郭詠梅，段旭東，白健君，王軍娥

（山西農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，山西 太谷030801；山西省設施蔬菜提質增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 太谷030801）

觀賞辣椒（Capsicum frutescensvar.fasciculatum），茄科（Solanaceae）辣椒屬（CapsicumLinn.），是典型的觀果類蔬菜，具有極高的觀賞價值，其果型奇特，果色豐富，更具有適應性強、易栽培、美化環(huán)境、凈化空氣等特點，受到廣大園林工作者以及消費者的喜愛。目前，觀賞辣椒在花壇，花境，以及家庭園藝中廣泛應用［1］。

辣椒已被證實含有大量有益于人類身體健康的物質，包括辣椒素、類胡蘿卜素、維生素C、類黃酮等［2］。紫色觀賞辣椒色彩鮮艷，且無毒可食用，富含花青素。花青素是類黃酮物質的衍生物之一，是一種典型水溶性色素物質［3］。辣椒中主要的花青素物質為飛燕草素-3-反式香蕓豆素-葡萄糖苷和飛燕草素-3-順式香蕓豆素-葡萄糖苷［4］。研究發(fā)現(xiàn)，花青素的生物合成開始于苯丙酸途徑，隨后是類黃酮途徑，共有12 類結構基因和3 類轉錄調控基因參與了該途徑［5，6］。人們利用花青素強抗氧化性的特性，廣泛用于藥品和保健品的加工生產(chǎn)，充分發(fā)揮其抗癌、消炎、降血脂、延緩衰老等作用［7］。花青素的提取方法主要有有機溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、水溶液提取法、酶提取法、發(fā)酵提取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、高壓脈沖電場輔助提取法、液態(tài)靜高壓法輔助提取法［8，9］?；ㄇ嗨氐?分 析方法主 要 有單pH 法、pH示差法、紫外分光光度法、液相色譜法等。單pH法和紫外分光光度法難以排除其他雜質對花青素含量測定的影響，而液相色譜法費用較高，pH 示差法可以快速準確的確定花青素的含量［10］。

本研究采用響應面試驗法優(yōu)化紫色觀賞辣椒花青素的提取條件，篩選出最佳提取工藝和測定條件，比較獲得花青素含量較高的觀賞辣椒品種，明確果實色澤與花青素含量的相關性，為花青素的測定、高水平花青素積累的觀賞辣椒品種選育以及觀賞辣椒評價體系的建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以紫色觀賞辣椒品種M3、Q1、Q6 坐果期的果實為試材，進行花青素的提取工藝優(yōu)化以及pH 示差法測定條件的確定，并利用該優(yōu)化條件分析比較不同觀賞辣椒品種M3、M3’、Q1、Q2、Q3、Q4-2、Q4-3、Q6、W1、W8、WU 綠熟期果實的花青素含量。在坐果期和綠熟期采摘果實后，去除胎座和果梗部分，混合均勻保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 花青素的提取及定量分析

稱取0.5 g 不同品種紫色觀賞辣椒果皮，置于10 mL 浸提液中，超聲浸提30 min 后果皮呈無色，離心處理10 min，上清液為花青素待測液，用于花青素含量測定。

吸取2 mL 上清液，分別加入不同pH 的緩沖液定容至10 mL，在最適宜平衡溫度和平衡時間處理下，以蒸餾水作為空白對照，測定吸光度，根據(jù)公式計算觀賞辣椒果皮中花青素含量［10］。

M：矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2 g·moL-1；

DF：稀釋因子；

V：提取液總體積，mL；

m：重量，g；

ε：矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900 L·mol-1·cm-1；

L：光程，1 cm。

1.2.2 紫色觀賞辣椒花青素提取體系的優(yōu)化

（1）最大吸收波長的確定

以蒸餾水為對照，使用紫外分光光度計對花青素待測液在480～620 nm 范圍內進行光譜掃描，確定觀賞辣椒花青素的最大吸收波長。

（2）單因素試驗

稱取0.5 g 不同品種紫色觀賞辣椒果皮，置于10 mL 蒸 餾 水、丙 酮、1%HCl 甲 醇、1%HCl 乙 醇中，采用超聲波輔助法浸提，測定花青素最大吸收波長下的吸光值，篩選最佳提取試劑。

設計單因素試驗，以Q6 為試材，分析比較不同提取劑濃度、料液比、超聲時間對花青素的提取效果，根據(jù)試驗結果確定單因素的最佳條件。每個因素設置5 個水平，提取劑濃度為100%、90%、80%、70%、60%；料液比為1∶10 g·mL-1、1∶15 g·mL-1、1∶25 g·mL-1、1∶30 g·mL-1、1∶35 g·mL-1；超聲時間為10、20、30、40、50 min。

（3）響應面試驗

采用統(tǒng)計設計軟件Design Expert 8.0.5，綜合單因素試驗測定結果確定響應面水平（表1），并設計響應面試驗，以3 個主要因素提取劑濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為自變量，以花青素得率為響應值，以獲得最佳提取工藝條件。

表1 響應面中心組合設計試驗因素與水平編碼表Table 1 Factors and level codes for the center combination design test

1.2.3 紫色觀賞辣椒花青素測定條件的確定

（1）最佳pH 的確定

吸取2 mL 上清液，分別加入pH 為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 的緩沖液定容至10 mL，測定最大吸收波長下不同酸度緩沖液的吸光值，確定吸光值差異最大的2 個pH。

（2）最佳平衡時間的確定

將加入緩沖液的待測液，放入40 ℃的水浴鍋中分別平衡50、70、90、110、130 min 后定量分析比較不同品種的花青素含量，確定最佳平衡時間。

（3）最佳平衡溫度的確定

將加入緩沖液的待測液，分別放入20、30、40、50 ℃的平衡溫度下水浴，分析比較花青素含量，確定最佳平衡溫度。

1.2.4 回收試驗

采用2.2.1 的方法提取M3 和Q1 果皮中的花青素，離心后去除殘渣，將M3 的待測液稀釋一倍后，分2 份使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮干燥，其中一份加入5 mL 提取試劑溶解后作為標樣，一份加入5 mL Q1 待測液作為試樣加標樣，Q1 提取液作為試樣直接使用pH 示差法測定花青素含量，并計算分析回收試驗相對標準偏差（RSD%）和試驗加標回收率。

1.2.5 重復性考察

利用該試驗確定的條件測定M3 的花青素含量，重復測定7 次，計算RSD%。

1.2.6 不同品種觀賞辣椒花青素含量的測定

利用篩選出的優(yōu)化條件測定不同品種觀賞辣椒果實的花青素含量。

1.2.7 觀賞辣椒果實色差值的測定

使用CM-700D 色差儀（柯尼卡美能達，日本）測定不同品種觀賞辣椒果實的色差值。

1.3 數(shù)據(jù)的整理與分析

使用Excel 和GraphPad Prism 8.0.5 進行數(shù)據(jù)的整理與分析，使用GraphPad Prism 8.0.5 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 紫色觀賞辣椒花青素提取體系的優(yōu)化

2.1.1 最大吸收波長的確定

將用1%HCl 甲醇提取的花青素待測液進行光譜掃描，在480～620 nm 范圍內待測液光譜吸收值呈先上升后下降的趨勢，且在530 nm 處達到峰值，由此可得：紫色觀賞辣椒果實中花青素的最大吸收波長在530 nm。

2.1.2 最佳提取試劑的確定

通過對待測液在530 nm 處的吸光值測定，不同提取試劑的提取效果如圖1 所示：不同品種皆表現(xiàn)為1%HCl 甲醇提取效果最佳，其次為1%HCl乙醇、水，丙酮的提取效果最差。

2.1.3 不同提取劑濃度對花青素提取效果的影響

由2.1.2 試驗結果可知1%HCl 甲醇的提取效果最佳，故在提取劑濃度單因素試驗中，以不同濃度1%HCl 甲醇為提取劑，料液比1∶20 g·mL-1，超聲時間為30 min 進行試驗，花青素提取量如圖2 所示，可見不同濃度的1%HCl 甲醇提取劑提取效果存在顯著差異，當提取劑濃度為100%和90%時提取效果較好，且提取效果依次為100%＞90%＞60%＞80%＞70%。

圖1 不同提取試劑的提取效果Fig.1 Extraction capacity of different extraction reagents

圖2 不同提取劑濃度對花青素提取量的影響Fig.2 Effect of different extractant concentrations on anthocyanin extraction

2.1.4 不同料液比對花青素提取效果的影響

在料液比單因素試驗中，以100%甲醇（1%HCl）為提取劑，超聲提取30 min。試驗結果表明：隨著提取劑比例的增加，花青素的提取量呈先增加后下降的趨勢，且在料液比為1∶25 g·mL-1時到達峰值，繼續(xù)增大料液比，花青素含量則降低（圖3）。因此，在料液比單因素試驗中，料液比為1∶25時花青素的提取量最高，提取效果最佳。

2.1.5 不同提取時間對花青素提取效果的影響

以100%甲醇（1%HCl）為提取試劑，料液比為1∶20 g·mL-1，比較不同提取時間花青素的提取量（圖4）。隨著提取時間的增加，花青素逐漸析出，在40 min 后花青素含量趨于穩(wěn)定，此時花青素全部析出，且組織泛白。

2.1.6 響應面試驗

根據(jù)單因素試驗結果，確定響應面試驗各因素的3 個水平（表1），利用Design Expert 8.0.5 軟件設計響應面試驗，設計方案和結果如表2 所示，對表2 試驗結果進行多元擬合分析，得出以花青素得率為響應值的回歸方程：

圖3 不同料液比對花青素提取量的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on anthocyanin extraction

圖4 不同提取時間比對花青素提取量的影響Fig.4 Effect of extration time on anthocyanin extraction

表2 響應面設計方案及結果Table 2 Response surface plan and results

方差分析結果見表3，由ANVOA 分析可知：模型P=0.000 9＜0.001（極顯著），失擬項P=0.725 4＞0.05（不顯著），決定系數(shù)R2=0.949 8，表明回歸方程顯著，失擬項不顯著，響應面回歸方程的擬合度良好。從各因素的顯著性水平分析可知，對紫色觀賞辣椒中花青素得率的影響分別為：料液比（B）＞提取時間（C）＞甲醇濃度（A），且3 個因素對花青素得率的影響都達顯著水平（P＜0.05）；甲醇濃度、料液比、提取時間的二次項A2、B2、C2對花青素得率有極顯著（P＜0.01）的影響；各因素之間的交互項AB、BC、AC 影響不顯著。

根據(jù)上述方程得出的響應面及等高線結果見圖5～圖7。圖5 表示甲醇濃度和料液比的交互作用對花青素得率的影響，當甲醇濃度為95%～100%，料液比為1∶22～1∶26 g·mL-1時，花青素含量較高，且能達到最大值。當甲醇濃度為95%～100%，提取時間在35～45 min 范圍內時，花青素含量較高（圖6）。圖7 可看出料液比與提取時間對花青素得率的影響，在料液比為1∶22～1∶26 g·mL-1，提取時間為35～45 min 時可提高花青素的提取率。

表3 響應面回歸分析模型ANOVA 分析結果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

圖5 甲醇濃度（A）和料液比（B）對花青素含量影響的響應面分析Fig.5 Response surface analysis of the effects of methanol concentration and solid-liquid ratio on anthocyanin content

最終通過軟件Design-expert 8.0.5 軟件分析得出紫色觀賞辣椒花青素的最佳提取條件：當甲醇濃度為90%，料液比1∶25 g·mL-1，提取時間為40 min 時，花青素提取工藝較佳，預測值為10.06 mg·100g-1。以所得最佳提取條件進行3 次平行試驗，所得花青素含量平均值為10.15 mg·100g-1，與預測值相近，說明該條件下預測值與實際值擬合度良好，可靠性較高。

2.2 紫色觀賞辣椒中花青素測定條件的確定

2.2.1 最佳pH 的確定

在不同pH 緩沖液處理下，品種Q1、Q6 和M3的花青素吸光值隨著緩沖液酸度的減弱，整體呈先上升后下降的趨勢，所有紫色觀賞辣椒品種皆在pH 為1.0 時達峰值，在pH 為4.5 后趨于平緩或略微上升（圖8）。綜上所述，最佳的緩沖液pH 分別為1.0 和4.5。

圖6 甲醇濃度（A）和提取時間（C）對花青素含量影響的響應面分析Fig.6 Response surface analysis of the effects of methanol concentration and extraction time on anthocyanin content

圖7 料液比（B）和提取時間（C）對花青素含量影響的響應面分析Fig.7 Response surface analysis of the effects of solid-liquid ratio and extraction time on anthocyanin content

圖8 不同pH 緩沖液處理下花青素的吸收值Fig.8 OD values of anthocyanin under different pH

2.2.2 最佳平衡時間和平衡溫度的確定

在平衡溫度為40 ℃時，隨著平衡時間的延長，所有測定品種的花青素測定量逐漸增加，趨于穩(wěn)定，且在90 min 達到最大。在不同溫度處理下，花青素含量皆在40℃達到最大（圖9）。因此，在平衡溫度為40 ℃，平衡時間為90 min 時，花青素含量的測定值最穩(wěn)定。

2.3 回收試驗

為驗證篩選的最佳測定條件，即提取試劑為1%HCl 甲醇，料液比為1∶20，最大吸收波長為530 nm，pH 為1.0 和4.5，40℃平衡90 min，測定紫色觀賞辣椒果實中花青素含量，進行加標回收試驗，測定加標回收率，在該提取條件下回收率波動范圍不大，回收率平均值達0.992 3，且相對標準偏差較小，為0.89%。

2.4 重復性考察

對M3 的花青素含量重復測定7 次，看出ΔA值和花青素含量波動范圍較小，花青素含量在（12.298 0±0.16）mg·100g-1，RSD%為1.33%，在該工藝條件下，可以很好的排除其它雜質對花青素含量測定的影響。

2.5 不同品種觀賞辣椒果色分析

利用色差儀測定樣品的L*（明亮度）、a*（紅綠色度）、b*（黃藍色度）參數(shù)。由圖10、圖11 可見，不同品種的紫色觀賞辣椒L*參數(shù)皆為正數(shù)，且品種W1 和W8 的L*最大，其果色亮度最高；Q4-3 的a*為負值，其它品種的a*皆為正值，且Q1、Q2、Q4-2、Q6 的a*較?。黄贩NM3、Q1、Q2、Q4-2、WU 的b*為負值。

圖9 不同平衡時間、溫度對花青素含量的影響Fig.9 Effect of different balance time and temperature on anthocyanin content

2.6 不同品種紫色觀賞辣椒的花青素含量比較

不同品種觀賞辣椒的花青素含量存在明顯差異（圖12），品種Q2 的花青素含量最高，Q1、Q4-3、WU 之間花青素含量無顯著差異，且顯著高于其他品種，品種M3’、Q4-3、W1、W8 的花青素含量較低，M3’含量最低且顯著性低于其它品種。

圖10 不同品種觀賞辣椒果色Fig.10 Fruit color of different cultivar of ornamental pepper

2.7 紫色觀賞辣椒果色與花青素含量相關性分析

果色與花青素含量的相關性如表4 所示，花青素含量與色差參數(shù)都表現(xiàn)為負相關，且與L*、b*強相關，與a*基本無相關；L*與a*、b*都正相關，與b*為強相關（0.765 0），a*與b*之間呈弱的負相關。

3 討論

花青素是一類天然的色素物質，是植物體花朵、果實、葉片的著色劑，同時也有很強的藥用價值，被廣泛地用于醫(yī)療保健業(yè)。花青素的強吸收在紫外區(qū)域與可見光區(qū)域皆存在，其中紫外區(qū)的強吸收出現(xiàn)在280 nm 附近，可見光區(qū)域最大吸收波長在500～550 nm 范圍內，且吸收峰位置會受溶劑、花色苷母核、糖基數(shù)目和位置等因素影響［11］。本研究中在530 nm 處存在典型吸收峰，與紫薯一致，其花青素在530 nm 處出現(xiàn)一個寬的吸收峰，這是花青素在酸性環(huán)境中的典型特征峰［12］，而山桃稠李果實在517 nm 處有明顯的花青素特征吸收峰［13］，紅菊苣花青素吸收峰在520 nm［14］，黑小麥粉中花青素的最大吸收波長在531 nm［15］。

本研究采用單因素試驗和響應面法來確定紫色觀賞辣椒中花青素的最佳提取工藝，先通過單因素試驗確定了花青素提取的最佳提取劑，料液比以及超聲時間，但單因素試驗僅僅可以確定每個因素的最佳水平，各因素之間往往存在交互作用，并不是單因素的最佳水平組合就能得到最好的提取條件。響應面分析法通過合理的試驗設計，利用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，分析回歸方程以篩選最佳的工藝條件［16］。利用響應面分析法將通過單因素試驗確定的各因素較佳的水平進行隨機組合，可分析確定各因素之間的交互作用，從而篩選出最佳的組合，它與傳統(tǒng)的正交試驗相比，節(jié)省了大量的時間以及財力，同時也提高了提取方法的精密度和準確度。響應面法被廣泛應用于食品加工業(yè)，多用于營養(yǎng)成分的提取工藝優(yōu)化中，當前已應用于黃酮［17］、多酚［18］、果膠［19］等物質。在單因素試驗中，得到含1% HCl 的甲醇和乙醇對花青素的提取效果較佳，含1% HCl 的甲醇的提取效果最好，同朱安娜等人研究結果一致，在紫薯花青素提取劑篩選研究中，酸性甲醇和酸性乙醇的提取效果最佳［12］。李文鵬等人通過分析比較不同濃度的乙醇、丙酮、水對花青素的提取能力，發(fā)現(xiàn)40 %丙酮的提取效果最佳，而本研究中丙酮的提取效果較差，可能是因為使用的提取試劑為純丙酮，氫鍵締合反應常產(chǎn)生于純丙酮中的羧基與花青素分子之間，純丙酮對花青素的溶解度較小，純丙酮極性低，通過加入極性較大的水后可以調節(jié)其極性，從而提高花青素的提取率［20］?；ㄇ嗨睾侩S著料液比的增加存在一個先增加后降低的趨勢，是因為在提取液體積過少時，溶液提取達到飽和，溶液濃度高導致了提取效率的降低，料液比過大時，不僅使得溶液稀釋，還會消耗過多的提取試劑。隨著提取時間的延長，花青素含量逐漸穩(wěn)定，有效成分的析出達到穩(wěn)定。前人指出隨著提取時間的增加，提取率呈先增加后下降的趨勢，但下降幅度不大，原因是在一定時間范圍內，物質的溶出率會隨著時間的增加而提高，到達某時間后，溶液體系的滲透壓達到平衡時溶出率的變化不大［21］。響應面試驗法可分析確定各因素之間的交互作用，從而設計出最佳的水平組合，響應面的3D 圖和等高線圖可以明顯表示多個自變量以及自變量之間的交互作用對花青素得率的影響，在3D 圖中，自變量的影響力隨著響應面的陡峭程度而增大，同時在控制其它因素不變的情況下可以分析比較2 個有交互作用的因素對花青素含量的影響［22］。在玫瑰茄花青素提取工藝研究中，石艷賓等人提出提取時間與提取劑濃度，料液比與提取劑濃度交互作用不顯著，與本研究結果一致，認為交互項甲醇濃度與料液比AB、甲醇濃度與提取試時間AC、料液比與提取時間BC 對花青素含量的影響并不顯著［23］。結合響應面對交互作用的分析結果，設計了最佳的觀賞辣椒花青素提取工藝為甲醇濃度90%，料液比1∶25 g·mL-1，提取時間40 min。

圖11 不同品種觀賞辣椒果實色差值Fig.11 Chromaticity values of different cultivar of ornamental pepper

圖12 不同品種紫色觀賞辣椒綠熟期果實花青素含量Fig.12 Anthocyanin content in fruits of different cultivar of purple ornamental pepper at green maturity

表4 果色與花青素色素含量相關性分析Table 4 Correlation analysis between fruit color and anthocyanin pigment content

當前花青素含量的測定方法有很多，姚華開利用紫外分光光度計法建立了紫色蔬菜的花青素含量的測定體系，該方法耗時短，成本廉價，但是相比于其它方法，精確度不高，且很難排除其他色素雜質對花青素含量測定的影響［24］；高效液相色譜法主要是對具體的花青素成分進行測定，精確度較高，但是成本昂貴，試驗耗時耗力，相比于其它方法，pH 示差法能夠精確快速的得出植物中的花青素含量，同時也可以排除葉綠素等其他色素物質對測定結果的影響?；ㄇ嗨仡伾苋菀资艿揭恍┮蛩氐挠绊?，如溫度、pH 值、溶劑、光照、顏料本身的結構和其它分子的存在［25，26］?；ㄇ嗨赜?-苯基苯并吡喃環(huán)和環(huán)上不同的取代基組成，在不同的pH 下，可形成不同的結構，這些結構分別為醌式堿（藍色）、花烊正離子（紅色）、甲醇假堿和查爾酮（無色），在一個特定的pH 條件下，這些結構會達到一定的平衡，在強酸條件下，花青素溶液會表現(xiàn)為紅色，隨著pH 的增加，顏色逐漸變淡，在中性條件下，溶液會表現(xiàn)為無色，而堿性條件下，則會呈藍色［27，28］。pH 示差法根據(jù)花青素結構轉換的函數(shù)，來確定花青素吸光度差別最大但穩(wěn)定的2 個pH［29］。在本研究中相差最大的2 個pH 分別為1.0和4.5，觀賞辣椒花青素在pH 為1.0 時，吸光度達到最大，隨著pH 的增加，吸光度逐漸降低，在pH為4.5 后吸光值穩(wěn)定，同該結果一致，在黑小麥全麥粉［15］、紅菊苣［14］、紫色馬鈴薯［12］、藍莓［30］等植物花青素含量測定中，最佳的緩沖液pH 皆為1和4.5。

紫色觀賞辣椒果實顏色的深淺與花青素含量存在明顯的負相關性，這與劉藝等［31］的研究結果一致，認為藍莓果實的花青素含量與L*顯著負相關。且研究發(fā)現(xiàn)花青素含量與b*值的相關性高于a*值，這與Singha 等［32］的結果一致，他指出蘋果中花青素含量與B 值的相關性高于A 值。在生產(chǎn)生活中，可以利用這一特性來快速預測其花青素含量，果實色澤越深，花青素積累水平越高，可以為觀賞辣椒評價體系的建立提供一定的理論依據(jù)。

4 結論

本研究以紫色觀賞辣椒為試材，利用單因素試驗法篩選各因素的最佳水平，響應面試驗設計提取方案，明確各因素之間的交互作用，確定其果實中花青素的提取工藝為：以90%甲醇（1%HCl）為提取劑，料液比為1∶25，超聲輔助提取40 min。通過分析比較不同緩沖液pH、平衡時間以及平衡溫度對花青素含量測定的影響，優(yōu)化pH 示差法測定條件，加標回收試驗和穩(wěn)定性考察來驗證該優(yōu)化體系，結果表明緩沖液pH 為1.0 和4.5，40 ℃平衡90 min 為最佳的測定條件。利用該優(yōu)化條件測定了不同品種觀賞辣椒果實花青素含量，并與果實色差值進行關聯(lián)分析，明確了果實色差值L*、b*與花青素含量呈負的強相關，篩選出花青素積累水平較高的品種為Q1、Q2、Q4-3、WU，進一步驗證了該優(yōu)化條件的可行性。本研究結果為觀賞辣椒花青素含量的測定以及評價體系的建立提供實踐依據(jù)，并為高水平花青素積累的品種選育奠定基礎。