趙修報(bào)，程立坤， *，付 強(qiáng)，張莎莎，沈志強(qiáng)，

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 濱州市高密度發(fā)酵與高效表達(dá)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司 山東省高密度發(fā)酵與高效表達(dá)技術(shù)工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256600）

谷物釀造的歷史悠久，谷物發(fā)酵的歷史可追溯到古埃及和美索不達(dá)米亞[1]。谷物發(fā)酵可以分為酒精發(fā)酵和非酒精發(fā)酵，酒精發(fā)酵如釀造啤酒，非酒精發(fā)酵主要為乳酸菌發(fā)酵，偏酸性居多[2]。谷物發(fā)酵飲料中應(yīng)用的功能性微生物種類較多，主要有乳酸菌、醋酸菌、特殊酵母菌和絲狀真菌，通過發(fā)酵能夠提高飲料的消化率、風(fēng)味和口感，谷物非酒精發(fā)酵可作為糧食加工的一個(gè)新途徑[2-3]。根據(jù)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，谷物發(fā)酵飲料可以歸類到植物飲料中的其他植物飲料類別，是指以谷物或谷物提取物為原料，添加或不添加其他食品原輔料和（或）食品添加劑，經(jīng)發(fā)酵制成的液體飲料[4-5]。非酒精谷物發(fā)酵飲料可用的主要谷物有藜麥、黑麥、小麥、大米、燕麥、小米、玉米、谷粒、高粱和大麥等[6-7]。這些谷物因營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，含有膳食纖維、維生素、蛋白質(zhì)和生物活性化合物，來源廉價(jià)，一年四季都可獲得而被廣泛使用[8]。

隨著人們不斷增強(qiáng)的健康意識(shí)，具有潛在健康效益的非酒精谷物發(fā)酵方面的研究越來越多[9]。劉仁祿等[10]使用酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵用大麥芽制備的麥芽汁，開發(fā)出了一款麥芽汁發(fā)酵飲料，并對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行了研究。LEMARCQ M等[11]使用鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發(fā)酵麥汁制備了一款功能性益生菌飲品，并且評(píng)估了飲料的質(zhì)量和保質(zhì)期以及發(fā)酵麥汁中益生菌的生存能力。此外科研人員分別利用燕麥、薏米、玉米、糙米等為原料，單獨(dú)使用乳酸菌或乳酸菌和酵母菌兩種菌種進(jìn)行發(fā)酵，來制備谷物發(fā)酵飲品，取得一定的研究成果[2]。由于消費(fèi)者在選擇功能性食品時(shí)，口味因素占59%，營(yíng)養(yǎng)因素僅占36%[12]。盡管單獨(dú)使用乳酸菌發(fā)酵制備谷物發(fā)酵飲料的健康益處是公認(rèn)的，但消費(fèi)者對(duì)它們的接受度很低[6]?？梢試L試使用乳酸菌和酵母菌或其他菌種混合發(fā)酵來制備大眾能夠接受的產(chǎn)品。目前使用混合菌種開發(fā)出的谷物發(fā)酵飲料大都具有令人反感的異味和味道，如過重的麥芽味，酸敗味和類谷物味等，雖然產(chǎn)品的記憶點(diǎn)很強(qiáng)，但是大眾的接受度低，不具備市場(chǎng)前景[9]。因此需要從谷物原料選擇和處理，發(fā)酵微生物的選擇和制備工藝的優(yōu)化這幾個(gè)方面相結(jié)合來克服這些問題。

本研究使用大麥芽、小米、赤小豆、燕麥和香型啤酒花為原料，并經(jīng)過特定的糖化工藝來制備谷物汁，使用高活性面包酵母和副干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）兩種乳酸菌作為發(fā)酵菌種，采用一步混合發(fā)酵的工藝來制備谷物發(fā)酵飲料。使用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)[13-15]對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。旨在開發(fā)出一款具有記憶點(diǎn)并且大眾接受度高的新型的谷物發(fā)酵飲料，并為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

安琪高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；副干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）：科漢森（中國(guó)）有限公司；麥芽：煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；赫茲布魯克牌香型顆粒啤酒花：山東安克生物工程有限公司；燕麥、赤小豆及其他谷物原料：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

中性蛋白酶（0.8 AU/g）、中溫淀粉酶（480 KNU/g）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸二銨、一水合硫酸錳（均為分析純）：天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；碘化鉀（分析純）：天津市科盟化工工貿(mào)有限公司；吐溫80：武漢清匯生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

12°P麥芽汁培養(yǎng)基：12°P麥芽汁，自然pH，115 ℃滅菌30 min。

MRS培養(yǎng)基[10]：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，葡萄糖5.0 g，吐溫80 1.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，一水合硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.5～6.8，115 ℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設(shè)備

ALCOLYZER M安東帕酒精分析儀：奧地利安東帕公司；WYA-2WAJ阿貝折射儀測(cè)定：上海力辰儀器科技有限公司；PHS-3C 酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 谷物發(fā)酵飲料加工工藝流程及操作要點(diǎn)

谷物→粉碎→糊化、糖化→煮沸→過濾→接種→發(fā)酵→調(diào)配→滅菌→谷物發(fā)酵飲料

谷物粉碎：使用粉碎機(jī)粉碎，大麥芽粉碎至破而不碎，赤小豆、燕麥粉碎至大約40目。

糊化、糖化：大麥芽、小米、赤小豆、燕麥的原料質(zhì)量比為5∶1∶1∶1。向粉碎好的燕麥、赤小豆和小米里加入適量70 ℃的水，攪拌，先70 ℃保溫20 min，然后100 ℃煮沸30 min。然后向糊化液里加入適量的常溫水，加入粉碎好的大麥芽，攪拌均勻，按照總谷物原料質(zhì)量的1.0‰添加中溫淀粉酶，0.5‰添加中性蛋白酶，采用單醪升溫浸出糖化法進(jìn)行糖化[16]。

煮沸、過濾：糖化結(jié)束，過濾除渣后煮沸40 min。酒花按2.0 g/kg麥汁分2次添加，第一次初沸時(shí)，第二次是煮沸終了前10 min。煮沸結(jié)束，靜置20 min，使用8層紗布分離酒花糟及熱凝固物，并進(jìn)行冷卻，得到谷物混合液。

乳酸菌活化：按量稱取適量干酵母，加入12°P麥芽汁培養(yǎng)基中置于搖床中，以28 ℃、120 r/min過夜培養(yǎng)。

乳酸菌活化采用MRS培養(yǎng)基[10]與12°P麥芽汁培養(yǎng)基按照1∶1混合，37 ℃靜置過夜培養(yǎng)。副干酪乳桿菌和瑞士乳桿菌的接種比例為3∶2。

接種、發(fā)酵：把活化好的酵母菌和乳酸菌接入谷物混合液中，按照發(fā)酵溫度進(jìn)行發(fā)酵。待發(fā)酵液達(dá)到發(fā)酵指標(biāo)要求后，降至4 ℃終止發(fā)酵，得到谷物發(fā)酵原液。終止前發(fā)酵指標(biāo)以酸度為準(zhǔn)，終止酸度為2.6 mL/100 mL。

調(diào)配：按谷物發(fā)酵原液添加50%，再添加反滲透（reverses osmosis，RO）水、三氯蔗糖、槐花蜜等進(jìn)行調(diào)配，控制調(diào)配后酸度為1.10～1.40 mL/100 mL。

滅菌：在75 ℃條件下殺菌30 min。冷卻后即得谷物發(fā)酵飲料。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

原麥汁的濃度、接種量、發(fā)酵溫度、搖床轉(zhuǎn)速等是影響發(fā)酵飲料制備的重要因素[17-18]。以感官分值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察酵母接種量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、乳酸菌接種量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、發(fā)酵溫度（13 ℃、20 ℃、27 ℃、34 ℃、41 ℃）、原麥汁濃度（4°P、6°P、8°P、10°P、12°P）和搖床轉(zhuǎn)速（0、50 r/min、100 r/min、150 r/min、200 r/min）對(duì)谷物發(fā)酵飲料品質(zhì)的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酵母接種量、乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度作為考察因素進(jìn)行下一步試驗(yàn)。采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 產(chǎn)品分析及指標(biāo)測(cè)定方法

（1）感官評(píng)價(jià)

在評(píng)價(jià)前準(zhǔn)備好發(fā)酵樣品。每次評(píng)估選擇8名訓(xùn)練有素的專業(yè)人員和6名普通消費(fèi)者。每輪只品評(píng)6個(gè)樣品，每次品評(píng)的時(shí)間最長(zhǎng)為30 min。谷物發(fā)酵飲料的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 谷物發(fā)酵飲料的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of fermented grain beverage

（2）理化指標(biāo)

酸度的測(cè)定按照國(guó)標(biāo)GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》中的方法；酒精度的測(cè)定采用酒精分析儀；糖度測(cè)定采用阿貝折射儀。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)組均設(shè)計(jì)平行試驗(yàn)組，采用Design-Expert 10.0.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。得出最大感官評(píng)分值的預(yù)測(cè)值和相應(yīng)的各因素的編碼值，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以確定混合發(fā)酵制備谷物發(fā)酵飲料的最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乳酸菌接種量對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響

乳酸菌接種量對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官評(píng)分的影響見圖1。由圖1可以看出，乳酸菌接種量在1.0%～2.5%范圍內(nèi)，感官分值隨著乳酸菌接種量的增加而逐漸升高；乳酸菌接種量＞2.5%之后，感官分值隨著乳酸菌接種量的增加而降低。當(dāng)乳酸菌接種量為1.0%、1.5%、2.0%時(shí)，發(fā)酵的時(shí)間要長(zhǎng)于2.5%的接種量，導(dǎo)致產(chǎn)品的醇厚感較重，因此感官分值偏低；當(dāng)乳酸菌接種量為3.0%時(shí)，發(fā)酵又太快，導(dǎo)致樣品除了酸味之外其他風(fēng)味不足，因而影響感官分值。因此，乳酸菌接種量初步選擇為2.5%。

圖1 乳酸菌接種量對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of lactic acid bacteria inoculum on sensory quality of fermented grain beverage

2.1.2 酵母接種量對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官分值的影響

酵母接種量對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響見圖2。由圖2可以看出，在一定范圍內(nèi)，感官分值隨著酵母接種量的增加先升高，然后再逐漸降低。酵母接種量為0.5%時(shí)感官分值最高，酵母接種量太低口味比較寡淡，酵母接種量太高醇厚感太重。因此，酵母接種量初步選擇為0.5%。

圖2 酵母接種量對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on sensory quality of fermented grain beverage

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響見圖3。由圖3可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為13～41 ℃時(shí)，感官分值隨著發(fā)酵溫度的升高先逐漸升高，然后再降低。當(dāng)發(fā)酵溫度為34 ℃時(shí)，口感風(fēng)味等較其他溫度更好，感官分值最高。因此，發(fā)酵溫度初步選擇為34 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory quality of fermented grain beverage

2.1.4 原麥汁濃度對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響

原麥汁濃度對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響見圖4。由圖4可以看出，當(dāng)原麥汁濃度為4～8°P時(shí)，感官分值隨著原麥汁濃度的增加先逐漸升高；當(dāng)原麥汁濃度為8～12°P時(shí)，感官分值隨著原麥汁濃度的增加略有增加，趨于平穩(wěn)。因此，原麥汁濃度初步選擇為8°P。

圖4 原麥汁濃度對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of original wort concentration on sensory quality of fermented grain beverage

2.1.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官分值的影響

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響見圖5。由圖5可以看出，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速在0～200 r/min時(shí)，感官分值隨著搖床轉(zhuǎn)速的升高而逐漸降低。搖床轉(zhuǎn)速為0 r/min時(shí)，感官分值最高，此時(shí)香味較濃，回味時(shí)間長(zhǎng)且沒有其他雜味；其他轉(zhuǎn)速香味均較弱，且有雜味。因此選擇靜置發(fā)酵。

圖5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of rotational speed on sensory quality of fermented grain beverage

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以乳酸菌接種量（X1）、發(fā)酵溫度（X2）和酵母接種量（X3）為影響因素，發(fā)酵產(chǎn)品感官分值（Y）為響應(yīng)值，使用Design-Expert 10.0.3設(shè)計(jì)3因素3水平Box-Benhnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

把表3的試驗(yàn)結(jié)果輸入Design-Expert 10.0.3軟件中，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，建立二次回歸模型，得到乳酸接種量（X1）、發(fā)酵溫度（X2）和酵母接種量（X3）與發(fā)酵產(chǎn)品感官分值Y的回歸方程。獲得回歸方程為：Y=+90.20+1.88X1+2.50X2+2.38X3+0.50X1X2+2.25X1X3+0.00X2X3-62.23X12-1.98X22-3.72X32

表3 谷物發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments of fermented grain beverage process optimization

由表4可知，該模型具有顯著性（P=0.003 4），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.303 0）。決定系數(shù)R2為0.925 8，調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.830 4，表明回歸模型顯著，擬合程度高，回歸方程可用于確定最優(yōu)感官評(píng)分的發(fā)酵產(chǎn)品。對(duì)回歸方程的系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果表明對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品感官評(píng)分的影響順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度＞酵母接種量＞乳酸菌接種量。X1、X2、X3、X1X3、X12、X22和X32對(duì)結(jié)果的影響顯著（P＜0.05）。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

通過分別對(duì)各個(gè)自變量求極值，得到極值點(diǎn)。即在乳酸菌接種量為3.28%，發(fā)酵溫度為37.66 ℃，酵母菌接種量為0.72%時(shí)，感官分值取得最大理論值為92.51分。各因素交互作用對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官分值影響的響應(yīng)面與等高線如圖6所示，能夠直觀的看出乳酸菌接種量，發(fā)酵溫度，酵母接種量?jī)蓛芍g的交互作用都很明顯[19-20]。

圖6 發(fā)酵溫度、酵母接種量、乳酸菌接種量交互作用對(duì)谷物發(fā)酵飲料感官分值影響的響應(yīng)面與等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between fermentation temperature,yeast and lactic acid bacteria inoculum on the sensory score of fermented grain beverage

為了便于實(shí)際操作，將最佳工藝條件修正為乳酸菌接種量為3.3%，發(fā)酵溫度為38 ℃，酵母菌接種量為0.7%，對(duì)此最佳條件進(jìn)行了三角瓶和10 L發(fā)酵罐各3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，感官評(píng)分實(shí)際值分別為91.7分、92.7分，與預(yù)測(cè)值92.51分結(jié)果基本吻合，產(chǎn)品的酒精度＜0.5%vol。更加驗(yàn)證了此模型的可行性。

2.3 調(diào)配

發(fā)酵原液添加量為50%，加入三氯蔗糖和槐花蜜進(jìn)行調(diào)配。對(duì)調(diào)配后的樣品進(jìn)行感品評(píng)，結(jié)果表明，當(dāng)三氯蔗糖、槐花蜜添加量分別為0.025%、5%時(shí)感官分值最高，為97分。樣品發(fā)酵風(fēng)味較好，口感順滑厚重，無異味。

3 結(jié)論

以大麥芽、小米、赤小豆、燕麥為谷物原料，酵母菌和乳酸菌為發(fā)酵菌種一步混合發(fā)酵來制備谷物發(fā)酵飲料。先通過單因素試驗(yàn)對(duì)谷物發(fā)酵飲料制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了初步工藝參數(shù)，篩選出了乳酸菌接種量、發(fā)酵溫度、酵母接種量三個(gè)主要影響因素，再通過響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化。優(yōu)化后的制備工藝為采用靜置發(fā)酵，發(fā)酵溫度38 ℃，乳酸菌接種量3.3%，酵母菌接種量0.7%，原麥汁濃度8°P；添加發(fā)酵液50%，三氯蔗糖0.025%，槐花蜜5%制得的產(chǎn)品感官評(píng)分為97分，酒精度為0.12%vol，接受度較高，具有記憶點(diǎn)，可推廣應(yīng)用。