賴蔚文，戴 閩，戴 玥

(1.南昌大學第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000；2.贛州市于都縣人民醫(yī)院，江西 贛州 342300)

成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，在骨基質的合成、分泌和礦化中起到重要的作用[1]。成骨細胞的功能很大程度上取決于成骨細胞的成熟度和成骨細胞的狀態(tài)[2]。所以成骨細胞功能多用于骨質疏松的臨床評價中。阿倫磷酸鈉作為治療骨質疏松的一線藥物，可以有效降低老年患者脊柱、髖部和非脊柱部位骨折的風險[3]。因此，本文主要探討阿倫磷酸鈉通過對成骨細胞的影響，從而為骨質疏松治療方案提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料：本研究實驗材料及試劑見表1所示。

1.2方法：以6個月齡的20只SD大鼠作為實驗研究對象，隨機分為阿侖膦酸鈉組B(n=10)和空白對照組(n=10)。空白對照組大鼠每日灌胃生理鹽水，阿侖膦酸鈉組B大鼠每日灌胃阿侖膦酸鈉維D3的水溶液，劑量按照人鼠體表面積折算，劑量為 3.5 ml/(kg·d)。采用雙能X線吸收法(DXA)分別于治療前、治療后26周和治療后52周，測量大鼠腰椎L2～4、股骨頸、大轉子與全髖關節(jié)4個部位的骨密度值，并比較治療前后各部位骨密度的變化。選擇Ⅱ型膠原酶處理SD級大鼠(24 h以內)，分離大鼠的顱骨，得到成骨細胞。在0.25%胰蛋白酶的消化傳代進一步培養(yǎng)，得到二代細胞。隨后取第二代成骨細胞，接種，細胞80%融合后棄去培養(yǎng)基；①換加入不同濃度阿侖膦酸鈉(1.0×10-10～1.0×10-4)的無血清DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24 h、36 h、48 h，加入MTT溶液20 μl，于37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄去上層溶液，加入DMSO試劑150 μl，輕輕振蕩混勻，10 min后，用酶標儀測定490 nm波長下每孔的吸光度，確定不同濃度阿侖膦酸鈉對成骨細胞增值促進、抑制作用；②換加含不同濃度阿侖膦酸鈉溶液(0mol/L、1.0×10-7mol/L～1.0×10-4mol/L)的無血清DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)48 h、72 h。棄培養(yǎng)基，以PBS清洗，加入0.1%Ttiton×100溶液250 μl。10 min后收集裂解液，取上清液，采用對硝基苯膦酸二鈉法測定細胞堿性膦酸酶活性。本次研究經過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

表1 實驗材料與實驗試劑

2 結果

2.1用MTT法測定阿侖膦酸鈉對大鼠成骨細胞增殖的影響:MTT檢測結果顯示：在24 h、36 h、48 h時，與空白組相比較，濃度為1.0×10-5mol/L和1.0×10-4mol/L的阿侖膦酸鈉對成骨細胞的增殖有抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。1.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L的阿侖膦酸鈉對成骨細胞的增殖有促進作，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。1.0×10-8mol/L增殖作用最強有非常顯著性差異，有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表2。

2.2成骨細胞分化實驗結果:1.0×10-5mol/L和1.0×10-6mol/L濃度的阿侖膦酸鈉藥物可使大鼠成骨細胞的堿性磷酸酶活性提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表3。

2.3骨密度值測定結果:與治療前對比，阿侖膦酸鈉組B治療26周時，骨密度明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=3.143，P<0.05);治療52周時，骨密度升高顯著，差異有統(tǒng)計學意義(F=9.719，P<0.00)。與空白對照組比較，在治療26周時，兩組骨密度具有明顯差異，有統(tǒng)計學意義(F=4.171，P<0.05);在治療52周時，兩組骨密度亦差異顯著，有統(tǒng)計學意義(F=4.946，P<0.05)。見表4。

表2 不同濃度的阿侖膦酸鈉溶液在作用24 h、36 h、48 h后對大鼠成骨細胞增殖的影響

表3 阿侖膦酸鈉作用48 h、72 h對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響(金氏單位/克蛋白，

表4 予以阿侖膦酸鈉治療前后腰椎L2-4、股骨頸、大轉子與全髖關節(jié)4個部位的骨密度值比較

3 討論

阿侖膦酸鈉( Alendronate，ALN)是第三代雙膦酸鹽類藥物，能夠減少骨量丟失、增加骨密度從而達到預防骨質疏松性骨折的作用，是目前臨床治療骨質疏松癥的一線用藥[4]。過去臨床上對骨質疏松癥的研究中，多采用抑制破骨細胞功能的方式來增加骨密度，但抑制破骨細胞功能可能產生不良后果，所以臨床研究中探究成骨細胞功能對預防和治療骨質疏松為主要方向[5]。阿侖膦酸鈉在一定濃度可促進成骨細胞增殖、增強ALP活性，是治療骨質疏松的主要藥物[6]。本次研究中以不同濃度的阿倫磷酸鈉分析對成骨細胞的增殖分化及骨密度的影響，目的在于為臨床治療骨質疏松提供有效參考依據(jù)。

本研究通過將Ⅱ型膠原酶處理大鼠(24 h以內)，并分離大鼠的顱骨，得到成骨細胞。在0.25%胰蛋白酶的消化傳代進一步培養(yǎng)，得到二代細胞。采用鈣鈷法對成骨細胞進行堿性磷酸酶染色，了解阿侖膦酸鈉對于成骨細胞活性的影響，并探究不同濃度的阿侖膦酸鈉對于大鼠成骨細胞的增殖分化情況，阿侖磷酸鈉對SD大鼠骨密度值的影響。研究指出，阿侖膦酸鈉能夠誘導成骨細胞增殖分化。濃度為1.0×10-5mol/L和1.0×10-4mol/L的阿侖膦酸鈉能夠抑制成骨細胞的增殖作用；濃度為1.0×10-7mol/L、1.0×10-6mol/L的阿侖膦酸鈉對成骨細胞的增殖有促進作用；濃度為1.0×10-8mol/L的阿侖膦酸鈉增殖作用最強有非常顯著性差異；阿侖膦酸鈉有利于提高大鼠的骨密度。

綜上所述，阿侖膦酸鈉能夠誘導成骨細胞增殖分化，提高大鼠的骨密度。