孫紅煒， 徐曉輝， 李 凡， 楊淑珂， 路興波

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/山東省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100

玉米ZeamaysL.是我國重要的糧食作物及工業(yè)加工原料，在我國農(nóng)作物生產(chǎn)中占有重要的位置。蟲害是影響玉米產(chǎn)量的重要因素。我國主要的玉米害蟲有亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenee)、黏蟲Mythimnaseparate(Walker)、棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübner等鱗翅目害蟲。亞洲玉米螟常年發(fā)生，給玉米生產(chǎn)造成一定的損失，被害玉米一般減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重年份達(dá)50%以上(王紅軍和郭書亞，2017)。黏蟲一般年份發(fā)生不重，但在適宜的環(huán)境中會(huì)突然大暴發(fā)，如2012年8月上旬，在河北省廊坊、唐山等，北京通州、昌平，內(nèi)蒙古通遼、赤峰，遼寧朝陽、阜新，吉林長春、松原，黑龍江哈爾濱，天津和山西晉中等地3代黏蟲幼蟲相繼暴發(fā)，發(fā)生面積374萬hm2，嚴(yán)重發(fā)生面積54.5萬hm2，對玉米、谷子、水稻等糧食作物生產(chǎn)安全造成了嚴(yán)重威脅(張?jiān)苹鄣龋?012)。

我國害蟲防治一直提倡預(yù)防為主、綜合防控，但現(xiàn)階段主要依賴化學(xué)防治。化學(xué)防治雖然效果較好，但防治時(shí)間滯后，無法控制實(shí)際減產(chǎn)，另外,環(huán)境污染、食品污染嚴(yán)重，浪費(fèi)大量人力、物力。而轉(zhuǎn)基因作物由于自身持續(xù)表達(dá)抗性蛋白，可以在害蟲發(fā)生早期對其進(jìn)行有效控制，避免害蟲大發(fā)生。

到目前為止，我國未批準(zhǔn)任何轉(zhuǎn)基因玉米種植，但在2008年開始實(shí)施的轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)支持下，我國每年都有眾多轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)入中間試驗(yàn)、環(huán)境釋放試驗(yàn)或生產(chǎn)性試驗(yàn)，目前國內(nèi)不少種子公司已培育出抗蟲耐除草劑效果較好的轉(zhuǎn)基因玉米品種(戴軍等，2014； 劉洋等，2016； 王慧等，2014； 張琪等，2010)。其中，轉(zhuǎn)植酸酶玉米于2009年獲得安全證書，2019年，抗蟲抗除草劑玉米DBN9936、雙抗12-5也獲得安全證書。因此，從技術(shù)儲(chǔ)備、玉米經(jīng)濟(jì)地位、病蟲預(yù)防需求及除草劑安全應(yīng)用各方面看，玉米是最適合在我國首先批準(zhǔn)釋放的轉(zhuǎn)基因作物(李寧等，2011； 沈平等，2016； 張彥琴等，2016)。轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5是浙江大學(xué)研發(fā)的含有抗蟲基因cry1Ab/cry2Aj與耐除草劑基因G10evo的轉(zhuǎn)基因玉米新品系，其中，cry1Ab/cry2Aj表達(dá)Bt殺蟲蛋白，對亞洲玉米螟有較高的殺蟲活性，對其他鱗翅目害蟲也有一定的控制作用(常雪等，2013； 孫紅煒等，2018)，草甘膦靶標(biāo)酶基因G10evo對草甘膦有很高的耐受性(譚苗苗，2016)。本研究對轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的雜交后代雙抗12-5-21對3種鱗翅目害蟲抗性及對靶標(biāo)除草劑草甘膦的耐受性進(jìn)行了鑒定，以期為轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5的推廣應(yīng)用提供科學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試玉米

雙抗12-5-21(轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米)、綜31(非轉(zhuǎn)基因玉米，感蟲對照品種)、鄭單958(非轉(zhuǎn)基因玉米，當(dāng)?shù)貙φ掌贩N，與雙抗12-5-21具有相同的雜交親本)，其中，雙抗12-5-21由浙江大學(xué)提供，綜31由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供，鄭單958購自當(dāng)?shù)胤N子市場。

1.2 田間抗蟲性鑒定

供試?yán)ハx亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲均由本研究室人工繁殖。參照農(nóng)業(yè)部953號公告-10.1-2007及農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1248.5-2006進(jìn)行試驗(yàn)。

亞洲玉米螟：在玉米6葉期和吐絲期人工接種初孵幼蟲，選擇傍晚接蟲。心葉期接種到心葉內(nèi)，吐絲期接種到花絲上。每小區(qū)人工定株接蟲40株，每株接蟲30～40頭。3 d后進(jìn)行第2次接蟲，最后一次接蟲14 d后調(diào)查。

心葉期調(diào)查：調(diào)查接蟲株中上部葉片被亞洲玉米螟危害程度，包括受害葉片上的蟲孔大小、數(shù)量及分布等，記錄食葉級別，計(jì)算平均食葉級別，根據(jù)平均食葉級別判定玉米心葉期對亞洲玉米螟的抗性水平。危害程度分級標(biāo)準(zhǔn)及抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1248.5-2006。

吐絲期調(diào)查：根據(jù)雌穗被害情況、蛀孔數(shù)量、隧道長度(cm)及存活幼蟲齡期數(shù)量等，計(jì)算各小區(qū)穗期亞洲玉米螟對雌穗的被害級別平均值。按照雌穗被害級別平均值判定玉米穗期對亞洲玉米螟的抗性水平。雌穗被害級別分級標(biāo)準(zhǔn)及抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照農(nóng)業(yè)部953號公告-10.1-2007。

黏蟲：玉米6葉期接蟲，接蟲方法及接蟲次數(shù)同亞洲玉米螟。最后一次接蟲14 d后調(diào)查玉米葉片受黏蟲危害程度及幼蟲存活數(shù)，記錄葉片被害級別并計(jì)算被害級別平均值，判定玉米心葉期對黏蟲的抗性水平。危害程度分級標(biāo)準(zhǔn)及抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照農(nóng)業(yè)部953號公告-10.1-2007。

棉鈴蟲：在吐絲期接蟲，接蟲方法及接蟲次數(shù)同亞洲玉米螟。最后一次接蟲14 d后調(diào)查雌穗被害率、幼蟲存活數(shù)、雌穗被害長度，確定雌穗被害級別并計(jì)算平均值，判定玉米對棉鈴蟲的抗性水平。雌穗被害級別分級標(biāo)準(zhǔn)及抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照農(nóng)業(yè)部953號公告-10.1-2007。

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，小區(qū)面積為30 m2(5 m×6 m)，行距60 cm，株距25 cm，小區(qū)間設(shè)2 m間隔，以防害蟲在不同小區(qū)之間擴(kuò)散。除全生育期不噴施殺蟲劑外，按常規(guī)方式播種及管理。

1.3 收獲期對鱗翅目害蟲的抗性鑒定

采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，小區(qū)面積為150 m2(5 m×30 m)，行距60 cm，株距25 cm，不進(jìn)行人工接蟲。除全生育期不噴施殺蟲劑外，按常規(guī)方式播種及管理，調(diào)查自然條件下玉米對鱗翅目害蟲抗性。

收獲前，每小區(qū)對角線5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)取相鄰4行的20株玉米，進(jìn)行剖稈調(diào)查，記錄植株受害率、雌穗及莖稈蛀孔數(shù)、活蟲數(shù)。鱗翅目害蟲控制效果計(jì)算公式如下：

其中，E為控制效果；D為當(dāng)?shù)貙φ掌贩N玉米受害植株數(shù)或蟲數(shù)；T為轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米受害植株數(shù)或蟲數(shù)。

1.4 草甘膦耐受性鑒定

供試除草劑：41%草甘膦異丙胺鹽(glyphosate-isopropylammonium)水劑，美國孟山都公司生產(chǎn)，商品名農(nóng)達(dá)。在玉米植株生長至6葉期噴施除草劑。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)8個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，共24個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積4 m×6 m，每小區(qū)之間設(shè)1 m間隔。處理如下：(1)鄭單958不噴施草甘膦；(2)鄭單958噴施推薦劑量中劑量草甘膦(923 g·hm-2)；(3)鄭單958噴施2倍推薦劑量中劑量草甘膦(1846 g·hm-2)；(4)雙抗12-5-21不噴施草甘膦；(5)雙抗12-5-21噴施推薦劑量中劑量草甘膦(923 g·hm-2)；(6)雙抗12-5-21噴施2倍推薦劑量中劑量草甘膦(1846 g·hm-2)；(7)雙抗12-5-21噴施4倍推薦劑量中劑量草甘膦(3692 g·hm-2)；(8)雙抗12-5-21噴施6倍推薦劑量中劑量草甘膦(5538 g·hm-2)。

調(diào)查方法：參照農(nóng)業(yè)部953號公告-11.1-2007，分別在用藥后1、2、4周調(diào)查成苗率、藥害癥狀(選取藥害癥狀最輕的5株)，藥害癥狀分級按GB/T 17980.42-2000執(zhí)行，除草劑受害率計(jì)算公式如下：

其中，X為受害率；N為同級受害株數(shù)；S為級別數(shù)；T為總株數(shù)；M為最高級別。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙抗12-5-21對鱗翅目害蟲的田間抗性

不同玉米品種對亞洲玉米螟田間抗性鑒定結(jié)果見表1。6葉期，感蟲品種綜31受害平均級值為8.49，蟲害級別達(dá)到7級，為感蟲水平；鄭單958受害平均級值為5.52，蟲害級別達(dá)到5級，表現(xiàn)為中抗亞洲玉米螟；而雙抗12-5-21受害平均級值為1.12，蟲害級別為1級，達(dá)高抗水平?；ńz期，感蟲品種綜31受害平均級值為7.13，為感蟲水平；鄭單958受害平均級值為5.76，表現(xiàn)為感蟲水平；而雙抗12-5-21的受害平均級值為1.07，達(dá)高抗水平。方差分析結(jié)果表明，雙抗12-5-21的受害平均級值顯著低于當(dāng)?shù)貙φ铡?/p>

不同玉米品種對黏蟲田間抗性鑒定結(jié)果見表2。6葉期，感蟲品種綜31的受害平均級值為6.14，為感蟲水平；鄭單958受害平均級值為4.32，表現(xiàn)為中抗黏蟲；而雙抗12-5-21的受害平均級值為1.32，達(dá)高抗水平。方差分析結(jié)果表明，雙抗12-5-21的受害平均級值顯著低于當(dāng)?shù)貙φ铡?/p>

不同玉米品種對棉鈴蟲田間抗性鑒定結(jié)果見表2。花絲期，感蟲品種綜31的受害平均級值為5.66，為感蟲水平；鄭單958受害平均級值為3.51，表現(xiàn)為中抗；而雙抗12-5-21的受害平均級值為0.02，達(dá)高抗水平。方差分析結(jié)果表明，雙抗12-5-21的受害平均級值顯著低于當(dāng)?shù)貙φ铡?/p>

從田間人工接蟲鑒定結(jié)果看，雙抗12-5-21對玉米田3種常見的鱗翅目害蟲亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲的抗性均達(dá)到高抗水平，可以有效減輕鱗翅目害蟲的危害。

表1 雙抗12-5-21對亞洲玉米螟的田間抗性

表2 雙抗12-5-21對黏蟲、棉鈴蟲的田間抗性

2.2 雙抗12-5-21收獲期對鱗翅目害蟲的抗性

由表3看出，雙抗12-5-21受害株率為3.00%，而鄭單958和綜31受害株率分別為32.67%、68.33%；雙抗12-5-21莖稈及雌穗蛀孔數(shù)為3.33，而當(dāng)?shù)貙φ蘸透邢x品種分別為69.67和177.67；雙抗12-5-21雌穗及莖稈雖然有少量蛀孔，但活蟲數(shù)為0.00，而鄭單958和綜31活蟲數(shù)分別為45.00和155.00頭。方差分析結(jié)果表明，雙抗12-5-21受害株率、蛀孔數(shù)、活蟲數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于當(dāng)?shù)貙φ锗崋?58和感蟲品種綜31，與二者之間差異顯著。由于雙抗12-5-21植株上未調(diào)查到害蟲，根據(jù)蟲數(shù)計(jì)算，雙抗12-5-21對害蟲的控制效果為100.00%；根據(jù)受害植株數(shù)計(jì)算，相比鄭單958，雙抗12-5-21的控制效果為90.82%。以上結(jié)果表明，自然條件下，雙抗12-5-21對鱗翅目害蟲抗性效果顯著。

表3 雙抗12-5-21收獲期對鱗翅目害蟲的抗性

2.3 雙抗12-5-21對除草劑草甘膦的耐受性

由表4看出，處理1周后，鄭單958不噴施草甘膦處理及雙抗12-5-21各處理平均成苗率均為100.00%，鄭單958噴施中劑量及中劑量2倍量草甘膦成苗率為0.00，受害率為100.00%，玉米苗全部死亡；雙抗12-5-21中劑量草甘膦受害率為0.00，噴施2倍中劑量、4倍中劑量草甘膦受害率均為2.67%，噴施6倍中劑量草甘膦受害率為36.00%。統(tǒng)計(jì)分析表明，雙抗12-5-21各處理受害率顯著低于鄭單958噴施草甘膦的2個(gè)處理，噴施6倍中劑量草甘膦受害率顯著高于中劑量、2倍中劑量、4倍中劑量草甘膦的受害率。隨著噴藥濃度的增加，雙抗12-5-21株高略有降低，但雙抗12-5-21各處理之間株高差異不顯著。

由表5看出，處理2周后，雙抗12-5-21噴施中劑量、2倍中劑量、4倍中劑量草甘膦處理受害率為0.00；噴施6倍中劑量草甘膦處理的受害率明顯降低，為8.00%，且均為在噴藥初期葉部產(chǎn)生藥害，新生葉片生長正常，但玉米株高顯著低于雙抗12-5-21其他處理；雙抗12-5-21各處理受害率均顯著低于鄭單958。

藥后4周，6倍中劑量草甘膦處理的抗12-5-21生長完全恢復(fù)正常，株高與該品種其他處理差異不顯著，其他各處理表現(xiàn)與藥后2周完全一致。

在大田使用除草劑時(shí)，一般噴施推薦劑量中劑量的除草劑，從本實(shí)驗(yàn)調(diào)查結(jié)果看，雙抗12-5-21對目標(biāo)除草劑草甘膦具有顯著的耐受性，可以耐受4倍中劑量的草甘膦，噴施6倍中劑量草甘膦4周后，玉米生長完全恢復(fù)正常，株高與雙抗12-5-21其他處理差異不顯著。

表4 雙抗12-5-21對草甘膦的耐受性(1周后)

表5 雙抗12-5-21對草甘膦的耐受性(2、4周后)

3 討論

將外源抗蟲基因?qū)胗衩祝怪谟衩字仓陜?nèi)持續(xù)表達(dá)抗蟲蛋白，可以有效控制靶標(biāo)害蟲的發(fā)生(Burknessetal.，2001； Chilcuttetal.，2007；Horner & Dively，2003； Lynchetal.，1999)。美國于1996年開始商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因玉米，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的應(yīng)用有效控制了玉米蟲害的發(fā)生，經(jīng)濟(jì)、社會(huì)、生態(tài)效益明顯(James，2015)。

轉(zhuǎn)基因作物的環(huán)境安全性評價(jià)一般包括3個(gè)方面:一是外源基因功能評價(jià)，如抗蟲性、除草劑耐受性、抗逆能力評價(jià)等(孫紅煒等，2018； 王江等，2016);二是生存競爭能力評價(jià)，主要是轉(zhuǎn)基因作物可能帶來的“雜草化”風(fēng)險(xiǎn)，主要包括轉(zhuǎn)基因作物本身的“雜草化”或者轉(zhuǎn)基因作物抗除草劑基因漂移到雜草上，導(dǎo)致雜草抗性的產(chǎn)生(姜偉麗等，2018； 馬小燕等，2013);三是對農(nóng)田生物多樣性影響評價(jià)，包括作物遺傳多樣性、農(nóng)田節(jié)肢動(dòng)物多樣性、對靶標(biāo)和非靶標(biāo)害蟲影響、土壤微生物多樣性影響等(高欣欣等，2018； 洪鑫等，2020； 尹俊琦等，2017)。其中，第一方面是最重要也是最基本的一個(gè)指標(biāo)，決定了轉(zhuǎn)基因作物有無進(jìn)行后續(xù)研究并推廣應(yīng)用的價(jià)值。

從全國大部分玉米種植區(qū)來看，亞洲玉米螟一代幼蟲6月份在心葉內(nèi)取食，8月上、中旬夏玉米穗期，第3代幼蟲在玉米打苞后鉆入苞內(nèi)，抽雄后即向下轉(zhuǎn)移，蛀入幼穗及莖內(nèi)為害。黏蟲是我國著名的遷飛性、暴食性及雜食性害蟲，1、2齡幼蟲僅啃食葉肉成天窗， 3齡以后沿葉緣蠶食成缺刻，危害嚴(yán)重時(shí)吃光大部葉片，只殘留很短的中脈,心葉期及喇叭口期Bt蛋白表達(dá)量高低是決定對黏蟲抗性的關(guān)鍵。棉鈴蟲喜溫暖高濕，有強(qiáng)烈的趨嫩性，夏玉米抽雄未開花盛期，為棉鈴蟲產(chǎn)卵盛期，蟲卵80%左右落在夏玉米抽出但未開花的幼嫩雄穗上，幼蟲孵化后集中在幼嫩雌穗頂端花絲上取食。因此，根據(jù)不同鱗翅目害蟲為害關(guān)鍵期，選擇6～8葉期、花絲期進(jìn)行亞洲玉米螟抗性鑒定，4～6葉期對黏蟲、花絲期對棉鈴蟲進(jìn)行抗性鑒定，可以更為客觀地反映出轉(zhuǎn)基因玉米對鱗翅目害蟲的抗性。

田間抗性鑒定被認(rèn)為是最直接、最可靠和最終的玉米抗蟲性鑒定評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(何康來等，2000)。本試驗(yàn)中，在亞洲玉米螟、黏蟲嚴(yán)重危害的心葉期進(jìn)行的人工接蟲抗性試驗(yàn)，雙抗12-5-21對亞洲玉米螟和黏蟲的抗性均達(dá)到高抗水平；在花絲期，雙抗12-5-21對亞洲玉米螟和棉鈴蟲的抗性同樣達(dá)高抗水平。王江等(2016)對雙抗12-5對亞洲玉米螟的抗性研究表明，食葉級別平均值為1級，抗性類型為高抗，雌穗被害級別平均值為1.0，抗性類型為高抗，與本研究一致。常雪等(2013)研究了6個(gè)轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj基因玉米品系對亞洲玉米螟抗蟲性，春播和夏播田各轉(zhuǎn)基因玉米品系葉片、莖稈、雌穗基本沒有被害，食葉級別為1.0～1.5。本試驗(yàn)中為夏播玉米，心葉期平均食葉級別為1.12，同樣葉片花絲、雌穗基本無被害癥狀。本試驗(yàn)中雙抗12-5-21抗蟲效果略優(yōu)于常雪等(2013)所研究的品系，原因可能是本試驗(yàn)中所用品系是從多個(gè)品系中篩選出的最佳品系，而且試驗(yàn)玉米為雜交種，本身抗性較一般自交系玉米要強(qiáng)，另外可能與接蟲量、接蟲時(shí)氣候條件，甚至試蟲來源有關(guān)。

李桂玲和李歡慶(2007)的研究顯示，葉片蟲孔級別與莖稈隧道長度及莖稈蟲孔數(shù)各自之間并無線性相關(guān)，莖稈隧道長度和莖稈蟲孔數(shù)之間有極顯著的相關(guān)關(guān)系。因此，莖稈及穗的蟲孔數(shù)或隧道長度均可作為田間抗蟲鑒定的指標(biāo)。本試驗(yàn)選取莖稈及穗的蛀孔數(shù)進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因玉米受害率極低，僅為3.00%，且危害癥狀極輕微，莖稈及雌穗僅有3.33個(gè)蛀孔，未發(fā)現(xiàn)活蟲，這與常雪等(2013)、王江等(2016)的研究基本一致。

草甘膦是一種非選擇性除草劑，具有廣譜滅生性，同時(shí)具有內(nèi)吸性，藥劑會(huì)從葉部傳導(dǎo)到根部，殺死多年生雜草；此外，草甘膦無殘留，在土壤中分解速度快，不會(huì)對下茬作物產(chǎn)生藥害，因此應(yīng)用廣泛。但是，由于草甘膦的非選擇性，在噴灑時(shí)，易傷害到作物本身，影響作物生長。將耐除草劑基因G10evo導(dǎo)入植株體內(nèi)并表達(dá)，使植物具有對草甘膦的耐受性，可以有效避免草甘膦對自身的傷害。王江等(2016)研究了雙抗12-5噴施推薦劑量及2倍推薦劑量草甘膦后的生長情況，結(jié)果4周內(nèi)玉米生長正常，受害率為0.00。本研究設(shè)置了推薦劑量中劑量及2、4、6倍中劑量，結(jié)果表明，噴施4倍以內(nèi)中劑量草甘膦2周后，雙抗12-5-21完全無受害癥狀，噴施6倍中劑量2周后，植株受害率顯著降低，新生玉米葉片正常，4周后植株生長完全恢復(fù)正常。

2014年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)成果認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)(試行)，明確規(guī)定：參照NY/T 1248.5-2006《玉米抗亞洲玉米螟鑒定技術(shù)規(guī)范》，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米對亞洲玉米螟的抗蟲效果要達(dá)到高抗；轉(zhuǎn)基因耐草甘膦玉米對草甘膦的耐受性要達(dá)到推薦劑量的5倍以上。本試驗(yàn)中，田間抗蟲性鑒定結(jié)合收獲期剖稈調(diào)查結(jié)果表明，在各相應(yīng)時(shí)期，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米雙抗12-5-21均顯示了對亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲顯著的抗蟲效果，達(dá)到了高抗水平，同時(shí)對目標(biāo)除草劑草甘膦具有顯著耐受性，可以耐受4倍中劑量目標(biāo)除草劑，噴施6倍中劑量目標(biāo)除草劑4周后玉米生長完全恢復(fù)正常，具有進(jìn)一步開發(fā)推廣的潛力。