王曉燕 張航俊 張曉麗 商小金 林仙軍

[浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（浙江省獸藥飼料監(jiān)察所）311199]

抗生素能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用[1]。畜禽攝入的抗生素約有60%～90%以原型或代謝產(chǎn)物的形式隨糞便、尿液排出[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，畜禽排泄物的使用可能造成土壤微生物生態(tài)失衡[3]，導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[4]，抗生素富集進(jìn)入食物鏈，發(fā)生食品安全事件，給人類健康帶來危害[5]。本文針對(duì)畜禽糞便基質(zhì)，從檢測(cè)樣品前處理、檢測(cè)技術(shù)等方面探討畜禽糞便中抗生素殘留的檢測(cè)方法[6]，以期對(duì)研究糞便中抗生素轉(zhuǎn)移、降解規(guī)律、合理使用、制定畜禽排放標(biāo)準(zhǔn)、污染評(píng)估及治理具有重要意義[7,8]。

1 畜禽糞便樣品預(yù)處理

畜禽糞便成分復(fù)雜，畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)規(guī)模、設(shè)備水平的差異與養(yǎng)殖場(chǎng)地干濕分離實(shí)施情況不同，導(dǎo)致糞便含水量差異大，一般情況下，糞便中水分約占3/4，其余固體成分中30%為死細(xì)菌，10%～20%為脂肪，2%～3%為蛋白質(zhì)，10%～20%為無機(jī)鹽，30%為未消化食物和消化液中的固體成分[9]。畜禽糞便中的有機(jī)質(zhì)對(duì)抗生素有較強(qiáng)的吸附力，不利于提取，給畜禽糞便樣品中目標(biāo)化合物定量造成障礙[10,11]。如何有效去除雜質(zhì)干擾成為前處理的關(guān)鍵。多數(shù)研究者處理糞便的程序是先把糞便干燥后，粉碎，過篩，作為檢測(cè)的樣品[12,13]，進(jìn)行下一步提取。

1.1 提取

抗生素殘留提取常用的溶劑有甲醇、乙腈等。乙腈具有較好的蛋白質(zhì)沉淀作用，是優(yōu)良的提取溶劑[14]。為提高提取效率，實(shí)驗(yàn)中通常會(huì)根據(jù)分析物的性質(zhì)，在乙腈中加入輔助提取劑甲酸或氨水等，與甲酸形成酸化乙腈或堿化乙腈[15]。余佩瑤[13]比較了EDTA-McIlvaine 緩沖液（M1）、EDTA-McIlvaine 緩沖液-甲醇-乙腈-丙酮（M2）、乙腈-乙酸（M3）單獨(dú)或等比例混合使用時(shí)的提取效果，發(fā)現(xiàn)用（M1-M2，1：1，v/v）時(shí)回收率最佳，各類化合物的平均回收率為70.0%～116.3%。通過調(diào)節(jié)緩沖溶液和有機(jī)溶劑的比例進(jìn)行組合提取，有利于提取強(qiáng)極性目標(biāo)物。在緩沖液中加入的EDTA 能有效提高四環(huán)素類物質(zhì)的提取效率。使用組合溶劑時(shí)，根據(jù)目標(biāo)物的種類和性質(zhì)，優(yōu)化溶劑種類和溶劑間的比例。另外，使用酸化乙腈和堿化乙腈時(shí)要注意酸堿度[16]。

1.2 凈化

提取后的溶劑含有較多雜質(zhì)，前處理過程中凈化是非常重要的一步，盡量去除雜質(zhì)，盡量保留待測(cè)物質(zhì)。常用的凈化技術(shù)有萃取和固相萃取技術(shù)(SPE)等[17]。SPE 的優(yōu)點(diǎn)是操作方便、消耗溶劑少、可富集、去除雜質(zhì)效果好。常用的固相萃取柱有HLB 和MCX 等，HLB 固相萃取柱能同時(shí)保留一個(gè)較寬范圍內(nèi)的親水、親脂化合物。

QuEChERS (Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged and Safe) 是一種常用的樣品提取和凈化的前處理技術(shù)，乙腈提取后，經(jīng)過鹽析，分散固相萃取成分，達(dá)到凈化的效果[18]。

2 檢測(cè)技術(shù)

2.1 高效液相色譜

畜禽糞便中抗生素殘留量一般比較高，高效液相色譜法分析速度快、分離能力強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，即可滿足檢測(cè)需要[19]。糞便檢測(cè)方法中HPLC 法較合適，常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、二極陣列檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器等[20-22]，檢測(cè)方法匯總見附表。

姚倩測(cè)定了海南省典型養(yǎng)殖場(chǎng)雞/豬糞便中2 種四環(huán)素類和2 種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的含量與分布特征，結(jié)果表明，在豬糞中，四環(huán)素類的總含量在0～8460.8μg/kg 之間，以土霉素為主；大環(huán)內(nèi)酯類的總含量在0～1052.8μg/kg 之間，以泰樂菌素為主；在雞糞中，四環(huán)素類化合物的總含量在0～2839.3μg/kg[20]。采用高效液相-熒光分析法測(cè)定了樣品中磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶和磺胺甲惡唑3 種主要磺胺類藥物的殘留情況，結(jié)果表明，3種磺胺類藥物在糞便中的總含量分別為10.13～566.23μg/kg[21]。

2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（HPLC-MS/MS）

在養(yǎng)殖過程中，通常檢測(cè)樣本的選擇主要是關(guān)注活體采樣的便利性、非破壞性和前處理的便捷性，如動(dòng)物尿樣和動(dòng)物飼料。但樣本的真實(shí)性會(huì)存在一定問題，大批量采樣時(shí)也會(huì)因動(dòng)物的生理特性造成阻礙[32,33]。畜禽糞便是一種具有采樣便利性的動(dòng)物樣本，但糞便樣本成分極復(fù)雜，糞便中基質(zhì)對(duì)藥物的吸附性及含水量等因素制約糞便作為監(jiān)測(cè)對(duì)象的研究。HPLCMS/MS 定性準(zhǔn)確，是近年來畜禽糞便中抗生素殘留檢測(cè)研究的重要方向。

附表 高效液相色譜測(cè)定畜禽糞便藥物殘留檢測(cè)方法匯總表

何思遠(yuǎn)研究表明，雞糞、豬糞和牛糞樣品經(jīng)加速溶劑萃取儀萃取，Oasis HLB 固相萃取柱凈化，用電噴霧正離子(ESI+)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM) 定量分析[21]。平均回收率達(dá)63.8%～103.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于13%，方法檢出限和定量限分別在0.5～5μg/kg 和1.5～20 μg/kg 之間。畜禽糞便中磺胺類及其代謝物的檢出率均在90%以上，不同樣品殘留量的差異較大。李丹妮[30]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)，建立了同時(shí)測(cè)定畜禽糞便中7 種β2-受體激動(dòng)劑的方法。樣品經(jīng)酸性乙腈提取，再用0.2%甲酸溶液稀釋，提取液用陽離子交換在線凈化柱(Hyper Sep Retain CX) 凈化，2%氨水-甲醇溶液洗脫，在正離子電噴霧條件下，采用選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)，以外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，7 種β2-受體激動(dòng)劑在0.5～100μg/L 的濃度范圍內(nèi)線性良好。張麗麗[19]研究了北京地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)糞便中四環(huán)素類抗生素殘留現(xiàn)狀，結(jié)果表明，北京地區(qū)豬糞中四環(huán)素、土霉素和金霉素檢出率分別為90.9%、45.5%和18.2%，四環(huán)素類抗生素合計(jì)濃度范圍為0.48～29.2mg/kg。萬位寧[29]建立了固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-UPLC/MS/MS)同時(shí)測(cè)定禽畜糞便中6 種磺胺類(SAs)、4 種四環(huán)素類(TCs)、3種氟喹諾酮類(FQs)、3 種大環(huán)內(nèi)酯類(MACs) 以及1 種硝基呋喃類(NFs) 抗生素殘留的方法。樣品分別由McIlvaine-Na2EDTA 緩沖液和有機(jī)混合提取液逐次超聲提取，正己烷脫脂，過SAX-HLB 固相萃取系統(tǒng)，富集，凈化，經(jīng)氮吹、定容后，以乙腈和0.1%甲酸-水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行UPLC/MS 分離檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。在0.1～1000μg/kg 添加濃度范圍內(nèi)，回收率在42.3%～79.6%。

3 結(jié)論

畜禽糞便中抗生素種類多，濃度高，人們對(duì)畜禽養(yǎng)殖廢棄物的關(guān)注，促使畜禽糞便抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)向更高的水平發(fā)展。隨著科技水平的進(jìn)步，越來越多新穎的技術(shù)手段和先進(jìn)的儀器設(shè)備正致力于解決畜禽糞便基質(zhì)成分復(fù)雜、抗生素殘留種類多等難點(diǎn)問題，進(jìn)而深入研究測(cè)定畜禽糞便中更多種類、更多組分抗生素的方法，增強(qiáng)檢測(cè)技術(shù)的實(shí)用性，為畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全和人類健康提供保障。