榮海芳，王立國

肝肺綜合征(hepatopulmonmy syndrome，HPS)是指在慢性肝病或門靜脈高壓等基礎(chǔ)上形成的以低氧血癥為主要臨床特征的一種病癥[1]，是終末期肝硬化最嚴(yán)重的并發(fā)癥，成人終末期肝病HPS患病率為4%～47%[2]，發(fā)病機(jī)制未完全闡明，治療效果差，病死率高。目前，多數(shù)研究認(rèn)為多種血管活性物質(zhì)和細(xì)胞因子參與了肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和微血管擴(kuò)張，并促進(jìn)了HPS的發(fā)生[3]。有關(guān)HPS的臨床研究較少，多數(shù)以動物實(shí)驗(yàn)研究為主。因此，良好的動物模型的建立尤為重要。一個理想的動物模型應(yīng)具備模型形成率高、動物死亡率低、重復(fù)性好、方法簡單且與人類疾病特征相似等特點(diǎn)。HPS模型的建立應(yīng)該首先建立肝硬化動物模型。目前，對于肝硬化模型的建立主要包括四氯化碳、化學(xué)致癌物、乙醇、血吸蟲感染和手術(shù)等，各有利弊。由于膽汁淤積及膽汁酸的毒性作用，肝細(xì)胞可出現(xiàn)進(jìn)行性損傷，最終可發(fā)展為肝硬化甚至肝衰竭，膽汁淤積性肝損傷是肝纖維化和肝硬化重要的危險因素[4,5]。大量動物實(shí)驗(yàn)證明，通過膽總管結(jié)扎術(shù)式可誘導(dǎo)肝硬化形成，而且只有膽總管結(jié)扎術(shù)能形成HPS模型。因此，建立膽總管結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)HPS形成的動物模型具有很高的研究價值。本文采用膽總管結(jié)扎術(shù)誘導(dǎo)大鼠HPS模型，詳細(xì)介紹了制備過程，并通過血液、超聲和組織病理學(xué)檢查等多方面進(jìn)行模型驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該術(shù)式具有手術(shù)時間短、切口小、造模周期短、穩(wěn)定性高、不易自發(fā)逆轉(zhuǎn)等優(yōu)勢，可作為HPS基礎(chǔ)研究的模型應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器和試劑 SD大鼠40只，體質(zhì)量在180～250 g之間，購自青島派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社[實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(魯)20130001，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證編號：SYXK(黑)2011007]；美國 RADISM ETER 公司生產(chǎn)的 ABL700血?dú)夥治鰞x；使用加拿大Sonix OP超聲診斷系統(tǒng)；上海研卉生物科技有限公司提供的檢測血一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒；檢測肝纖維化指標(biāo)的ELISA試劑盒購自上海研吉生物科技有限公司。

1.2 動物模型的制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為膽總管結(jié)扎組30只和假手術(shù)組10只。術(shù)前禁食8 h，在動物實(shí)驗(yàn)室手術(shù)操作臺上先用4%水合氯醛1 ml/100 g腹腔內(nèi)注射麻醉，固定(圖1)。腹部備皮、消毒。沿腹白線開腹，在劍突下1 cm處行縱行小切口，于胃竇尋找十二指腸降段，分離膽總管(圖2)。用4-0線在膽總管末端雙線結(jié)扎(圖3)，清理手術(shù)器械后逐層關(guān)腹；在對照組，不結(jié)扎膽總管，其他步驟同前。術(shù)后，待動物蘇醒后分籠飼養(yǎng)，注意保溫和局部換藥。于術(shù)后1 w、2 w、4 w、5 w和6 w各處死2只實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠，觀察肝肺和膽總管組織結(jié)構(gòu)。經(jīng)左心室采血2 ml，以5000 r/m室溫離心15 min，取上層血清。

圖1 動物模型制備 固定手術(shù)操作臺

圖2 動物模型制備 尋找并分離膽總管

圖3 動物模型制備 雙線結(jié)扎膽總管

1.3血清檢測 使用全自動生化分析儀檢測肝功能指標(biāo)；采用ELISA法測定血清透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、層粘連蛋白 (laminin，LN)、III型前膠原肽(procollagen Ⅲ N-terminal peptide ，PCⅢ)和IV型膠原(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C)水平。

1.4 血?dú)夥治龊脱獫{NO水平測定 使用血?dú)夥治鰞x測定PaO2、PaCO2和pH；采用硝酸還原酶法測定血清NO含量。

1.5 腹部超聲檢查 使用超聲診斷儀檢測肝臟表面形態(tài)和膽總管寬度。

1.6 病理學(xué)檢查 取大鼠肝臟和肺臟組織各約1 cm3，常規(guī)脫水、包埋、切片，行HE染色，光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 大鼠HPS動物模型建立成功 在膽總管結(jié)扎術(shù)后4～6 w，動物形成肝硬化，部分并發(fā)HPS。在術(shù)后3 d，對照組動物活動量基本恢復(fù)，而實(shí)驗(yàn)組大鼠活動遲緩，并逐漸出現(xiàn)毛發(fā)失去光澤、皮膚和尿液變黃(圖4)、體質(zhì)量下降。至2 w后，這種現(xiàn)象更加顯著。術(shù)后1、2、3、5、6 w分別處死兩組大鼠各2只，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組動物肝臟逐漸增大，質(zhì)地變硬，至4 w時膽總管擴(kuò)張、增寬，表面見纖維條索并出現(xiàn)顆粒樣結(jié)節(jié)(圖5)。在6 w后，大鼠活動后氣促、呼吸困難，部分大鼠出現(xiàn)腹腔積液(圖6)；10只對照組大鼠均無死亡，而術(shù)后3 d、7 d和10 d，30只實(shí)驗(yàn)組大鼠死亡11只(27.5%)。死亡原因包括麻醉意外、腹腔出血、膽管破裂、急性肝衰竭。

圖4 術(shù)后1w大鼠精神萎靡，活動遲緩，尿色加深

圖5 術(shù)后5 w肝臟表面粗糙不平，并見顆粒樣結(jié)節(jié)

圖6 術(shù)后4周見腹腔積液

2.2 兩組肝功能和肝纖維化指標(biāo)比較 實(shí)驗(yàn)組大鼠隨膽管結(jié)扎時間的延長，血清TBIL逐漸升高，術(shù)后2 w達(dá)高峰，以后膽紅素仍緩慢升高。血清AST和ALT逐漸升高，第3 d達(dá)峰值，隨后稍有下降，2 w后平穩(wěn)，至4～6 w呈下降趨勢。術(shù)后第1 d血清HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C水平逐漸升高，至4 w達(dá)到峰值，以后逐漸平穩(wěn)；對照組動物血清肝功能指標(biāo)無顯著變化。

2.3 大鼠HPS建模成功 在術(shù)后1 w、2 w、4 w和6 w，動態(tài)觀察血?dú)夥治鼋Y(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組動物動脈血PaO2顯著低于對照組，而PaCO2逐漸升高，血漿NO水平在術(shù)后1 w逐漸升高，至4 w達(dá)到峰值，顯著高于對照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 各組動脈血?dú)夥治龊脱獫{NO水平比較

2.4 腹部超聲檢查情況 腹部超聲檢查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1 w動物肝臟回聲增粗，膽總管輕度擴(kuò)張；在術(shù)后2 w，肝臟被膜不平整，膽總管顯著增粗；在術(shù)后4～6 w，肝臟被膜不平整，部分表面可見小結(jié)節(jié)形成，膽總管顯著增寬，并可見腹腔積液。

2.5 組織病理學(xué)表現(xiàn) 在4 w后，可見實(shí)驗(yàn)組動物肝組織炎癥細(xì)胞浸潤，纖維條索和部分假小葉形成(圖7)；在6 w后，肺臟組織見肺微血管顯著擴(kuò)張(圖8)。

圖7 肝組織病理學(xué)變化 在術(shù)后4 w，實(shí)驗(yàn)組動物肝組織炎細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞排列紊亂，結(jié)締組織增生，部分假小葉形成(HE，400×)

圖8 肺組織病理學(xué)變化 在術(shù)后6 w，肺組織微血管擴(kuò)張，可見少量紅細(xì)胞位于肺泡壁及其腔內(nèi)(HE，400×)

3 討論

HPS是終末期肝硬化最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其病因目前不清，治療效果差，病死率高。目前，HPS的發(fā)病機(jī)制已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。對于HPS的發(fā)病機(jī)制研究主要集中在動物實(shí)驗(yàn)上，因此一個良好的動物模型的建立顯得至關(guān)重要。HPS必將要經(jīng)歷肝硬化階段，目前對于肝硬化動物模型的建立包括四氯化碳、二乙基亞硝胺等化學(xué)毒物[6]、化學(xué)致癌物、血吸蟲、手術(shù)等，還有報道將不同濃度的四氯化碳注射聯(lián)合飲用乙醇誘導(dǎo)大鼠肝肺綜合征模型，可顯著提高肝硬化模型的造模成功率[7]，但真正能誘導(dǎo)形成HPS的只有膽總管結(jié)扎術(shù)[8]。

自1872年首次應(yīng)用膽總管手術(shù)建立動物模型以來，一直被推舉為研究進(jìn)行性肝損傷的經(jīng)典模型。憑借簡單、快速、有效等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于進(jìn)行性肝病的多方面研究[9,10]。膽總管結(jié)扎術(shù)也是HPS模型誘導(dǎo)的經(jīng)典術(shù)式，并被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究[11]，具有造模周期短、穩(wěn)定率好等特點(diǎn)。結(jié)扎方法包括單純結(jié)扎肝外膽管法、膽管結(jié)扎后切斷法和逆行性注入N-丁基-2-氰基丙烯酸鹽法三種方法[12-14]。我們的研究認(rèn)為，一般大鼠在膽總管結(jié)扎術(shù)后膽總管進(jìn)行性擴(kuò)張，在2周后形成肝纖維化，4周形成肝硬化，而在6周左右形成HPS模型，大鼠死亡率為27.5%，死亡原因有麻醉意外、腹腔出血、膽管破裂、急性肝衰竭等。HPS模型的建立對于無動物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)的研究者來說較為困難，需不斷地摸索。我們認(rèn)為需注意以下幾點(diǎn)：(1)需有備用大鼠，以防大鼠死亡較多，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程；(2)大鼠難抓，我們用礦泉水瓶自制了捕鼠器，可以很好地解決這個問題；(3)多主張腹腔麻醉，以水合氯醛為首選，經(jīng)濟(jì)易得且效果好；(4)在膽總管結(jié)扎后，不建議離斷膽總管，否則容易引起膽管破裂后腹膜炎，影響觀察，或切斷膽管后出現(xiàn)嚴(yán)重的膽汁淤積，引起急性肝壞死，動物死亡率高[15]。因此，只建議用手術(shù)縫線緊密雙重結(jié)扎即可，膽管再通發(fā)生率非常低；(5)術(shù)后第1天非常重要，大鼠很容易死亡，需加強(qiáng)保暖和觀察。

在膽總管結(jié)扎術(shù)后，隨著時間的延長，實(shí)驗(yàn)組大鼠逐漸出現(xiàn)一系列與膽汁淤積性肝硬化患者相似的癥狀、體征和血清學(xué)改變。我們的研究發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩、尿色變黃、毛發(fā)黃染無光澤，在4周后部分實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)腹腔積液。血清膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行性升高，在2周后達(dá)到高峰，在4周后趨于平穩(wěn)，血清肝纖維化指標(biāo)逐漸升高，證明膽總管結(jié)扎引起了進(jìn)行性肝臟損害，與既往文獻(xiàn)報道相一致[16-18]。

大鼠HPS建模成功的重要指標(biāo)包括動脈血?dú)夥治鎏崾镜脱跹Y,血漿NO水平升高[19],組織病理學(xué)見肺微血管擴(kuò)張。其中低氧血癥是重要的標(biāo)志性指標(biāo)，但低氧血癥的基礎(chǔ)是肺微血管擴(kuò)張[20]，而各種原因引起的NO增多是其發(fā)生發(fā)展的重要原因[21，22]。我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。在膽總管結(jié)石術(shù)后4周，肝臟組織病理學(xué)表現(xiàn)為炎細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞排列紊亂、假小葉形成，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)張，證明肝硬化形成。在6周時，大鼠行動遲緩，呼吸困難，動脈血氧分壓顯著下降，二氧化碳分壓升高，血漿NO水平進(jìn)行性升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時，我們的實(shí)驗(yàn)還表明，在HPS模型形成過程中，彩色多普勒超聲同樣是一個重要的檢測手段，具有微創(chuàng)、準(zhǔn)確、快速、方便等特點(diǎn)。它可動態(tài)觀察大鼠肝臟和膽總管的變化情況。