范智彥，劉金菊

（1.臨沂市第三人民醫(yī)院，山東 臨沂 276004；2.臨沂市腫瘤醫(yī)院，山東 臨沂 276004）

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，5年生存率較低，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。目前，肺癌的治療手段主要有手術(shù)、放療及化療，但腫瘤細(xì)胞易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳[2]。因此，尋找并開發(fā)低毒且高效的天然藥物尤為重要。紫甘薯屬旋花科一年生草本植物，富含天然花色苷?；ㄉ站哂锌寡趸⒖鼓[瘤和降血糖等作用，且無毒副作用[3-4]。研究顯示，紫甘薯花色苷可有效抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。但目前還未見紫甘薯花色苷影響肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的相關(guān)報(bào)道。KTN1-AS1是近年新發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），其在肺鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，且高表達(dá)的患者預(yù)后較差[6]。但目前KTN1-AS1對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展的影響還未知。因此，本研究以肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象，KTN1-AS1為切入點(diǎn)，探討了紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響及分子機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Statfax 4300全自動(dòng)酶標(biāo)儀（北京華泰和合商貿(mào)有限公司）；FACScan流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）；PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio RAD公司）。

1.2 材料

肺癌A549細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8），胰蛋白酶，LipofectamineTM2000試劑盒，二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒和Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；KTN1-AS1小干擾RNA（si-KTN1-AS1）及亂序無意義陰性序列（si-NC），KTN1-AS1過表達(dá)載體（pcDNA-KTN1-AS1），空載體（pcDNA，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；PCR引物（上海生工生物工程有限公司）；兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1），p21多克隆抗體（北京博奧森生物科技有限公司）；B淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（Bcl-2），B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白（Bax），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 紫甘薯花色苷的制備

參照文獻(xiàn)方法紫甘薯花色苷[7]。選取新鮮、無病蟲害、無腐爛的紫甘薯，自來水洗凈，晾干后切成薄片，置于干燥機(jī)中干燥，溫度50 ℃。干燥后粉碎，過80目篩。準(zhǔn)確稱取100 g紫甘薯粉，加入6000 ml蒸餾水，調(diào)整pH為6.0，加入50 g果膠酶，40 ℃水浴提取120 min。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥，得25 mg花色苷。超純水配制為濃度為10 mg/ml的花色苷母液，過濾除菌，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)培養(yǎng)基稀釋為所需濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

A549細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，將si-KTN1-AS1、si-NC、pcDNAKTN1-AS1和pcDNA分別轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，換為含10 % FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞分組

未進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作的A549細(xì)胞分為對(duì)照組、紫甘薯花色苷不同劑量組。其中對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；紫甘薯花色苷不同劑量組細(xì)胞分別用含紫甘薯花色苷終200，400，800 μg/ml[8]的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染si-KTN1-AS1、si-NC的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為si-KTN1-AS1組、si-NC組。轉(zhuǎn)染pcDNA-KTN1-AS1、pcDNA的細(xì)胞用紫甘薯花色苷終濃度為800 μg/ml的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，記為紫甘薯花色苷800 μg/ml+pcDNA-KTN1-AS1組、紫甘薯花色苷800 μg/ml+pcDNA組。

2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將A549細(xì)胞以0.5×104個(gè)/孔接種于96孔板中，按2.3項(xiàng)下步驟分組處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)后，加10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h后，采用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)吸光度值（A），計(jì)算細(xì)胞抑制率。抑制率（%）=（1-A實(shí)驗(yàn)組/ A對(duì)照組）×100 %。重復(fù)3次。

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將A549細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板中，按2.3項(xiàng)下步驟分組處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)后，收集細(xì)胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)細(xì)胞中KTN1-AS1表達(dá)

將A549細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板中，按2.3項(xiàng)下步驟分組處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)后，收集細(xì)胞。Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃3 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。引物序列：KTN1-AS1上游5'-GGGTCCAGGCTATACGAGAC-3'，下游5'-GGACAGTTGGAAGATGGTGC- 3'；內(nèi)參GAPDH上游5'-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3'，下游5'-CAAGGGGTCTACATGGCAAC-3'。2-ΔΔCt法計(jì)算KTN1-AS1表達(dá)水平。

2.7 蛋白印跡法（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞中cyclin D1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平

將A549細(xì)胞以每孔2.5×104個(gè)接種于24孔板中，按2.3項(xiàng)下步驟分組處理，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)后，收集細(xì)胞。RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法對(duì)蛋白定量后，行12 %十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。電泳后，將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏乙烯二氟（PVDF）膜，于5 %脫脂奶粉中封閉1 h。分別置于cyclin D1（1:1000）、p21（1:1000）、Bcl-2（1:800）、Bax（1:800）和GAPDH（1:1000）一抗孵育液中，4 ℃過夜。置于辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000）孵育液中，37 ℃孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS.22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 紫甘薯花色苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組比較，紫甘薯花色苷不同劑量組細(xì)胞抑制率升高（P＜0.05），cyclin D1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），p21蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性（P＜0.05）。見圖1、表1。

表1 紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）

表1 紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞增殖和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）

注：*P＜0.05 vs 對(duì)照組；#P＜0.05 vs 紫甘薯花色苷200 μg/ml組；&P＜0.05 vs 紫甘薯花色苷400 μg/ml組

分組 細(xì)胞增殖抑制率/% cyclin D1蛋白表達(dá)量 p21蛋白表達(dá)量對(duì)照組 0.00±0.00 0.58±0.04 0.27±0.03紫甘薯花色苷200 μg/ml組 18.37±1.64* 0.45±0.04* 0.41±0.04*紫甘薯花色苷400 μg/ml組 37.14±3.71*# 0.32±0.03*# 0.57±0.05*#紫甘薯花色苷800 μg/ml組 61.42±5.14*#& 0.20±0.02*#& 0.68±0.04*#&

圖1 紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞中cyclin D1和p21蛋白表達(dá)的影響

3.2 紫甘薯花色苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，紫甘薯花色苷不同劑量組細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖2、表2。

圖2 紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)及凋亡的影響

表2 紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）

表2 紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）

注：*P＜0.05 vs 對(duì)照組；#P＜0.05 vs 紫甘薯花色苷200 μg/ml組；&P＜0.05 vs 紫甘薯花色苷400 μg/ml組

分組 凋亡率/% Bcl-2蛋白表達(dá)量 Bax蛋白表達(dá)量對(duì)照組 7.10±0.68 0.75±0.06 0.15±0.02紫甘薯花色苷200 μg/ml組 12.87±1.23* 0.61±0.06* 0.26±0.02*紫甘薯花色苷400 μg/ml組 19.93±1.99*# 0.48±0.04*# 0.37±0.03*#紫甘薯花色苷800 μg/ml組 26.92±2.07*#& 0.28±0.03*#& 0.51±0.04*#&

3.3 紫甘薯花色苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞中KTN1-AS1表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，紫甘薯花色苷不同劑量組細(xì)胞中KTN1-AS1表達(dá)水平降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見表3。

表3 紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞中KTN1-AS1表達(dá)的影響（±s，n=9）

表3 紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞中KTN1-AS1表達(dá)的影響（±s，n=9）

注：*P＜0.05 vs 對(duì)照組；#P＜0.05 vs 紫甘薯花色苷200 μg/ml組；&P＜0.05 vs 紫甘薯花色苷400 μg/ml組

分組 KTN1-AS1表達(dá)量對(duì)照組 1.00±0.07紫甘薯花色苷200 μg/ml組 0.78±0.06*紫甘薯花色苷400 μg/ml組 0.63±0.04*#紫甘薯花色苷800 μg/ml組 0.48±0.04*#&

3.4 下調(diào)KTN1-AS1表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與si-NC組比較，si-KTN1-AS1組細(xì)胞中KTN1-AS1表達(dá)水平降低（P＜0.05），細(xì)胞抑制率、凋亡率及p21和Bax蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），cyclin D1和Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖3、表4。

圖3 下調(diào)KTN1-AS1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表4 下調(diào)KTN1-AS1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）

表4 下調(diào)KTN1-AS1表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）

注：*P＜0.05 vs si-NC組

Bax蛋白表達(dá)量si-NC 1.00±0.07 5.88±0.37 7.55±0.52 0.57±0.05 0.26±0.03 0.77±0.06 0.14±0.02 si-KTN1-AS1 0.53±0.05* 47.90±4.12* 19.63±1.54* 0.24±0.02* 0.63±0.04* 0.34±0.03* 0.47±0.04*分組 KTN1-AS1 細(xì)胞增殖抑制率/%凋亡率/%cyclin D1蛋白表達(dá)量p21蛋白表達(dá)量Bcl-2蛋白表達(dá)量

3.5 上調(diào)KTN1-AS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)紫甘薯花色苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與紫甘薯花色苷800 μg/ml+pcDNA組比較，紫甘薯花色苷800 μg/ml+pcDNA-KTN1-AS1組細(xì)胞抑制率、凋亡率及p21和Bax蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），KTN1-AS1及cyclin D1和Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見圖4、表5。

表5 上調(diào)KTN1-AS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）

表5 上調(diào)KTN1-AS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n=9）

注：*P＜0.05 vs 紫甘薯花色苷800 μg/ml+pcDNA組

Bax蛋白表達(dá)量紫甘薯花色苷800 μg/ml+pcDNA 1.00±0.06 62.28±5.10 27.52±2.52 0.19±0.02 0.69±0.05 0.27±0.03 0.52±0.04紫甘薯花色苷800 μg/ml+pcDNA-KTN1-AS1 2.78±0.25* 20.47±2.13* 14.47±1.42* 0.47±0.05* 0.35±0.03* 0.64±0.05* 0.23±0.02*分組 KTN1-AS1 細(xì)胞增殖抑制率/%凋亡率/%cyclin D1蛋白表達(dá)量p21蛋白表達(dá)量Bcl-2蛋白表達(dá)量

圖4 上調(diào)KTN1-AS1表達(dá)逆轉(zhuǎn)紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響

4 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)的常見腫瘤，具有較高的病死率，嚴(yán)重威脅人類生命健康。近年，肺癌的治療取得了一定進(jìn)展，但由于肺癌發(fā)病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后仍不佳。因此，尋找治療肺癌的新方法尤為重要。紫甘薯花色苷是從紫甘薯中獲得的天然色素，無毒、無異味，且性質(zhì)穩(wěn)定。研究顯示，紫甘薯花色苷具有抑菌[9]、抗氧化[10]等功效。但目前，紫甘薯花色苷在抗腫瘤方面的研究還很少見。

正常細(xì)胞增殖和凋亡處于動(dòng)態(tài)平衡，而惡性腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡平衡被打破，細(xì)胞無限增殖而凋亡降低。cyclin D1可促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖[11]。p21是一種腫瘤抑制因子，主要通過調(diào)控細(xì)胞周期維持細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖[12]。本研究顯示，紫甘薯花色苷可呈劑量依賴性降低肺癌A549細(xì)胞中cyclin D1蛋白表達(dá)，促進(jìn)p21蛋白表達(dá)，說明其可有效抑制A549細(xì)胞增殖。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗癌藥物發(fā)揮作用的一種途徑。細(xì)胞的凋亡受多種基因的調(diào)控，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax參與調(diào)控細(xì)胞凋亡[13]。Bcl-2主要位于線粒體膜和外膜，可通過抑制細(xì)胞色素C等促凋亡分子的釋放抑制細(xì)胞凋亡[14]。Bax可改變線粒體通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C等促凋亡分子的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究顯示，紫甘薯花色苷可劑量依賴性抑制提高A549細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞中中Bcl-2蛋白表達(dá)，而促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，表明紫甘薯花色苷可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明紫甘薯花色苷在一定程度上具有抗肺癌的作用，具有開發(fā)為治療肺癌藥物的潛在價(jià)值。

lncRNA是一類參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和分化等生命學(xué)過程的小分子非編碼RNA，與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[16-17]。研究顯示，KTN1-AS1在肝癌組織中表達(dá)升高，其高表達(dá)的患者預(yù)后不良，下調(diào)其表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖和集落形成，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]；KTN1-AS1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）中表達(dá)升高，其促進(jìn)HNSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，是HNSCC治療的潛在分子靶標(biāo)[19]。但KTN1-AS1對(duì)肺癌發(fā)生發(fā)展的影響還未知。本研究通過轉(zhuǎn)染KTN1-AS1小干擾RNA下調(diào)KTN1-AS1表達(dá)后，A549細(xì)胞增殖能力降低，凋亡加劇，表明下調(diào)KTN1-AS1表達(dá)可抑制A549細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示KTN1-AS1可能作為促癌基因參與肺癌發(fā)生發(fā)展，是肺癌治療的潛在分子靶點(diǎn)。本研究還顯示，紫甘薯花色苷可劑量依賴性抑制肺癌A549細(xì)胞中KTN1-AS1表達(dá)，而上調(diào)KTN1-AS1表達(dá)則逆轉(zhuǎn)了紫甘薯花色苷對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用及凋亡促進(jìn)作用，提示紫甘薯花色苷可能通過下調(diào)KTN1-AS1表達(dá)來抑制A549細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上，紫甘薯花色苷可劑量依賴性抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其可能通過下調(diào)細(xì)胞中KTN1-AS1表達(dá)發(fā)揮作用，可能為肺癌治療藥物的研發(fā)提供了新途徑。