萬浩宇，張 璐，萬海同，方馬一佳，潘璐佳，金偉鋒，何 昱

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 1.醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院、2.藥學(xué)院、3.生命科學(xué)院，浙江 杭州 310053)

隨著環(huán)境不斷惡化，空氣質(zhì)量日益下降，全球哮喘的患病率和死亡率正逐年攀升[1]。氣道重塑作為哮喘的三大病理生理特征之一，是氣道炎癥慢性發(fā)展的必然結(jié)果。由于持續(xù)性的氣道炎癥反復(fù)發(fā)作，反復(fù)修復(fù)，導(dǎo)致組織增生而發(fā)生氣道重塑，最終導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的發(fā)生[2]。相關(guān)研究表明，氣道重塑是導(dǎo)致哮喘難以根治的重要原因[3]。目前最有效的抗炎藥物糖皮質(zhì)激素作為一線抗哮喘藥物，在臨床上被廣泛使用。但有研究表明，糖皮質(zhì)激素對于抑制氣道重塑作用有較大的個體化差異，而且若長期應(yīng)用也會出現(xiàn)代謝紊亂、抑制生長發(fā)育等不良反應(yīng)[4]。因此，仍需不斷探尋新的抗哮喘藥物。近年來，越來越多的中藥已被證實能夠通過抑制哮喘相關(guān)的免疫反應(yīng)和細胞因子來抑制哮喘氣道重塑，從而預(yù)防和治療哮喘[1]。

麻黃湯始載于張仲景的《傷寒論》，是臨床上辛溫解表的經(jīng)典方劑。該方由麻黃、桂枝、苦杏仁、炙甘草四味藥材組成，具有發(fā)汗解表、止咳平喘的功效，可用于支氣管哮喘、流行性感冒等肺部疾病的治療[5]。但麻黃湯作為中藥復(fù)方，具有復(fù)雜的化學(xué)成分，其治療哮喘的作用機制也相對復(fù)雜，若僅僅只通過傳統(tǒng)的動物實驗或細胞實驗的方法研究其藥理機制則較為困難。而通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可對麻黃湯治療哮喘的作用機制進行初步的篩選，使后續(xù)機制研究能更具有針對性。因此，本研究首先運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選麻黃湯治療哮喘的潛在信號通路，并復(fù)制大鼠哮喘模型，探討麻黃湯對哮喘大鼠氣道重塑、氣道高反應(yīng)的影響及其相關(guān)機制，以期為其臨床治療哮喘提供相應(yīng)的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP；生物分子功能注釋系統(tǒng)MAS3.0；臺灣中醫(yī)藥資料庫(TCM@Taiwan)；Cytoscape 3.6.0軟件；PharmGKB數(shù)據(jù)庫；Drugbank 數(shù)據(jù)庫；STITCH數(shù)據(jù)庫；OMIM 數(shù)據(jù)庫；TTD 數(shù)據(jù)庫。

1.2 動物健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(230±20)g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心提供。動物許可證號:SCXK(浙)2014 -0001。

1.3 藥材、儀器與試劑麻黃(批號180801)、桂枝(批號180801)、炙甘草(批號180801)、苦杏仁(批號180910)均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)名中醫(yī)館。麻黃湯樣品為四味組方藥材加水煎煮后濃縮制得，每1 mL藥液相當(dāng)于1 g生藥量，湯劑的密度值約為1.1 mg·L-1。

384酶標(biāo)儀(美國MD公司)；EMKA動物肺功能檢測系統(tǒng)(北京廣源達科技發(fā)展有限公司)；402A1超聲霧化器(江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；高速冷凍離心機(Sigma公司)；可見紫外分光光度計(Beckman公司)；CFX384多重實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；MICROM HM340E石蠟切片機(德國MICROM公司)；OLYMPUS BX60型熒光顯微鏡攝像機(日本OLYMPUS公司)；Leica HI120型攤片機(德國Leica公司)。

地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品(批號C10197719)、氫氧化鋁(批號C10206974)、氯化乙酰甲膽堿(Mch, 批號C10267781)均購自上海麥克林生化科技有限公司；卵清蛋白干粉(OVA，批號A5253)，購自美國Sigma公司；烏拉坦(批號Z23S8Y44213)，Rat VEGF、Rat bFGF、Rat TGF-β1、Rat OPN、Rat ET-1 ELISA 試劑盒(批號E20190101A)，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.4 信號通路篩選參照相關(guān)文獻[6-7]，利用TCMSP、TCM@Taiwan數(shù)據(jù)庫并結(jié)合文獻檢索結(jié)果收集麻黃湯中的化學(xué)成分；通過STITCH數(shù)據(jù)庫檢索成分對應(yīng)靶點以及利用PharmGKB、Drugbank、OMIM 和TTD 數(shù)據(jù)庫檢索哮喘對應(yīng)靶點，再通過Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點、麻黃湯靶點蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)、哮喘靶點PPI網(wǎng)絡(luò)及麻黃湯與哮喘靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，合并相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)后取其交集部分篩選麻黃湯治療哮喘的候選靶點，再通過GO分析以及KEGG通路分析篩選麻黃湯治療哮喘的潛在信號通路。

1.5 分組和給藥SD大鼠隨機分為6組，分別為空白對照組(N)、哮喘模型組(M)、麻黃湯高劑量組(10 mL·kg-1，MHT-H)、麻黃湯中劑量組(5 mL·kg-1，MHT-M)、麻黃湯低劑量組(2.5 mL·kg-1，MHT-L)、地塞米松組 (1 mg·kg-1，DXM)，每組6只大鼠。給藥組大鼠于首次致敏后d 15起灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，對照組及模型組大鼠每天灌胃生理鹽水，持續(xù)14 d。麻黃湯給藥劑量根據(jù)人臨床給藥劑量以及人和大鼠的體表面積換算而來。

1.6 大鼠哮喘模型的復(fù)制大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，除空白對照組外，其他各組大鼠參照文獻方法[8]，于d1及d8腹腔注射1 mL含10% OVA及10%氫氧化鋁的生理鹽水混懸液致敏，d15起將大鼠放入自制密閉容器內(nèi)，超聲霧化吸入2% OVA混懸液，連續(xù)激發(fā)2周，每天1次，每次30 min。

1.7 哮喘大鼠氣道反應(yīng)性檢測末次激發(fā)24 h后，大鼠放入體描箱中，使其穩(wěn)定5 min以適應(yīng)環(huán)境。首先測定各項Penh基礎(chǔ)值3 min，然后加入200 μL用生理鹽水稀釋的不同濃度Mch溶液，濃度由低到高依次為 0、3.125、6.25、12.5、25、50 g·L-1，每次霧化吸入時間2 min，每個激發(fā)劑量時的Penh值取霧化吸入后3 min的平均值。

1.8 大鼠血清相關(guān)指標(biāo)檢測末次激發(fā)24 h后，大鼠按1.2 g·kg-1劑量用20%烏拉坦麻醉后，行腹主動脈采血。血樣3 000 r·min-1離心，取血清，分裝，凍存于-80 ℃冰箱備用。全部取樣結(jié)束后，ELISA測定大鼠血清中VEGF、ET-1、OPN、bFGF以及TGF-β1的含量。

1.9 PAS染色及MASSON染色腹主動脈取血后處死大鼠，取大鼠左肺，常規(guī)石蠟包埋，行PAS染色觀察大鼠氣道粘液分泌情況，行MASSON染色觀察大鼠氣道上皮下膠原沉積情況。

1.10 大鼠肺組織相關(guān)基因mRNA測定參考相關(guān)文獻[9]，TRIzol Reagent 法提取大鼠肺組織總RNA，將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。用 Primer 5.0 軟件設(shè)計引物如Tab 1所示，PCR擴增體系及反應(yīng)條件如Tab 2所示。擴增結(jié)束后，分析熔解曲線，鑒定PCR產(chǎn)物的特異性。獲取各個樣本量的Ct值，以GAPDH作對照，計算目的基因mRNA的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共篩選出麻黃湯中58種化學(xué)成分，248個成分相關(guān)靶點，229個哮喘相關(guān)靶點，繪制麻黃湯成分-靶點、麻黃湯靶點PPI網(wǎng)絡(luò)、哮喘靶點PPI網(wǎng)絡(luò)及麻黃湯與哮喘靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖：麻黃湯成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖包括306個節(jié)點和359條邊；麻黃湯靶點PPI網(wǎng)絡(luò)共有6 093個相互作用蛋白，147 976條相互作用關(guān)系；哮喘靶點PPI網(wǎng)絡(luò)共有4 004個相互作用蛋白，91 454條相互作用關(guān)系；麻黃湯與哮喘靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖共有節(jié)點458個，相互作用關(guān)系912條。合并相交網(wǎng)絡(luò)篩選得出186個候選靶點。候選靶點進行GO分析和KEGG富集分析后，發(fā)現(xiàn)麻黃湯治療哮喘與蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥應(yīng)答等過程關(guān)系密切，GO分析結(jié)果結(jié)果見Fig 1。KEGG通路注釋結(jié)果(Fig 2)則發(fā)現(xiàn)麻黃湯抗哮喘的作用機制可能涉及到Toll 樣受體、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、T 細胞受體等信號通路。

2.2 大鼠氣道性反應(yīng)、氣道粘液分泌及氣道上皮下膠原沉積情況大鼠氣道性反應(yīng)結(jié)果見Tab 3所示，與正常組大鼠相比較，當(dāng)激發(fā)劑Mch濃度較高時，模型組大鼠Penh值均高于正常組大鼠(P<0.01)；各給藥組大鼠Penh值均低于模型組，當(dāng)Mch激發(fā)濃度達到25、50 g·L-1時，麻黃湯各劑量組均能顯著降低哮喘大鼠Penh值(P<0.05)，表明麻黃湯能降低哮喘大鼠氣道反應(yīng)性，改善哮喘氣道高反應(yīng)。

Fig 1 Results of GO analysis

氣道粘液分泌及氣道上皮下膠原沉積情況見Fig 3A。PAS染色結(jié)果表明，正常組大鼠氣道上皮杯狀細胞數(shù)目較少，氣道粘液分泌較少；模型組大鼠氣道上皮杯狀細胞大量增生，管腔中粘液分泌較多，導(dǎo)致氣道狹窄；各給藥組與模型組相比，杯狀細胞數(shù)目及管腔內(nèi)粘液分泌減少，表明麻黃湯能減少哮喘大鼠氣道上皮杯狀細胞數(shù)目，改善氣道粘液分泌情況。

MASSON染色結(jié)果(Fig 3B)表明，正常大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清楚，無明顯氣道上皮下膠原沉積情況；經(jīng)OVA致敏激發(fā)后，大鼠氣道重塑現(xiàn)象嚴重，氣道管腔狹窄，且上皮下膠原過度沉積；給予不同藥物干預(yù)后，各給藥組大鼠上皮下膠原沉積情況均得到不同程度的改善，表明麻黃湯能有效改善哮喘大鼠氣道重塑情況。

Tab 1 PCR primers and conditions

Tab 2 Reaction system for PCR

Fig 2 Results of KEGG pathways analysis

Fig 3 PAS staining and Masson staining

GroupBaselineNS3.125 g·L-16.25 g·L-112.5 g·L-125 g·L-150 g·L-1N0.56±0.120.95±0.261.38±0.521.57±0.641.79±0.551.66±0.292.13±0.22M0.89±0.29?1.34±0.531.64±0.622.37±0.80?2.70±0.62?3.24±0.44??3.60±0.41??MHT-H0.69±0.171.32±0.251.39±0.391.83±0.561.96±0.622.12±0.93#2.32±0.99#MHT-M0.92±0.331.24±0.281.94±1.312.09±0.652.18±0.652.05±0.96#2.39±1.14#MHT-L0.76±0.181.18±0.361.47±0.382.27±0.792.30±0.842.04±0.65#2.47±0.67#DXM0.96±0.171.22±0.211.51±0.312.08±0.542.23±0.752.13±0.88#2.38±0.63#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

2.3 對哮喘大鼠血清中VEGF、ET-1、OPN、bFGF以及TGF-β1含量表達的影響如Fig 4所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中VEGF、ET-1、OPN、bFGF以及TGF-β1的含量均上升(P<0.05)；與模型組比較，麻黃湯各劑量組均能降低大鼠血清中VEGF、ET-1、OPN、bFGF以及TGF-β1的含量(P<0.05)。

Fig 4 Effect of MHT on content of relatedfactors in serum of asthmatic

2.4 對哮喘大鼠肺組織中p38MAPK、NF-κB p65、VEGF mRNA表達的影響與對照組大鼠比較，模型組大鼠肺組織中p38MAPK、NF-κB p65、VEGF mRNA表達量增加(P<0.001)；麻黃湯組能下調(diào)大鼠肺組織中p38MAPK、NF-κB p65、VEGF的 mRNA表達量(P<0.01)，見Fig 5。

Fig 5 Changes of mRNA expression levelsof key genes in rat lung

3 討論

在本研究中，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)共篩選出麻黃湯治療哮喘的186個候選靶點。GO富集分析顯示，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥應(yīng)答、免疫響應(yīng)等生物過程排名較靠前；在分子功能中，上述候選靶點主要涉及到蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等。炎癥介質(zhì)在哮喘的慢性炎癥反應(yīng)中有著重要的作用。課題組前期研究證實，麻黃湯可抑制哮喘大鼠炎癥因子的表達，改善其氣道炎癥[5]。而轉(zhuǎn)錄因子如活化蛋白-1則可以快速誘導(dǎo)并協(xié)同已存在的轉(zhuǎn)錄因子如GATA-3，激活Th2細胞內(nèi)的IL-4、IL-5及IL-13的基因轉(zhuǎn)錄。Th2細胞分泌IL-4、IL-5等細胞因子并促進IgE大量合成，增強免疫應(yīng)答。在KEGG生物途徑富集分析中，Toll 樣受體信號通路、MAPK信號通路、T 細胞受體信號通路等被顯著性富集，表明麻黃湯治療哮喘的機制可能與上述信號通路有關(guān)。

氣道高反應(yīng)是哮喘的臨床癥狀之一，持續(xù)的氣道高反應(yīng)會導(dǎo)致哮喘患者肺功能的下降，嚴重影響患者生活。本實驗中，OVA致敏激發(fā)4周后，隨著激發(fā)劑Mch濃度的升高，給藥組大鼠Penh值顯著降低，提示麻黃湯和地塞米松均能顯著改善哮喘大鼠氣道高反應(yīng)，減輕哮喘癥狀。

ET-1作為哮喘中一種重要的致病因子，能促進氣道上皮細胞的生長，引發(fā)氣道平滑肌的強烈收縮，并刺激前列腺素、血栓素等炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致氣道反應(yīng)性增高，同時加重機體缺氧、缺血，嚴重者甚至?xí)斐上院粑ソ遊10]。在本實驗中，各劑量麻黃湯均可下調(diào)哮喘大鼠血清中ET-1的含量，這與本實驗中氣道反應(yīng)性結(jié)果趨勢一致，提示麻黃湯可能通過抑制ET-1分泌以調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥，改善氣道高反應(yīng)。

哮喘氣道重塑的病理特征主要包括氣道平滑肌細胞的增殖遷移、氣道上皮下膠原沉積以及血管生成重塑等。本實驗中，OVA致敏激發(fā)后，大鼠氣道杯狀細胞大量增加，氣道粘液分泌增多，氣道上皮下膠原沉積明顯，經(jīng)麻黃湯干預(yù)后，上述情況均得到不同程度的改善，這表明麻黃湯可減少哮喘大鼠肺組織病變，改善哮喘氣道重塑。

VEGF在哮喘發(fā)作時呈現(xiàn)高表達，可通過增加氣道的血管通透性以及血管平滑肌的增生，導(dǎo)致氣道黏膜增厚，加重氣道重塑。TGF-β1是氣道重塑過程中的一個關(guān)鍵因子，具有重要的促纖維化和免疫調(diào)節(jié)作用，可促進氣道平滑肌細胞肥大增生，氣道膠原的沉積以及結(jié)締組織蛋白的合成，導(dǎo)致不可逆的肺功能改變和氣道重塑的形成[11]。bFGF是廣泛分布于人體內(nèi)的成纖維細胞生長因子的一個亞型，在平滑肌細胞的增殖、成肌纖維細胞表型的逆轉(zhuǎn)和氣道上皮細胞的遷移增殖中起重要作用[12]。本實驗結(jié)果顯示，OVA致敏后，大鼠血清中VEGF、TGF-β1、bFGF的表達顯著升高，而麻黃湯能顯著抑制三者的表達；RT-PCR檢測結(jié)果也證實，麻黃湯能顯著抑制哮喘大鼠肺組織中VEGF mRNA的表達。這說明麻黃湯可能是通過抑制VEGF、TGF-β1、bFGF的過度分泌以減輕哮喘大鼠氣道重塑癥狀。OPN是一類多功能細胞，在巨噬細胞、上皮細胞、嗜酸性粒細胞等多種哮喘關(guān)鍵細胞中均有相應(yīng)受體表達。其可誘導(dǎo)VEGF的表達，促進新血管生成，同時增厚基底膜，加重哮喘氣道重塑[13]。本實驗證實不同劑量麻黃湯均可顯著降低哮喘大鼠血清中OPN的表達水平，說明麻黃湯改善氣道重塑可能與抑制OPN的表達相關(guān)。

p38MAPK信號途徑是MAPK家族的重要組成部分，在哮喘發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用，在肺部疾病的研究中也較為成熟[14]。NF-κB 作為一種與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子，是p38MAPK的下游通路。p38MAPK磷酸化后的特異性底物可激活NF-κB通路，并進一步激活轉(zhuǎn)錄VEGF的表達，調(diào)節(jié)新血管的發(fā)生和生長，加劇氣道重塑的進程。另有研究表明，TGF-β1可激活p38MAPK信號通路，調(diào)節(jié)一系列病理生理過程。而同時TGF-β1基因的轉(zhuǎn)錄又有賴于NF-κB的活化，進而使 TGF-β1 表達增加，加重氣道重塑[15]。本實驗PCR結(jié)果顯示，OVA致敏激發(fā)可使大鼠肺組織中p38MAPK以及NF-κB p65的mRNA表達水平較正常大鼠顯著升高，麻黃湯干預(yù)后，兩者的mRNA表達水平得到顯著抑制，同時NF-κB下游因子VEGF的mRNA表達水平也被顯著下調(diào)，提示麻黃湯可能通過調(diào)節(jié)p38MAPK/NF-κB信號通路上的關(guān)鍵基因來改善哮喘氣道重塑。

綜上所述，本研究證實麻黃湯可以改善哮喘大鼠的氣道重塑和氣道高反應(yīng)，其機制可能與下調(diào)VEGF、bFGF、TGF-β1、ET-1、OPN含量以及p38MAPK/NF-κB信號通路上的關(guān)鍵基因p38MAPK、NF-κB p65 mRNA表達有關(guān)。