馬紫恒　趙鵬翔　馬雪梅　謝飛

摘要：布魯氏菌病是世界公認的危害較為嚴重的人畜共患傳染病之一。由于該病防治相對困難，在我國發(fā)病形勢尤為嚴峻。盡管我國對于布魯氏菌病防治采取了積極的措施，但仍然面臨著巨大挑戰(zhàn)。因此，認清布魯氏菌病的病原學特征、傳播途徑以及自然史等流行病學特征，并了解當前布魯氏菌病的診斷、治療以及預防現(xiàn)狀，對于預防布魯氏菌病的發(fā)生、減少布魯氏菌病對農(nóng)業(yè)及人類造成的健康財產(chǎn)損害有著重要意義。

關鍵詞：布魯氏菌病;病原學;流行病學;診斷;防治

中圖分類號：S855.1;R183.9文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2021）01-0028-05

作者簡介：馬紫恒（1989—），男，河北承德人，碩士研究生，主要從事分子生物學檢測方向研究。E-mail：maziheng@s-sbio.com。

通信作者：馬雪梅，博士，研究員，博士生導師，主要從事氫分子生物學方向研究。E-mail：xmma@bjut.edu.cn。

布魯氏菌病是《中華人民共和國傳染病防治法》與《中華人民共和國動物防疫法》中的乙類傳染病，也是世界普遍公認的危害較為嚴重的人畜共患病之一。世界上有170多個國家和地區(qū)存在布魯氏菌病的發(fā)生和流行[1]，據(jù)統(tǒng)計全球每年約有50萬布魯氏菌病新增病例，然而此病發(fā)病早期不易與其他發(fā)熱性疾病相鑒別，許多本病患者易被誤診為其他疾病，因此，該病實際的發(fā)病率要高出10～25倍[2]。布魯氏菌可侵犯人體各個系統(tǒng)，常合并導致關節(jié)炎和脊柱炎等，還可引起睪丸、子宮等生殖器官炎癥，造成人類不孕不育[3]。盡管人類布魯氏菌病患者病死率比較低（<1%），但由于不明確診斷或急性期治療不徹底，該病將轉為長期慢性病，導致患者常年乏力，臥床不起，給患者造成沉重的家庭經(jīng)濟負擔。2018年我國布魯氏菌病發(fā)病率位居第8，僅次于肝炎、肺結核、梅毒和細菌性痢疾等。另外，布魯氏菌還會通過感染牛、羊、豬等牲畜，造成大量牲畜流產(chǎn)、死胎等，給農(nóng)業(yè)帶來巨大損失，據(jù)統(tǒng)計，全世界每年因布魯氏菌病造成的農(nóng)業(yè)損失近30億元[4]。因此，我國高度重視該病的檢測、預防和控制，然而布魯氏菌病多數(shù)為隱性感染，在自然感染的診斷上經(jīng)常被忽略，進而使得我國對于布魯氏菌病的防治面臨巨大挑戰(zhàn)，有待于進一步提升對布魯氏菌的病原學研究以及診斷手段，進而控制其發(fā)病風險。筆者綜述了目前布魯氏菌病的病原學、流行病學及防治研究進展，以期為指導其防控提供一定的理論依據(jù)。

1病原學與流行病學

1.1病原學

布魯氏菌屬（Brucella）細菌大小為（0.5～0.7）μm×（0.6～1.5）μm，初次分離時多呈球狀、球桿狀和卵圓形，傳代培養(yǎng)后漸呈短小桿狀，不活動、微小，是革蘭氏陰性的多形性球桿菌。在顯微鏡下涂片觀察多為單個分散，組織涂片或滲出液中常集結成團，且可見于細胞內(nèi)，培養(yǎng)物中多單個排列。布魯氏菌屬于α-變形菌群中的布魯氏菌屬，專性需氧，無鞭毛以及天然質粒，形成芽孢，一般無莢膜，毒力菌株可有菲薄的莢膜，用改良Ziehl-Neelsen方法染色后鏡檢，布魯氏菌菌體染成紅色，背景為藍色，可作為其鑒別染色法之一。布魯氏菌不含有外毒素等毒力因子以及抗原變異性，這與大多數(shù)胞內(nèi)寄生病原體不同，且是該菌能夠躲避宿主防線成功入侵宿主并在其中進行復制的原因。布魯氏菌逃避宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視主要歸結于其非經(jīng)典的脂多糖（lipopolysaccharide，簡稱LPS），由脂質A、核心寡糖和O-抗原多糖（OPS）組成，該結構不具有強內(nèi)毒素活性，其中O-抗原多糖介導病原體與細胞表面特異性受體的相互作用，保護布魯氏菌免受殺菌肽和補體引發(fā)的裂解作用。另外，非經(jīng)典的LPS結構在布魯氏菌發(fā)揮毒力的過程中起到核心作用，該結構可能是逃避宿主免疫應答的策略之一，且可能部分解釋了造成慢性感染宿主中細胞免疫水平的相對抑制[5]。

依據(jù)宿主偏好性的不同，布魯氏菌分為6個經(jīng)典種，根據(jù)生物學特性又將其分為19個亞型，分別為B.melitensis（羊種，主要感染綿羊和山羊，包括1、2、3亞型）、B.abortus（牛種，包括1、2、3、4、5、6、7、9亞型）、B.suis（豬種，包括1、2、3、4、5亞型）、B.canis（犬種）、B.neotomae（沙林鼠種）、B.ovis（綿羊附睪種）。最近先后又鑒定到5個新種，分別為B.microti（田鼠型）、B.pinnipediae（鰭型）、B.cetacea（鯨型）、B.vulpis（狐貍型）和B.inopinata（人類）。此外，還有從兩棲類動物中分離出布魯氏菌的報道[6]。目前，我國已經(jīng)分離到了布魯氏菌的6個經(jīng)典種及其所有亞型。

1.2流行病學

在布魯氏菌病的流行病學調查中，人對多種布魯氏菌病原體易感，其中主要感染牛種、羊種及豬種布魯氏菌，極個別報道人感染犬種布魯氏菌的病例。人類患者在發(fā)病期間可通過汗液向體外排菌，但布魯氏菌病罕見在人間傳播。在我國動物布魯氏菌病主要由羊種和牛種生物型引起，其次為豬種生物型，犬種生物型感染人的病例極少。有證據(jù)顯示，當羊種生物型為感染的主要型別時，伴隨著人布魯氏菌病的廣泛流行，而當牛種生物型為感染的主要型別時，布魯氏菌病多以散發(fā)為主。因此人類流行性布魯氏菌病中綿羊和山羊為主要傳染源，人類主要散發(fā)性布魯氏菌病傳染源則是牛和豬[7]。布魯氏菌在自然環(huán)境中生活力較強，在自然環(huán)境中可存活2～150d，尤其是在病畜分泌物、排泄物以及死畜的臟器中能存活達到4個月左右。布魯氏菌在陽光直射下仍可存活4h，但布魯氏菌對濕熱抵抗力不強，在水中，60℃加熱30min或70℃加熱5min即被殺滅，煮沸則立即死亡。對常用的化學消毒劑如2%苯酚、來蘇爾、氫氧化鈉溶液或0.1%的氯化汞等較敏感，均可在1h內(nèi)被殺死，而0.01%苯扎溴銨只用5min就能殺滅該菌[8]。另外，強酸性環(huán)境即當pH值低于3.5時會導致菌體迅速死亡。

在自然界中，布魯氏菌通過消化、呼吸、交配、黏膜接觸甚至昆蟲叮咬等方式傳播，并可感染人等60余種動物[9]。盡管布魯氏菌可以通過多種途徑感染，但是不同感染途徑的感染率存在差異，總體來說對于破損的皮膚黏膜最為易感，而消化途徑感染難度高于交配、其他部位黏膜接觸等[8]。通常動物對同種布魯氏菌最為易感，部分種型布魯氏菌可在動物之間轉移。如羊種布魯氏菌除了易感染山羊和綿羊外，還可感染豬、牛等。病原菌通過病畜或帶菌動物的乳汁、糞便、尿液和精液等分泌物以及排泄物被排出，尤其是妊娠母畜在流產(chǎn)或分娩時，胎兒、羊水、胎衣中攜帶大量布魯氏菌，成為主要傳染源，進而污染草場、畜舍、飲水等環(huán)境，使其他健康的牲畜被感染，最終導致病原菌四處擴散。

在家畜中布魯氏菌也以感染羊、牛、豬最為重要，羊種布魯氏菌對牲畜的侵襲力和致病性都較強，所引起的疫情較重，多數(shù)羊種布魯氏菌易引起人畜間布魯氏菌病暴發(fā)和流行。牛種菌生物型相比羊種菌毒力較弱，對人的致病性較輕，往往造成感染率高而發(fā)病率低，但是對牲畜尤其是牛的危害較大，嚴重影響當?shù)匦竽翗I(yè)發(fā)展，豬種布魯氏菌毒力及侵襲力介于羊種和牛種之間。犬種布魯氏菌主要引起犬、貓、牛等動物感染，極少感染人，且危害較輕[10]。

2布魯氏菌病診斷和防治現(xiàn)狀

2.1布魯氏菌病的血清學診斷

由于布魯氏菌危險性強，且培養(yǎng)困難、分離率低、耗時長等問題，布魯氏菌的病原學檢測在實際臨床應用中較少[11]。血清學診斷是當前布魯氏菌診斷和檢疫的主要手段，根據(jù)檢測目的與方式可初步分為初篩檢測與確診檢測。血清學檢測方法多樣，主要包括各種凝集反應例如試管凝集反應（SAT）、培養(yǎng)皿凝集試驗（PAT）、虎紅培養(yǎng)皿凝集反應（RBPT）、全乳環(huán)狀試驗（CYT）等，以及補體結合試驗（CFT）和酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和膠體金免疫層析檢測技術（GICA）等，但目前不同方法均存在一定的不足[12]。實驗室常用的初篩手段包括RBPT、GICA、ELISA等。布魯氏菌病的確診檢測方法包括SAT、CFT、抗人球蛋白試驗（Coombstest）。

布魯氏菌病初篩方法中，RBPT因其操作簡單、敏感性強、耗時短、成本低等特點被廣泛用作人與動物血清的布魯氏菌感染大范圍篩選試驗及流行病學的研究。然而由于初篩方法假陽性率相對較高，易于與部分其他革蘭氏陰性菌發(fā)生交叉反應，因此，往往須要通過確診檢測方法進行復核。相比初篩方法，布魯氏菌病的確診方法普遍特異性和準確度較高，然而其操作復雜、檢測耗時長且對操作人員要求較高[13]。在實際應用中，常與初篩方法配合檢測，作為初篩檢測陽性后的分流確診。如國內(nèi)常用RBPT進行現(xiàn)場或牧區(qū)的大規(guī)模檢疫，以SAT和CFT進行實驗室最后確診，其中CFT相較于其他血清學檢測方法有一定的優(yōu)點，如靈敏度高，能測定0.05μg/mL的抗體，與間接凝集法的靈敏度相當，且可用于檢測多種類型的抗原或抗體，試驗條件要求低，不需要特殊儀器或只用光電比色計即可。因此，常被用來對SAT和RBPT檢測為陽性或可疑的病例進行定性檢測，CFT檢測被國際貿(mào)易指定用于牛、羊、綿羊附睪種布魯氏菌病診斷的確診試驗。ELISA對標本中布魯氏菌抗體的檢測敏感性比SAT和CFT高，尤其在對慢性患者診斷時ELISA比SAT有更高的敏感性[14]。但是，對于急性期患者，RBPT的檢測結果與ELISA結果相一致，且RBPT檢測費用更低。GICA相比于SAT檢測具有更多的優(yōu)勢，如靈敏度高、特異強、血清用量少、簡便快速等，且在檢測結果上二者無統(tǒng)計學意義上的差別。GICA適合于布魯氏菌病多種方面的檢測，如臨床診斷、流行病學調查、現(xiàn)場檢測、人布魯氏菌病的監(jiān)測，具有較好的應用前景。

凝集反應檢測布魯氏菌病存在的一大缺點即無法鑒別布魯氏菌與其他革蘭氏陰性菌的交叉感染，由于凝集試驗通過檢測抗布魯氏菌LPS-O鏈的抗體進行診斷，而布魯氏菌的LPS-O鏈是多種革蘭氏陰性菌的共同抗原。布魯氏菌血清學診斷主要通過檢測患者體內(nèi)免疫球蛋白M（IgM）抗體的滴度，為臨床提供可靠的診斷。然而由于血清學檢測不能直接檢測布魯氏菌病原，以及易與其他革蘭氏陰性菌（主要是耶爾辛氏菌O：9型）發(fā)生交叉反應等因素，使得其特異性、準確度、靈敏度等方面都存在缺陷[15]。此外，血清學診斷的最大缺陷是很難對自然感染與人工免疫產(chǎn)生進行區(qū)分，因此新的檢測方法還須要進一步研究。

目前，國內(nèi)外對于布魯氏菌病的血清學診斷方法多樣，然而各診斷方法均具有一定的自身局限性，需要多種方法相結合進行確診。此外血清學診斷方法難以對布魯氏菌病的治療效果進行評價。因此，目前對于布魯氏菌病診斷亟待解決的問題是開發(fā)特異性高、靈敏度高、且能夠對布魯氏菌進行型別鑒定的檢測手段。

2.2布魯氏菌病的分子診斷

相比于血清學檢測，分子生物學診斷技術以其極高的特異性和靈敏度等優(yōu)勢得以廣泛地應用于病原體感染的檢測。布魯氏菌分子診斷技術主要有分子雜交、各種類型的PCR以及PCR反應后的產(chǎn)物分析等。其中PCR檢測技術以其快速、操作簡便等優(yōu)勢迅速成為分子檢測中的重要技術，且靈敏度與特異性極高從而被廣泛地用于病原體的檢測。Feteke等首次報道了聚合酶鏈式反應（PCR）技術在布魯氏菌病診斷中的應用，通過對布魯氏菌外膜蛋白43ku基因的部分序列進行擴增，獲得635bp的擴增產(chǎn)物;這種方法對布魯氏菌所有種擴增獲得相同的結果，且非常敏感（低于100個細菌）[16]。之后16SrRNA、VirB7、插入序列IS711、per基因等先后被證實可以靈敏特異地用于布魯氏菌的PCR檢測[17]。

布魯氏菌分子生物學診斷技術另一個主要應用就是可以實現(xiàn)其在型別方面的區(qū)分和鑒定，Vemulapalli等建立了一個能夠鑒別疫苗株RB51和S2308的PCR方法[18]。Cloeckaert等使用限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物與特異性PCR-RFLP鑒別指紋圖譜相結合的方法，對布魯氏菌omp2A和omp2B基因差異序列進行分析，能夠將大多數(shù)布魯氏菌種和生物型進行區(qū)分和鑒別[19]。由于布魯氏菌不同種型間的基因序列高度同源，布魯氏菌的分子分型是布魯氏菌當前研究的難點和熱點，因此在不斷的研究優(yōu)化中又出現(xiàn)了多種方法，可以對布魯氏菌進行種型的鑒別，還可以區(qū)分野毒株與疫苗株，此外更是鑒別出了一些6個經(jīng)典種之外布魯氏菌，如海洋布魯氏菌等[20]。利用布魯氏菌可變數(shù)量串聯(lián)重復序列（VNTR）的多態(tài)性，建立的多位點可變數(shù)量串聯(lián)重復序列分析（MLVA）和多位點序列分析（MLSA）除了可以用于布魯氏菌分離株的鑒別，還可以進行遺傳關系分析[21]。

目前，以PCR方法為代表的分子診斷技術在致病微生物的檢測應用方面比較成熟，并具有明顯的優(yōu)勢，而且對于布魯氏菌的分種分型、布魯氏菌的毒力基因等檢測以及流行病學追蹤和溯源都有著不可替代的地位。在WS269—2019《布魯氏菌病診斷》標準中也加入了布魯氏菌的PCR檢測。其中通過BCSP31基因對布魯氏菌屬進行檢測，同時通過對AMOS-PCR的擴增產(chǎn)物進行電泳，可根據(jù)條帶進行羊種、牛種（1、2、4型）、豬種1型以及綿羊附睪種布魯氏菌進行鑒定。同時，通過對布魯氏菌進行定量檢測還可以監(jiān)測病情治療進展。布魯氏菌病分子診斷的最主要限制是其相對較高的檢測成本以及較嚴格的儀器和試驗條件，因此當務之急仍是開發(fā)簡易、低成本的布魯氏菌分子檢測方法。

2.3布魯氏菌病治療

根據(jù)布魯氏菌的特點，患者在確診感染布魯氏菌后，應該盡早進行治療，為防止復發(fā)以及慢性化，還須要聯(lián)合、足量、足療程用藥，必要時延長療程。國內(nèi)外均推薦以多西環(huán)素聯(lián)合利福霉素類藥物的治療手段作為人布魯氏菌病急慢性期的首選治療方式，療程為8周。對于難治性病例，可使用其他藥物，包括磺胺類、喹諾酮類、三代頭孢類等藥物[22]。單獨用藥或者聯(lián)合應用治療效果并不相同，如世界衛(wèi)生組織（WHO）數(shù)據(jù)顯示短期治療（30d以內(nèi)）的失敗率和復發(fā)率均高于長期（6周以上），且單藥治療的失敗率高于聯(lián)合用藥。如多西環(huán)素聯(lián)合利福平治療效果低于喹諾酮類聯(lián)合利福平，但是后者治療費用更高[23]。在一些特殊情況中，特別是在懷孕、患者免疫力低下或伴隨并發(fā)癥等情況下，應在基礎治療的同時對并發(fā)癥進行治療，同時對特殊人群進行調整用藥。如在布魯氏菌病合并睪丸炎病例抗菌治療同上，可短期加用小劑量糖皮質激素。對于出現(xiàn)布魯氏菌病引起的并發(fā)癥，如脊椎炎、關節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等其他器官或組織膿腫患者，可聯(lián)合使用3種藥物治療，如在多西環(huán)素和利福平聯(lián)合應用的基礎上加入三代頭孢類藥物，同時給予對癥治療甚至外科干預。對于特殊人群如孕婦和兒童可選用利福平聯(lián)合磺胺類藥物治療，對于妊娠12周以內(nèi)的孕婦須選用三代頭孢菌素類藥物聯(lián)合復方新諾明治療[24]。

在布魯氏菌病治療期間，患者須要注意休息及補充營養(yǎng)，以提高機體免疫力，同時由于多西環(huán)素、利福平等藥物副作用較大，用藥期間須監(jiān)測血常規(guī)、肝腎功能等。布魯氏菌屬于細胞內(nèi)寄生菌，殺滅難度大。布魯氏菌病的治療是個長期的過程，且療效差、易復發(fā)。有報道顯示，臨床治愈后4個月以上的患者布魯氏菌核酸檢測仍可呈陽性[25]。因此，還須要開發(fā)新的藥物來進一步提高布魯氏菌病的治愈率并縮短治療療程。

2.4布魯氏菌病疫苗現(xiàn)狀

布魯氏菌病疫苗的研制一直是布魯氏菌病防控的研究熱點。目前，仍然缺乏安全的人用布魯氏菌疫苗，只有在極少數(shù)國家和地區(qū)曾用牛布魯氏菌苗BA-219和104M活疫苗預防人布魯氏菌病，但是由于存在毒力返強的危險，很快被停止使用[26]。畜用的疫苗主要是采用減毒活菌苗和滅活菌苗，已開發(fā)的畜用減毒活菌疫苗主要應用于牛、豬、羊等，如牛布魯氏菌苗S19、豬布魯氏菌苗S2、羊布魯氏菌苗M5和Rev-1、粗糙型牛布魯氏菌苗RB51等，畜用滅活苗有牛布魯氏菌45/20、羊布魯氏菌53H38等。其中滅活疫苗的安全性高，且便于儲存運輸，但是保護時間短，且由于滅活后的菌體不能繁殖，誘導免疫較差[27]。減毒活疫苗相比滅活疫苗，可以提供更持久的保護力[28]，且成本更低，是當前的主要應用疫苗。如羊布魯氏菌苗Rev-1可預防綿羊和山羊的布魯氏菌病，該疫苗在歐洲使用廣泛。我國廣泛使用的（牛羊）疫苗S2，具有毒力穩(wěn)定的特點，一般為口服免疫，其保護率高于Rev-1和53H38[29]。M5疫苗具有免疫原性好的優(yōu)點，通常可通過皮下、肌肉、口服等多種免疫途徑，并且該疫苗制備了單克隆抗體，因此，可鑒別由M5疫苗接種感染或自然感染的動物，但其缺點是會導致牲畜流產(chǎn)，可引起接觸氣霧的人較嚴重的反應，且經(jīng)豚鼠傳代后菌株毒力升高[30]。粗糙型牛布魯氏菌苗RB51對牛具有良好的保護力，由于這種粗糙型菌株LPS缺少O鏈，因此用RB51疫苗免疫后的動物血清學檢測通常為陰性，可減少對布魯氏菌病診斷的干擾，但該疫苗在對牛以外的動物保護力較差[31]。

減毒苗持續(xù)存在于免疫動物體內(nèi)，通過不斷刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體，提供長效的保護力。然而活菌苗具有一定毒力，經(jīng)常發(fā)生疫苗免疫而產(chǎn)生的感染，且在不同物種間的保護力存在差異，又由于產(chǎn)生的抗體會帶來檢測的困難，難以對活菌苗的免疫效果進行監(jiān)測。此外，疫苗經(jīng)多次傳代后有毒力回升的現(xiàn)象，并對于治療布魯氏菌的常用藥物存在阻礙問題[32]。因此，開發(fā)毒力穩(wěn)定、安全、覆蓋范圍廣且免疫持續(xù)時間長的疫苗是布魯氏菌疫苗研發(fā)的挑戰(zhàn)。

組分疫苗通過布魯氏菌部分特異性蛋白或核酸組分免疫動物，產(chǎn)生一定的保護作用。組分疫苗的免疫原性強且不會出現(xiàn)菌體毒力增強現(xiàn)象，但同樣具有免疫期短的不足，此外組分疫苗由于不具有整體的菌體結構，很難產(chǎn)生綜合性免疫效果，此外組分疫苗的生產(chǎn)工藝要求高且相對復雜，成本較高[33]。目前，布魯氏菌的基因組已經(jīng)被深入研究，而利用布魯氏菌的特異性結構基因如外膜表面蛋白（OMP）及一些毒力因子（LPS、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等）開發(fā)基因工程苗也是布魯氏菌病疫苗研發(fā)的新的切入點。如通過分子生物學技術敲除1個或多個布魯氏菌毒力基因建立的基因工程弱毒活疫苗[34];Tabynov等通過將布魯氏菌的特異性免疫抗原組分整合到其他毒性較弱的載體細菌或病毒（A型流感病毒）的基因組中，并對懷孕的母牛產(chǎn)生了保護作用，展示了活載體疫苗在布魯氏菌病防控上的前景[35]。核酸疫苗通過將含有布魯氏菌保護性抗原以及增強免疫反應的細胞因子等編碼基因的重組質粒在人或動物細胞內(nèi)進行表達并刺激機體產(chǎn)生抗體來進行免疫，目前已有多種基因被研究可用于布魯氏菌核酸疫苗的開發(fā)，然而免疫效果還有待驗證[36]。

3結論

布魯氏菌病危害嚴重，又難以治愈，且尚無安全有效的人用疫苗進行防護。加之因為布魯氏菌的傳染源廣泛、傳播途徑多樣、以及在環(huán)境中有較強的適應能力等特性使得布魯氏菌的預防變得十分困難。此外，由于布魯氏菌病的致死率低，患病癥狀多不典型，導致人們對于布魯氏菌病還缺乏必要的重視，感染布魯氏菌后若沒有及時獲得準確的檢測和治療，極易發(fā)展成慢性布魯氏菌病而終生帶菌。因此，布魯氏菌病的防控須要跨學科協(xié)作[37]，如在公共教育領域加強對于布魯氏菌病的認知;在疾病控制領域同時根據(jù)其病原的特點，加強布魯氏菌病的防護意識，同時制定可靠的發(fā)病風險評估體系;在醫(yī)療領域積極開發(fā)新的布魯氏菌病檢測及防治方案，對布魯氏菌病的有效防控以及降低布魯氏菌病的危害有較實際的意義。

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