李榮榮，李敏，劉麗潔，徐喆，張虎芳

（1.太原師范學(xué)院，山西 晉中030619；2.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安71011；3.忻州師范學(xué)院，山西 忻州034000）

昆蟲是世界上種類最為繁多的動(dòng)物類群［1］，在昆蟲體內(nèi)通常存在多種微生物，在與宿主持久共同的進(jìn)化過程當(dāng)中構(gòu)成了相互依存、不可分割的共生關(guān)系［2，3］。這些微生物可以定植在昆蟲的腸道、血淋巴、生殖系統(tǒng)等組織結(jié)構(gòu)中，在宿主營養(yǎng)物質(zhì)的攝取、有害物質(zhì)的代謝等諸多生理功能中發(fā)揮重要的作用，進(jìn)而影響宿主的生長、發(fā)育、繁殖和免疫等［1，4］。近年來關(guān)于昆蟲微生物的研究越來越多，而利用高通量測序技術(shù)對昆蟲微生物多樣性的研究則是一個(gè)熱門領(lǐng)域，涉及到的昆蟲種類非常廣泛如鱗翅目、膜翅目、蜚蠊目、鞘翅目、直翅目等［5～9］。對于半翅目的蝽類昆蟲來說，國內(nèi)外對于共生菌的研究多集中于腸道優(yōu)勢菌的種類、親子代間的傳播方式及其與寄主的共同進(jìn)化關(guān)系等方面，使用的方法還主要依賴于傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)及基于16S rRNA 基因的PCR-DGGE 技術(shù)，使用高通量測序?qū)崿F(xiàn)昆蟲微生物組成和多樣性的研究相對 較少［10～12］。

柳膜肩網(wǎng)蝽（Hegesidemus habrusDrake）與懸鈴木方翅網(wǎng)蝽（Corythucha ciliateSay）均隸屬于半翅目Hemiptera，異翅亞目Heteroptera，網(wǎng)蝽科Tingidae。二者都是刺吸式口器，其中柳膜肩網(wǎng)蝽以吸取楊樹、柳樹等植物葉片的汁液為食，近幾年在山西省晉中市危害嚴(yán)重［13］。懸鈴木方翅網(wǎng)蝽以刺吸懸鈴木屬植物葉片汁液為食，是一種重要的林業(yè)危險(xiǎn)性入侵害蟲［14］。兩者均可通過吸食葉片汁液，導(dǎo)致葉片組織失水，使葉片表面產(chǎn)生成片的白色斑點(diǎn)，葉片背面則有許多深褐色黏液排泄物，嚴(yán)重影響寄生植物葉片的光合作用和呼吸作用［15～17］。我國對柳膜肩網(wǎng)蝽的研究很少，主要集中于柳膜肩網(wǎng)蝽的防治方面［13，15］；對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的研究主要集中于分類、入侵機(jī)理、生物學(xué)特性及防治［14，16～19］，兩者體內(nèi)微生物組成及功能方面還未有報(bào)道。

本試驗(yàn)以柳膜肩網(wǎng)蝽與懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲為研究對象，通過16S rRNA 高通量測序技術(shù)揭示柳膜肩網(wǎng)蝽和懸鈴木方翅網(wǎng)蝽體內(nèi)細(xì)菌組成及多樣性，旨在為其它蝽類昆蟲腸道微生物多樣性分析提供數(shù)據(jù)支持，也希望能為二者的防治提供一些理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018 年9 月分別于山西省晉中市榆次區(qū)龍湖街旁垂柳（Salix babylonica）及一球懸鈴木（Platanus occidentalis）上采集柳膜肩網(wǎng)蝽JH 和懸鈴木方翅網(wǎng)蝽JC 樣本；懸鈴木方翅網(wǎng)蝽LC 樣本于2018年10 月采自于臨汾市洪洞縣108 國道旁一球懸鈴木。

1.2 試蟲處理

取柳膜肩網(wǎng)蝽與不同地理位點(diǎn)的懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲各30 頭，饑餓處理6 h，隨后在超凈工作臺(tái)采取75%的酒精對蟲體表面消毒3 次，每次3 min，再用無菌水清洗5 遍。將2 種成蟲各分為3組，每組10 頭，分別裝入2 mL 已滅菌的離心管中，置于-70 ℃冰箱中備用。按照Mag-bind soil DNA提取試劑盒（Omega，Norcross，GA，美國）說明書分別提取處理后的柳膜肩網(wǎng)蝽和懸鈴木方翅網(wǎng)蝽總DNA。使用NanoDropND-1000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，美國）紅外線分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測DNA 濃度和質(zhì)量。

1.3 16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增和高通量測序

使用通用引物 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）及 806R（5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′）對 細(xì) 菌16S 的V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增［20］。擴(kuò)增體系共25 μL，包括：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，引物338F/806R（10 μM）各1 μL，DNA 模板3 μL，Q5 DNA 聚合酶0.25 μL，ddH2O 7.75 μL。PCR 擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)25次之后72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep（Axygen，Silicon Valley，美國）凝膠抽提試劑盒將目標(biāo)片段回收。純化后的合格PCR 產(chǎn)物送往上海派森諾生物科技有限公司，采用Illumina MiSeq 測序平臺(tái)進(jìn)行雙端測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

MiSeq 測序完成后，應(yīng)用QIIME v1.8.0 軟件處理下機(jī)數(shù)據(jù)［21］。首先對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量篩查，去除包括堿基平均質(zhì)量＜Q20，序列長度＜100 bp，包含模糊堿基及單核苷酸重復(fù)＞8 bp的低質(zhì)量序列。使用Flash v1.2.11［22］軟件對通過初篩的序列進(jìn)行配對拼接，隨后調(diào)用USEARCH v5.2.236 檢查并剔除嵌合體序列，最后得到高質(zhì)量 序 列。在QIIME 軟 件中調(diào)用UCLUST［23］對有效序列按97% 的序列相似度進(jìn)行聚類并進(jìn)行OTU（Operational Taxonomic Unit，可操作分類單元）劃分。使用best hit［24］依 據(jù)Greengenes 數(shù) 據(jù)庫［25］對擴(kuò)增所得的細(xì)菌16S rRNA 進(jìn)行物種注釋。去除豐度低于全體樣本測序總量十萬分之一（0.001%）的OTU［26］得到稀有OTU 矩陣。使用QIIME 軟件繪制稀疏曲線（Rarefaction curve），計(jì)算可以反映樣品群落豐度的Chao1 和ACE 指數(shù)，以及反映樣品中物種多樣性的Shannon 和Simpson 指數(shù)。使用美吉云平臺(tái)（https：//cloud.majorbio.com/）和Heml v1.0［27］分別進(jìn)行組間差異分析和熱圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)和聚類分析

本研究所選用的9 個(gè)樣品共測得396 393 條原始序列，長度分布在152～469 bp 范圍內(nèi)，最多的序列長度為430 bp（150 222 條），所測得序列平均長度421 bp。

柳膜肩網(wǎng)蝽16S rRNA 高通量測序最終獲得原始序列162 691 條，質(zhì)控后的有效序列147 376條（表1）。JH1、JH2 和JH3 樣本對應(yīng)的有效序列分別為49 124、43 280 和54 972 條。去除掉豐度值低于全體樣本測序總量0.001%的OTU 后，分別得到1 015、1 050、1 250 條OTU 序列。

懸鈴木方翅網(wǎng)蝽高通量測序獲得原始序列233 702 條，有效序列218 771 條（表1）。JC1、JC2和JC3 樣品對應(yīng)的有效序列分別為38 023、36 138、36 299，LC1、LC2 和LC3 樣品對應(yīng)的有效序列分別為37 657、35 388、35 266。去除掉豐度值低于全體樣本測序總量0.001%的OUT 后，分別得到583、604、753、620、581、482 個(gè)OTU 序列。

表1 細(xì)菌16S rRNA 基因高通量測序概況Table 1 Summary of 16S rRNA gene high-throughput sequencing data

2.2 Alpha 多樣性分析

所有9 個(gè)樣品的稀疏曲線顯示在97%相似性水平下（圖1），16S rRNA 高通量測序的稀疏曲線逐漸趨于平坦，這說明每個(gè)樣本的測序量充足，測序深度可以基本覆蓋樣本中全部微生物種類。Chao1和ACE 指數(shù)顯示，柳膜肩網(wǎng)蝽樣品群落豐富度明顯高于懸鈴木方翅網(wǎng)蝽（JH vs JC，P=0.02；JH vs LC，P=0.01）。柳膜肩網(wǎng)蝽的3 個(gè)樣本中JH3 樣本群落豐富度最高，懸鈴木方翅網(wǎng)蝽JC 的3 個(gè)樣本中JC3 樣本群落豐富度最高，LC 樣本中LC1 群落豐富度最高。Shannon 和Simpson 指數(shù)顯示：柳膜肩網(wǎng)蝽和懸鈴木樣本微生物物種多樣性無顯著差異（P＞0.05）。柳膜肩網(wǎng)蝽的3 個(gè)樣本中JH2 樣本群落多樣性最高，懸鈴木方翅網(wǎng)蝽JC 的3 個(gè)樣本中JC1 樣本群落多樣性最高，LC 樣本中LC1 群落多樣性最高（表2）。

圖1 OTU 數(shù)的稀疏曲線圖Fig.1 Rarefaction curve of OTUs

2.3 柳膜肩網(wǎng)蝽與懸鈴木方翅網(wǎng)蝽微生物組成及其豐度分析

在門分類階元水平，柳膜肩網(wǎng)蝽和懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的各組樣品都擁有變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、棲熱菌門（Thermi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和藍(lán)藻門（Cyanobacteria）（圖2A）。柳膜肩網(wǎng)蝽3 組樣品均以變形菌門（39.26%）、厚壁菌門（36.48%）和棲熱菌門（8.30%）為優(yōu)勢菌，3 者共占到總數(shù)的80%以上。懸鈴木方翅網(wǎng)蝽樣本的優(yōu)勢菌包括變形菌門（39.60%）、棲熱菌門（43.7%）、擬桿菌門（24.67%）和厚壁菌門（Firmicutes）（10.00%），共占總數(shù)的90%以上。PCA 分析顯示，沿PC2 軸可以將柳膜肩網(wǎng)蝽樣品和懸鈴木方尺網(wǎng)蝽樣品明顯區(qū)分，說明二者的群落結(jié)構(gòu)有明顯差異（圖2B）。懸鈴木方翅網(wǎng)蝽JC 和LC 樣本相比較，LC 樣本的變形菌門顯著增加，藍(lán)藻門則顯著減少。兩者的豐度在JC 和LC 樣本間存在顯著的差異（Welch′s t-test，變形菌門P=0.03，藍(lán)藻門P=0.02）。

去除掉豐度小于1%的OTU 后，柳膜肩網(wǎng)蝽和懸鈴木方翅網(wǎng)蝽樣本共找到9 個(gè)核心屬（表3）。其中厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillus）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、棲熱菌屬（Thermus）、沃爾巴克氏體（Wolbachia）在柳膜肩網(wǎng)蝽樣品中豐度較高（圖3）。而厭氧芽孢桿菌屬、“CandidatusCardinium”、乳球菌屬（Lactococcus）、蒼白桿菌屬、沙雷氏菌屬（Serratia）及棲熱菌屬在懸鈴木方翅網(wǎng)蝽樣品中含量較高（圖3）。懸鈴木方尺網(wǎng)蝽核心屬在JC 樣本和LC 樣本間不存在顯著差異（Welch′s t-test，P＞0.05）。

表2 細(xì)菌多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Diversity indices of bacteria

圖2 柳膜肩網(wǎng)蝽與懸鈴木方翅網(wǎng)蝽微生物組成分析Fig.2 Community structure analysis of Hegesidemus habrus and Corythucha ciliate

3 討論與結(jié)論

昆蟲體內(nèi)棲居著種類繁多的微生物，它們影響著昆蟲的營養(yǎng)、防御、生殖等方面，在昆蟲生態(tài)和進(jìn)化過程中起著非常重要的作用［4，28］。與所有的昆蟲一樣，蝽類昆蟲體內(nèi)也棲居著多種多樣的微生物［2］?；?6S rRNA 高通量測序技術(shù)的研究結(jié)果表明，柳膜肩網(wǎng)蝽和懸鈴木方翅網(wǎng)蝽體內(nèi)微生物種類豐富多樣，二者在門水平的種類組成相似（都包括變形菌門、厚壁菌門、棲熱菌門、擬桿菌門、放線菌門及藍(lán)藻門），但豐度差異較大，PCA 分析可以明顯將兩者區(qū)分開，這說明網(wǎng)蝽科昆蟲體內(nèi)微生物組成具有一定的特異性。懸鈴木方翅網(wǎng)蝽JC 樣本和LC樣本在門水平存在顯著豐度差異，但核心屬不存在顯著差異，這說明同一物種不同地理種群間核心屬的種類和豐度相對穩(wěn)定。

在屬級水平兩者間的優(yōu)勢菌有明顯區(qū)別，厭氧芽孢桿菌屬、蒼白桿菌屬、棲熱菌屬、沃爾巴克氏體在柳膜肩網(wǎng)蝽樣品中豐度較高（圖3）。而厭氧芽孢桿菌屬、“CandidatusCardinium”、乳球菌屬、蒼白桿菌屬、沙雷氏菌屬（Serratia）及棲熱菌屬在懸鈴木方翅網(wǎng)蝽樣品中含量較高。通過對比發(fā)現(xiàn)棲熱菌屬是二者體內(nèi)共同的優(yōu)勢菌，其在所有的9 個(gè)樣本中豐度值均超過2%，在JC2 樣本中最高（51.37%）。早期基于細(xì)菌16S rRNA 基因全長測序的研究表明不同蝽類昆蟲的體內(nèi)棲居的共生菌并不相同，如龜蝽科、同蝽科、異蝽科和蝽科昆蟲多與γ-變形桿菌（γ-Proteobacteria）共生；而緣蝽科、長蝽科昆蟲多與β - 變形桿菌中的伯克氏菌（Burkholderia）共生［29～31］。柳膜肩網(wǎng)蝽和懸鈴木方翅網(wǎng)蝽同屬半翅目異翅亞目網(wǎng)蝽科，二者體內(nèi)均共棲著大量棲熱菌屬（Thermus）微生物，這或許表明棲熱菌屬可能是網(wǎng)蝽科昆蟲體內(nèi)普遍存在的共生菌。但目前為止，網(wǎng)蝽科昆蟲微生物多樣性的研究還未見報(bào)道，這一結(jié)論還需更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。

圖3 懸鈴木方翅網(wǎng)蝽和柳膜肩網(wǎng)蝽核心屬相對豐度熱圖Fig.3 Relative abundance of the core genera in Hegesidemus habrus and Corythucha ciliate

表3 相對豐度＞1%的核心OUT 和其對應(yīng)的屬級分類Table 3 Bacteria taxonomy and relative abundance of bacterial OTUs higher than 1%

沃爾巴克氏體（Wolbachia）屬于α-Proteobacteria，是一種常見的昆蟲細(xì)胞內(nèi)共生革蘭氏陰性菌，可在鞘翅目、雙翅目、同翅目、膜翅目、鱗翅目等10多個(gè)目的昆蟲體內(nèi)共生［32］。沃爾巴克氏體主要存在于昆蟲的生殖組織細(xì)胞中，比如精巢和卵巢，尤其在卵細(xì)胞中的豐度最高［33］。在長期的進(jìn)化過程中，沃爾巴克氏體形成了可以通過誘導(dǎo)胞質(zhì)不親和、孤雌生殖、殺雄等機(jī)制來對宿主的生殖實(shí)現(xiàn)調(diào)控作用，除此之外，它還可以幫助宿主增強(qiáng)抗性、調(diào)控宿主的其它生命活動(dòng)并影響其物種形成和進(jìn)化［34，35］。正因如此，沃爾巴克氏體已被探究應(yīng)用于白蚊、伊蚊等媒介昆蟲的種群數(shù)量控制，從而實(shí)現(xiàn)蟲媒病的控制［36，37］。在一些農(nóng)業(yè)害蟲如蚜蟲、果蠅等都也都檢測出很高的沃爾巴克氏體感染率，而且不同地理種群間其株系間的差異較大。本研究中，沃爾巴克氏體在柳膜肩網(wǎng)蝽體內(nèi)豐度較高，說明自然狀態(tài)下柳膜肩網(wǎng)蝽感染率較高。而懸鈴木方翅網(wǎng)蝽樣本中僅LC1 樣本檢測出沃爾巴克氏體感染，這說明自然狀態(tài)下懸鈴木方翅網(wǎng)蝽可以感染沃爾巴克氏體，但感染率并不高。

雖然如此，我們在懸鈴木方翅網(wǎng)蝽樣本中發(fā)現(xiàn)了另外一種重要的次級內(nèi)共生菌“CandidatusCardinium hertigii”，簡稱“Cardinium”。Cardinium在昆蟲體內(nèi)分布沒有沃爾巴克氏體那么廣泛，首次被發(fā)現(xiàn)是在寄生蜂體內(nèi)，可以引起寄主雌性化、誘導(dǎo)孤雌生殖、胞質(zhì)不親和等［38，39］。此外，它還可以引起螨類的生殖異常、降低煙粉虱的適合度并影響其取食 行 為［40，41］。本 研 究 中 無 論 是JC 樣 本 還 是LC 樣本，都具有較高的Cardinium感染率。目前關(guān)于柳膜肩網(wǎng)蝽和懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的防治大多以化學(xué)防治手段為主。Wolbachia和Cardinium的發(fā)現(xiàn)或許可以給柳膜肩網(wǎng)蝽和懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的防治提供新思路。

綜上所述，本研究首次使用16S rRNA 高通量測序技術(shù)對網(wǎng)蝽科昆蟲體內(nèi)微生物進(jìn)行研究。研究發(fā)現(xiàn)2 種網(wǎng)蝽體內(nèi)微生物組成差異明顯，但也有一些共有的核心菌群。沃爾巴克氏體和Cardinium分別在柳膜肩網(wǎng)蝽與懸鈴木方翅網(wǎng)蝽樣本中發(fā)現(xiàn)，它們與宿主的進(jìn)化關(guān)系如何，是否能對宿主生殖進(jìn)行調(diào)控都值得進(jìn)一步研究。