白姣洋， 趙俊凝， 王 康， 陳茂華

西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，陜西 楊凌712100

葡萄花翅小卷蛾是影響世界葡萄產(chǎn)量和質(zhì)量的一種重要經(jīng)濟(jì)害蟲，2012年國家檢驗檢疫中心將其列入檢疫性有害生物名錄(牛春敬等，2013)。該蟲原產(chǎn)于意大利，后在地中海和歐洲地區(qū)迅速蔓延，現(xiàn)已擴(kuò)散至美洲阿根廷、智利、加利福尼亞等地區(qū)(Gilliganetal.，2011)。目前，我國尚未出現(xiàn)該蟲入侵的相關(guān)報道(李俊峰等，2017)。

葡萄花翅小卷蛾隸屬鱗翅目Lepidoptera卷蛾科Tortricinae，其幼蟲可取食多種經(jīng)濟(jì)作物的花和果實，寄主包括葡萄VitisviniferaL.、油橄欖OleaeuropeaL.、迷迭香RosmarinusoficinalisL.、鐵線蓮ClematisvitalbaL.、山茱萸Cornusspp.、忍冬LoniceraxylosteumL.、女貞LigustrumvulgareL.等在內(nèi)的40多種植物(Iroiattietal.，2011)，對不同寄主植物營養(yǎng)物質(zhì)和次生代謝物具有廣泛適應(yīng)性。目前葡萄花翅小卷蛾的控制主要依賴化學(xué)農(nóng)藥(Akyol & Aslan，2010; Ifoulis & Savopoulou，2004)，而殺蟲劑的長期使用導(dǎo)致該蟲對有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯等多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，造成該蟲防治困難(蘇莎等，2020; Pasquinietal.，2018)。

當(dāng)昆蟲遭遇植物防御性次生代謝物和農(nóng)藥等有毒外源化合物刺激時，其體內(nèi)的解毒酶會發(fā)生一系列變化，從而協(xié)助昆蟲消除這些化合物對其生長發(fā)育的不利影響(陳澄宇等，2015； 段辛樂等，2015； 吳有剛等，2019)。Hatipogluetal.(2015)研究發(fā)現(xiàn)，采自土耳其的葡萄花翅小卷蛾產(chǎn)生抗藥性時，抗性品系與敏感品系蟲體內(nèi)的解毒酶表達(dá)量存在差異。Navarro-Roldánetal.(2020)的研究也證實了不同性別葡萄花翅小卷蛾種群體內(nèi)解毒酶活性不同。昆蟲的解毒酶基因家族主要包括細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450s，P450s)、羧酸酯酶(Carboxylesterases，CarE)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GSTs)三大酶系。不同解毒酶對殺蟲劑的代謝方式不同：CarE可使有機(jī)物的酯鍵發(fā)生斷裂，達(dá)到解毒效果；GST能促使體內(nèi)各種有毒物質(zhì)以非酶方式排出體外?？顾幮韵嚓P(guān)的P450基因主要為CYP4和CYP6家族的成員(張紅英等，2002)，這些基因在昆蟲抗性種群中表達(dá)水平顯著上升。一般來說，三大解毒酶可通過高表達(dá)、基因擴(kuò)增或基因突變等方式提高昆蟲對殺蟲劑的抗性。

迄今為止，對葡萄花翅小卷蛾抗性的研究主要集中在比較其對不同殺蟲劑的抗性水平，而對抗藥性的分子機(jī)制知之甚少(Navarro-Roldánetal.，2020)，解毒酶相關(guān)的研究對該蟲的抗藥性監(jiān)測和抗藥性治理具有重要的意義。

本研究對葡萄花翅小卷蛾的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，并通過注釋信息獲取解毒酶基因，與棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)和蘋果蠹蛾CydiapomonellaL.等鱗翅目昆蟲的同源基因?qū)Ρ龋M(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，探究三大解毒酶家族基因的分類和進(jìn)化特點，挖掘該蟲的解毒酶基因序列，為進(jìn)一步研究葡萄花翅小卷蛾對殺蟲劑和寄主植物的適應(yīng)性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 RNA樣本

葡萄花翅小卷蛾樣本由阿根廷門多薩省農(nóng)業(yè)衛(wèi)生與質(zhì)量研究所Gustavo Taret先生提供，成蟲樣本保存于RNA保存液中；RNA的提取參照Direct-zol RNA Miniprep試劑盒(Zymo research, Irvine, CA)說明書，DNase I處理去除DNA殘留。利用Nano Photometer測定儀和凝膠電泳檢測RNA濃度和質(zhì)量。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序、組裝及功能注釋

將滿足測序要求的高質(zhì)量葡萄花翅小卷蛾總RNA送至深圳華大基因科技有限公司，通過BGISEQ-500測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序獲得原始數(shù)據(jù)；使用trimmomatic進(jìn)行過濾(去除包含接頭、未知堿基含量>5%和低質(zhì)量的reads)；利用Trinity對clean reads進(jìn)行de novo組裝，然后使用Tgicl對組裝的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類去冗余，獲得unigene；通過Blast將組裝得到的unigene進(jìn)行七大功能數(shù)據(jù)庫Nr(non-redundant proteins reference sequences)、Nt (nucleotide sequence database)、KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes) 、Swiss-Prot、GO (gene ontology )、Pfam和KOG注釋。

1.3 三大解毒酶基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析

以葡萄花翅小卷蛾3種解毒酶(P450、CarE和GST)基因的蛋白序列為基礎(chǔ)，在NCBI中下載鱗翅目物種昆蟲3種解毒酶基因的蛋白序列，使用MEGA 7程序中的MUSCLE對不同物種的P450、GST和CarE氨基酸序列進(jìn)行比對(對于CarE和P450基因，選取>1000 bp的基因序列用于建樹分析)。3種解毒酶基因均采用MEGA 7軟件中的neighbor join (NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)樹，Bootstrap值設(shè)為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組組裝

為獲得葡萄花翅小卷蛾的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用BGISEQ-500技術(shù)平臺對其進(jìn)行RNA測序。測序樣品數(shù)據(jù)為6.4 Gb，經(jīng)Trinity和Tgicl軟件拼接共獲得44360個unigene，其總長度、平均長度、N50及GC含量分別為49864535、1124、2078 bp和42.81%，通過BUSCO軟件評估組裝結(jié)果為95%，表明轉(zhuǎn)錄組的組裝具有較高的完整性。

2.2 基因功能注釋

將組裝獲得的44360條unigene與7個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，共有28065條unigene被注釋，其中通過Nr數(shù)據(jù)庫成功注釋的unigene數(shù)量最多，共有26388條，在總unigene數(shù)中占比59.49%(表1)。Unigene注釋到Nr數(shù)據(jù)庫的物種主要為棉鈴蟲和柑橘卷葉蛾Amyeloistransitella(Walker)，分別占24.11%和16.94%(圖1)。此外，根據(jù)Nr注釋結(jié)果，本研究共注釋了144條解毒酶基因，其中包括91條P450酶系基因、22條GST酶系基因和31條CarE酶系基因。

表1 葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組unigene BLAST注釋結(jié)果

圖1 葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組unigene在Nr數(shù)據(jù)庫中的分布

2.3 P450注釋分析及其與幾種鱗翅目昆蟲P450的進(jìn)化關(guān)系

葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組中有91個CYP基因，在解毒酶基因中所占比例最大，選取核苷酸序列長度大于1000 bp的33個P450基因進(jìn)行發(fā)育進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，33個P450基因可注釋到CYP4、CYP6、CYP9等家族，分屬于clade 2(2個基因)、clade 3(17個基因)、clade 4(8個基因)和線粒體clade(6個基因)(圖2)。葡萄花翅小卷蛾P(guān)450基因均能夠與鱗翅目的P450聚在一起，其中葡萄花翅小卷蛾CYP4、CYP6和CYP9家族基因與鱗翅目其他物種的同源數(shù)較多。

2.4 GST注釋分析及其與幾種鱗翅目昆蟲GST的進(jìn)化關(guān)系

注釋結(jié)果顯示，在葡萄花翅小卷蛾中有22個GST基因，核苷酸序列長度在590～1450 bp之間。將這些GST基因與其他鱗翅目昆蟲的同源基因進(jìn)行氨基酸序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，葡萄花翅小卷蛾與蘋果蠹蛾、云杉芽卷蛾Choristoneurafumiferana(Clem.)和棉鈴蟲等昆蟲的相應(yīng)GST蛋白可聚為一類。注釋的葡萄花翅小卷蛾表達(dá)的GST分別屬于Microsomal(3個)、Epsilon(7個)、Delta(5個)、Omega(3個)、Sigma(2個)、Zeta(1個)和Theta(1個)等GST亞家族，其中主要以Epsilon和Delta亞家族GST數(shù)量最多(圖3)。

2.5 CarE注釋分析及其與鱗翅目近緣物種的CarE進(jìn)化關(guān)系

羧酸酯酶又稱脂族酯酶，是酯酶超基因家族中重要的一類酶，根據(jù)其功能通?？煞譃橄舛久浮⒓に嘏c信息素代謝酶以及神經(jīng)發(fā)育相關(guān)蛋白。在葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組中有31個CarE基因的轉(zhuǎn)錄本，選取基因長度大于1000 bp的12個CarE基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)這些CarE基因根據(jù)功能大致可以分為3類：一類承擔(dān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；另一類參與外源化合物消化和解毒，與棉鈴蟲CarE聚為一類；還有一類是與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的蛋白，在葡萄花翅小卷蛾中主要為乙酰膽堿酯酶(圖4)。

3 結(jié)論與討論

葡萄花翅小卷蛾是葡萄等果樹上的重要害蟲，作為重要的進(jìn)境檢疫性有害生物，該蟲在我國尚未有入侵和發(fā)生的報道。開展葡萄花翅小卷蛾代謝酶的完整分析，對于該蟲入侵風(fēng)險評估以及防治措施制定具有重要意義。本研究通過對葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)該蟲表達(dá)144個解毒酶基因，包含91個細(xì)胞色素P450基因、31個CarE基因和22個GST基因。這些解毒酶基因與其他鱗翅目昆蟲的同源基因存在較高的相似性。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同鱗翅目昆蟲基因組中的解毒酶基因存在許多同源基因?qū)突蛉?，存在較高的保守性(艾均文等，2015)。葡萄花翅小卷蛾與其他鱗翅目昆蟲的解毒酶同源基因可能具有相似的代謝機(jī)制。

圖2 葡萄花翅小卷蛾與其幾種鱗翅目昆蟲CYP的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

圖3 葡萄花翅小卷蛾與幾種鱗翅目昆蟲GST的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

圖4 葡萄花翅小卷蛾與幾種鱗翅目昆蟲CarE的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

細(xì)胞色素P450是昆蟲體內(nèi)一類重要的解毒酶，其在生物轉(zhuǎn)化、內(nèi)源底物的催化以及外源物質(zhì)的代謝和解毒過程中具有重要作用(Guengerich，2001； Lietal.，2007; Feyereisen，1999； Rewitz，2004)。P450通過基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化、基因突變等多種機(jī)制影響昆蟲對不同寄主適應(yīng)性和殺蟲劑抗性(Bassetal.，2013； Wangetal.，2018)。葡萄花翅小卷蛾幼蟲在不同寄主上的生長速度、交配成功率、繁殖力都存在差異，這可能與其體內(nèi)P450解毒酶對植物次生代謝物質(zhì)的解毒能力有關(guān)(Denis & Jerme，2005)。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄花翅小卷蛾的P450基因主要屬于CYP4和CYP6家族，這2個家族的P450基因被證實與多種殺蟲劑的抗性相關(guān)(郭亭亭等，2009； 楊帆和王進(jìn)軍，2008； Kimetal.，2017)。本研究組發(fā)現(xiàn)1個葡萄花翅小卷蛾的P450CYP6亞家族基因和蘋果蠹蛾的CYP6B2基因在系統(tǒng)樹上聚為一支，而CYP6B2被證實在蘋果蠹蛾對溴氰菊酯和谷硫磷的抗藥性中具有重要作用(Wanetal. 2019)；而葡萄花翅小卷蛾的1個CYP4亞家族基因和小菜蛾CYP4g15基因聚為一支，據(jù)報道，CYP4g15參與柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama對農(nóng)藥的代謝(Tianetal.,2019)；葡萄花翅小卷蛾另外1個CYP4亞家族基因和斜紋夜蛾SpodopteralitturaFabriciusCYP4C1基因聚為一支，CYP4C1被證實在多種昆蟲對植物次生代謝物質(zhì)中具有重要作用(Huangetal.，2019)。

CarE在昆蟲對有機(jī)磷、氨基甲酸酯以及擬除蟲菊酯等多種殺蟲劑的抗性中起重要作用(劉紅霞等，2012； 張柯等，2002； Wangetal.，2018)。CarE基因擴(kuò)增和基因突變可能介導(dǎo)昆蟲對殺蟲劑產(chǎn)生抗性(Wangetal.，2018; Zhangetal.，2013)。羧酸酯酶CarE001A和CarE001H在棉鈴蟲對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的代謝中具有重要的作用(Lietal.，2020)。羧酸酯酶RpCarE基因表達(dá)量的變化介導(dǎo)了禾谷縊管蚜RhopalosiphumpadiL.對異丙威和高效氯氟氰菊酯2種農(nóng)藥的抗性(Wangetal.，2018)。Navarro-Roldánetal.(2020)研究葡萄花翅小卷蛾對毒死蜱、高效氯氟氰菊酯和噻蟲啉3種殺蟲劑的代謝解毒機(jī)制，發(fā)現(xiàn)酯酶活性顯著升高，羧酸酯酶活性增強(qiáng)可能介導(dǎo)該抗藥性。本研究共發(fā)現(xiàn)31個CarE基因，這些酯酶可能參與葡萄花翅小卷蛾體內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、內(nèi)源與外源化合物的消化和解毒，其功能有待進(jìn)一步研究。

GST是昆蟲體內(nèi)三大解毒酶之一，可以通過促進(jìn)殺蟲劑的還原性脫氯化氫或與還原性谷胱甘肽發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)來代謝殺蟲劑(Enayatietal.，2010)。GST還可以清除昆蟲體內(nèi)殺蟲劑作用過程中產(chǎn)生的有毒氧自由基。大量研究表明，GST與昆蟲對有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性有關(guān)(尤春燕等，2013； Fournieretal.，1992)，與抗性相關(guān)的昆蟲GST基因分屬于Delta和Epsion 2個亞族(Caoetal.，2018; Vontasetal.，2001)。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲GST可被植物次生代謝物質(zhì)誘導(dǎo)，并對殺蟲劑敏感性產(chǎn)生影響(陳鳳菊等，2003; 高希武等，1997)。本研究基于葡萄花翅小卷蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)22個GST基因，其中有12個GST基因?qū)儆诶ハx特有的Delta和Epsion亞族，這2個亞家族的基因在昆蟲對外源物質(zhì)的代謝中發(fā)揮非常重要的作用(Chen & Zhang，2015)，本研究鑒定的葡萄花翅小卷蛾各個GST基因的具體功能有待進(jìn)一步分析。