(zhì)種子，分別 記為Y3、Y4、Y5、Y6，與對(duì)照（CK）一同于2019 年4 月初種植于陜西省商洛市天 士 力 藥源 基 地（北 緯33°51′38.42″東 經(jīng)109°53′31.56″）［8］。行距60 cm，株距45 cm，田間管理參照尚文艷等［9］和詹杰等［10］的方法。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：Waters2996 高效液相色譜儀、Empower2 色譜工作站、Waters PAD 檢 測(cè)器、Waters Sunfire c18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、超聲提取器、恒溫水浴鍋、優(yōu)普超純水機(jī)。主要試劑：色譜級(jí)甲醇、乙醇、乙腈、磷酸，購(gòu)自西安試劑廠；橙黃決明素（6797925-3，純度99.3%）、大黃酚（481-74-3，純度98.83%）、蘆薈大黃素（481-72-1，純度98.43%）、大黃素甲醚（521-61-9，純度99.5%）等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；硫酸、濃鹽酸、三氯甲烷、甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯等分析純?cè)噭┵?gòu)自三力化玻站。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀指標(biāo)的測(cè)定

2019 年9 月底，分別在每個(gè)決明品系中隨機(jī)取10 株進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)包括株高（地面至植株頂端的絕對(duì)高度）、莖粗（距地面5 cm處，南北向及東西向直徑測(cè)量3 次后取平均值）、分枝數(shù)（從基部開(kāi)始生于主莖四周的分枝數(shù)量）、冠幅（用鋼尺測(cè)量植株?yáng)|西向、南北向兩個(gè)維度長(zhǎng)度，測(cè)量3 次，取平均值）、葉面積（用葉面積儀測(cè)量同一部位10 片葉子取平均值）、結(jié)莢數(shù)（對(duì)長(zhǎng)度大于5 cm 的莢果進(jìn)行計(jì)數(shù)）、鮮質(zhì)量（整株連根拔起，去掉泥土立即稱(chēng)重）、干質(zhì)量（各株在同一條件下晾干至恒重后稱(chēng)重）、種子千粒質(zhì)量（隨機(jī)數(shù)出3 個(gè)一千粒種子，分別稱(chēng)重，求其平均值）及含水量（干燥前供檢種子質(zhì)量減去干燥后供檢種子質(zhì)量的差值占干燥前供檢種子質(zhì)量百分比）等。

1.3.2 決明種子中4 種蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定

樣品溶液制備參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 版一部）［11］中決明種子中有效成分提取的方法進(jìn)行。參照孟凡旭［12］的實(shí)驗(yàn)條件并做部分修改后，測(cè)量決明種子中橙黃決明素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等4 種蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量。色譜條件為：色譜柱Sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。以乙腈為流動(dòng)相A，以體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～15 min，40%A；15～30 min，40%～90%A；30～45 min，90%A）。檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS20.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 決明主要農(nóng)藝性狀指標(biāo)及蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量多重比較

不同品系決明的各項(xiàng)農(nóng)藝性狀指標(biāo)及蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量均存在不同程度的差異（表1）。Y5 單株株高、分枝數(shù)、葉面積、結(jié)莢數(shù)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、種子千粒質(zhì)量、種子含水量均值最大，其中Y5 的株高、結(jié)莢數(shù)、種子千粒質(zhì)量顯著高于其它品系及對(duì)照，說(shuō)明Y5 的多數(shù)農(nóng)藝性狀指標(biāo)表現(xiàn)較為突出，且具有株型高、結(jié)莢多、種子千粒質(zhì)量高的特點(diǎn)；Y6 單株莖粗、冠幅均值最大，其中Y6 的冠幅顯著高于其他品系及對(duì)照，說(shuō)明Y6 具有大冠幅的特點(diǎn)；在四種蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量方面，誘變品系的橙黃決明素含量、蘆薈大黃素含量、大黃素甲醚含量均顯著高于對(duì)照組，Y3、Y5 的大黃酚含量顯著高于Y4、Y6 及對(duì)照組，其中Y3 的橙黃決明素含量、大黃酚含量最高，Y6 的大黃素甲醚含量、蘆薈大黃素含量最高，說(shuō)明Y3、Y6 在蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量上具有優(yōu)勢(shì)。

2.2 決明主要農(nóng)藝性狀指標(biāo)及種子中4 種蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量的變異系數(shù)分析

誘變后決明的農(nóng)藝性狀及4 種蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量出現(xiàn)了較大的變異（表2），變異系數(shù)由大到小依次為蘆薈大黃素含量＞大黃酚含量＞橙黃決明素含量＞莖粗＞分枝數(shù)＞結(jié)莢數(shù)＞葉面積＞大黃素甲醚＞冠幅＞鮮質(zhì)量＞株高＞干質(zhì)量＞千粒質(zhì)量＞種子含水量?？梢钥闯觯瑳Q明的冠幅、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、株高、千粒質(zhì)量、種子含水量變異系數(shù)均低于10%，蘆薈大黃素含量、大黃酚含量的變異系數(shù)均較大，接近30%，而橙黃決明素含量、莖粗、分枝數(shù)、結(jié)莢數(shù)、葉面積、大黃素甲醚含量的變異系數(shù)介于兩者之間，表明供試材料的多項(xiàng)指標(biāo)均出現(xiàn)了豐富的變異，其中以大黃酚、蘆薈大黃素含量這兩項(xiàng)指標(biāo)的變異最為豐富。

2.3 決明主要農(nóng)藝性狀指標(biāo)及其與種子中蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量相關(guān)性分析

決明主要農(nóng)藝性狀及其與種子中蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量的相關(guān)性分析（表3）表明：相關(guān)性分析中共有44 對(duì)指標(biāo)極顯著相關(guān)，16 對(duì)指標(biāo)顯著相關(guān)。其中鮮質(zhì)量與橙黃決明素含量呈極顯著正相關(guān)，株高、干質(zhì)量、種子含水量與橙黃決明素含量呈顯著正相關(guān)；冠幅與大黃酚含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，鮮質(zhì)量與大黃酚含量呈顯著正相關(guān)；蘆薈大黃素含量與株高、冠幅、分枝、葉面積、結(jié)莢數(shù)、鮮質(zhì)量、橙黃決明素含量呈極顯著正相關(guān)，與大黃酚含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與莖粗、鮮質(zhì)量、種子含水量呈顯著正相關(guān)；冠幅與大黃素甲醚含量呈極顯著正相關(guān)，分枝數(shù)、葉面積、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量與大黃素甲醚含量呈顯著正相關(guān)；4 種蒽醌類(lèi)物質(zhì)之間有一定的制約關(guān)系，橙黃決明素含量與蘆薈大黃素含量、大黃素甲醚含量程極顯著正相關(guān)；大黃酚與蘆薈大黃素含量、大黃素甲醚含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；大黃素甲醚含量與橙黃決明素含量、蘆薈大黃素含量呈極顯著正相關(guān)?？梢钥闯?，鮮質(zhì)量高的材料其種子中4 種蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量一般較高；冠幅較大的材料，其大黃酚含量一般較低；橙黃決明素含量高的材料，其蘆薈大黃素含量、大黃素甲醚含量較高，但大黃酚含量的提高可能會(huì)導(dǎo)致蘆薈大黃素含量的明顯降低。

表1 決明主要農(nóng)藝性狀及4 種蒽醌類(lèi)成分含量多重比較Table 1 Multiple comparisons of the main agronomic traits of Cassia obtrusively L.and the contents of four anthraquinones

表2 決明主要農(nóng)藝性狀及四種蒽醌類(lèi)成分含量的變異系數(shù)分析Table 2 Analysis of variation coefficients of main agronomic characters of Cassia obtrusively L.and contents of four anthraquinones

表3 決明主要農(nóng)藝性狀及其與種子中4 種蒽醌類(lèi)成分含量的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of the main agronomic characters of Cassia obtrusively L.and the content of four anthraquinones

2.4 決明主要農(nóng)藝性狀指標(biāo)及4 種蒽醌類(lèi)成分含量的主成分分析

為了更充分的反映出決明的各項(xiàng)指標(biāo)中起主導(dǎo)作用綜合指標(biāo)，對(duì)決明的主要農(nóng)藝性狀指標(biāo)和種子中4 種蒽醌類(lèi)成分含量進(jìn)行主成分分析。結(jié)果（表4）表明，前4 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為82.609%，說(shuō)明前4 個(gè)主成分已基本包含了決明性狀的全部信息，可用前4 個(gè)成分對(duì)其進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

第一主成分的特征值是5.684，貢獻(xiàn)率為40.598%，決定第一主成分的指標(biāo)主要是莖粗、冠幅、分枝數(shù)、葉面積，其載荷值均為正值，可作為表型因子。但株高、鮮質(zhì)量、千粒質(zhì)量、種子含水量、橙黃決明素含量、大黃酚含量、大黃素甲醚含量等的特征向量為負(fù)，因此追求粗莖、大冠幅、多分枝數(shù)、大葉面積等指標(biāo)不利于蒽醌類(lèi)含量的提高。因此，第一主成分偏低較好。

第二主成分的特征值為2.499，貢獻(xiàn)率為17.85%，決定第二主成分的主要指標(biāo)是種子的千粒質(zhì)量和含水量，可作為種子因子；其對(duì)應(yīng)親本的千粒質(zhì)量大、種子含水量高、株高較高、橙黃決明素含量及大黃酚含量較高。因此在選育橙黃決明素、大黃酚含量高的決明品系時(shí)，第二主成分應(yīng)適中偏高。

第三主成分特征值是2.107，貢獻(xiàn)率為15.047%，第三主成分指標(biāo)主要是橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚，可作成分因子；其對(duì)應(yīng)親本的橙黃決明素含量、蘆薈大黃素含量、大黃素甲醚含量較高，大黃酚含量較低，但以橙黃決明素含量、大黃酚含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，第三主成分應(yīng)適中。

第四主成分特征值是1.276，貢獻(xiàn)率為9.114%，對(duì)應(yīng)的特征向量從大到小依次為：干質(zhì)量、鮮質(zhì)量、大黃酚含量、分枝數(shù)、莖粗，因此稱(chēng)第四主成分為質(zhì)量因子。其對(duì)應(yīng)親本的莖粗較粗、分枝數(shù)較多、大黃酚含量較高、干質(zhì)量及鮮質(zhì)量較大，有利于提高產(chǎn)量及大黃酚含量，因此第四主成分應(yīng)偏大。

表4 決明主要農(nóng)藝性狀及4 種蒽醌類(lèi)成分含量的主成分分析Table 4 Principal component analysis of the main agronomic characters of Cassia obtrusively L.and the content of four anthraquinones

3 討論與結(jié)論

本研究表明，經(jīng)過(guò)太空搭載的決明后代中出現(xiàn)了豐富的變異，除Y3 的莖粗、冠幅，Y6 的千粒質(zhì)量、大黃酚含量低于對(duì)照外，各品系指標(biāo)均高于對(duì)照，且株高、分枝數(shù)、橙黃決明素含量、蘆薈大黃素含量、大黃素甲醚含量、種子含水量均表現(xiàn)為航天誘變品系顯著高于對(duì)照，且不同品系之間也存在差異。相關(guān)研究結(jié)果表明太空搭載能夠顯著提高植物后代的變異率，從而提供豐富的育種材料，是品種選育重要措施之一［13～18］。豐富的變異材料將有助于新品種的選育，而航空誘變?yōu)闆Q明新品系的選育提供豐富的育種材料，這將加快決明新品種選育的進(jìn)程。

通過(guò)對(duì)5 批決明的主要農(nóng)藝性狀及種子中4種蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量進(jìn)行變異系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，變異系數(shù)最大的是蘆薈大黃素含量、大黃酚含量，其變異系數(shù)均接近30%；莖粗、分枝數(shù)、葉面積、結(jié)莢數(shù)、橙黃決明素含量、大黃素甲醚含量的變異系數(shù)較高，在13%左右。在育種研究中，變異系數(shù)是衡量資料中觀測(cè)值變異范圍及變異程度的量，變異系數(shù)越大，表明遺傳多樣性越豐富，選擇的潛力更大［7，19，20］。因此經(jīng)過(guò)太空搭載后，決明品系出現(xiàn)豐富的遺傳多樣性，有利于從中篩選蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量高的決明新品系。

相關(guān)性分析表明：決明鮮質(zhì)量與橙黃決明素含量呈極顯著正相關(guān)，株高、干質(zhì)量、種子含水量與橙黃決明素含量呈顯著正相關(guān)；冠幅與大黃酚含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，鮮質(zhì)量與大黃酚含量呈顯著正相關(guān)；4 種有效成分之間，蘆薈大黃素含量與橙黃決明素含量呈極顯著正相關(guān)；大黃素甲醚與橙黃決明素、蘆薈大黃素呈極顯著正相關(guān)，大黃酚與蘆薈大黃素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。章明敏［21］、李金金等［22］研究認(rèn)為株高與橙黃決明素含量存在顯著正相關(guān)關(guān)系，與本研究結(jié)論一致。曹麗娟等［23］認(rèn)為僅以橙黃決明素、大黃酚含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)不能充分反映決明種子質(zhì)量，因此本研究增加了蘆薈大黃素、大黃素甲醚含量的測(cè)定，補(bǔ)充了章明敏［21］、李金金等［22］研究中的不足，并從中發(fā)現(xiàn)了影響蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量的多項(xiàng)指標(biāo)及4 種蒽醌類(lèi)物質(zhì)之間可能存在的制約關(guān)系，這將有助于推進(jìn)決明新品種的選育，但該規(guī)律是否適用于其他產(chǎn)地的普通決明還有待進(jìn)一步的研究。

主成分分析能夠?qū)Χ嘟M數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，是一種有效的綜合評(píng)價(jià)方法，在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)等諸多方面有著廣泛的應(yīng)用［24～26］。在新品種選育過(guò)程中，由于性狀指標(biāo)多、待選群體大且各項(xiàng)指標(biāo)間存在著許多有利和不利的相關(guān)性，如果僅僅依靠表型直觀評(píng)選，就會(huì)增加誤判的概率，也將影響育種工作的進(jìn)展。通過(guò)主成分分析，能夠?qū)Q明的14 項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為較少的幾個(gè)主成分。由于這4 個(gè)主成分提供了原性狀82.609%的信息，且是綜合的、相對(duì)獨(dú)立的指標(biāo)體系，因此將主成分分析用于決明農(nóng)各項(xiàng)指標(biāo)的評(píng)價(jià)和篩選，既能體現(xiàn)其綜合表現(xiàn)，又能降低選育難度，且具有科學(xué)性。本研究結(jié)果表明，為篩選出表現(xiàn)優(yōu)良的決明新品系，應(yīng)按照第一主成分應(yīng)偏低、第二主成分適中偏高、第三主成分適中、第四主成分偏大的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行選育。

培育優(yōu)良品種是我國(guó)藥用植物栽培的先決條件［27］，農(nóng)藝性狀的篩選是優(yōu)良品種的選育過(guò)程中最直觀的手段，其中成分含量往往是中藥材育種中必然要考慮的因素［28］。本研究通過(guò)多重比較及變異系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，航天誘變使決明不同品系的出現(xiàn)差異，且以蘆薈大黃素、大黃酚的變異最為豐富，這將為解決決明種子中蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量不足的難題提供了可能。本研究通過(guò)相關(guān)性分析找到了與決明種子中蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量相關(guān)的性狀指標(biāo)，又進(jìn)一步通過(guò)主成分分析將決明的各項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為較少的幾個(gè)主成分，這將為決明的良種選育提供有益的參考，并將進(jìn)一步加快育種進(jìn)程。

本研究通表明：航天誘變的決明各性狀間存在豐富的變異，增加了決明的遺傳多樣性，使針對(duì)性的育種成為可能；利用相關(guān)性分析、主成分分析的方法可以按照育種要求對(duì)各指標(biāo)、各主成分進(jìn)行單獨(dú)選擇，為后期篩選高蒽醌類(lèi)物質(zhì)含量的決明新品種提供理論依據(jù)。

本研究對(duì)誘變決明的農(nóng)藝性狀及有效成分含量進(jìn)行了初步的分析，為后續(xù)的優(yōu)良品系選用提供了一定的參考，但對(duì)于誘變材料在基因?qū)用娴淖儺愡€未進(jìn)行深入研究，有待后續(xù)基因?qū)用娴耐诰驅(qū)⑦M(jìn)一步加快優(yōu)質(zhì)品系的選育。