任行海， 劉 博， 喬 曦， 王福寬， 錢萬強， 萬方浩*， 劉 懷

1西南大學植物保護學院，重慶 400715； 2中國農(nóng)業(yè)科學院基因組研究所，廣東 深圳 518120； 3廣西大學機械工程學院，廣西 南寧530003

薇甘菊MikaniamicranthaH．B．K．是世界最有害100種外來入侵生物之一，同時也是我國重點管控的重要農(nóng)林入侵物種(Dayetal.,2016),列入國家重點管理外來入侵物種名錄。薇甘菊柄銹菌PucciniaspegazziniiDe Toni是生活在薇甘菊上的一種生活周期短、寄主專一性強的病原真菌，為一種防控薇甘菊的潛在生防真菌(Dayetal.,2013； Day & Riding,2019)。準確評價薇甘菊柄銹菌對薇甘菊的危害程度對致病性機制的研究、防控技術(shù)的開發(fā)等都具有十分重要的科學意義。

相對病斑面積(relative lesiona area, RLA)是評價病害嚴重程度的客觀指標，同時也是評價生防真菌防治效果的客觀指標，能反映生防真菌對靶標生物的侵染力。

相對病斑面積的計算方法有多種，傳統(tǒng)的方法有公式計算法、工具法和軟件法(陳冬梅等，2019)，目前大多采用的是圖像識別技術(shù)。公式計算方法以病斑的最大長度和最大寬度(兩者呈直角)或以病斑的直徑計算(崔華威等2009；李海春等，2005；李麗梅等，2020)；傳統(tǒng)使用的工具有已知每格面積的紗網(wǎng)、有機玻璃制成的標準尺、坐標紙、游標卡尺等(李麗梅等，2020)；使用的軟件主要是Chalkiness 1.0、Photoshop、AutoCAD(崔華威等，2009； 吳堯和吳雙清，2014； 鄭燕和吳為人，2008)，但是這些方法存在許多問題，特別是網(wǎng)格法、坐標法在計算面積時存在誤差，在樣本量多時，統(tǒng)計效率低，同時操作者容易產(chǎn)生疲勞，造成誤差(胡維煒等，2016)。

自從圖像識別技術(shù)被提出以來，該方法已經(jīng)被應用于多個領(lǐng)域，如醫(yī)學病理切片識別、制造業(yè)中金屬與合金鑒定和產(chǎn)品缺點識別、農(nóng)業(yè)病蟲害與雜草識別、建筑質(zhì)量檢測、植物物種鑒定以及果園中凍傷檢測，甚至被警察用于找尋大麻的種植地(Daoudetal.,2019； Gaoetal.,2019； Islam & Kim,2019； Meyeretal.,2004； Narla & Rao,2020； Pereiraetal.,2020； Taraschi & Florindo,2020)。圖像識別技術(shù)被用于計算病斑面積以來，國內(nèi)外許多學者利用圖像識別技術(shù)開展對植物病害的研究。陳冬梅等(2019)基于自適應模糊閾值法計算茶炭疽病的病斑面積，準確率達90%以上。毛罕平等(2008)提出了一種基于模糊C均值聚類算法(fuzzy c-means， FCM)的自適應分割方法，該方法能夠比較準確地分割病斑區(qū)域與健康區(qū)域，且平均分割誤差小于5%。刁智華等(2013b)提出基于顏色和形狀特征的分割方法，并應用于分割棉花害螨病斑，結(jié)果表明，該計算方法能夠有效提取棉花被螨蟲危害后的病斑，準確率達94.79%。胡維煒等(2016)通過HSV(Hue, Saturation, Value)、L*a*b*特征空間類聚法逐步分離病斑區(qū)域，該方法能夠有效分割病斑區(qū)域與健康的區(qū)域，相對病斑面積計算的準確率達99.5%以上。Chenetal.(2020)在VGGNeT(Visual Geometry Group Network)模型的基礎(chǔ)上提出了ING-VGG模型，該模型對水稻病斑識別的平均準確度也達到了92%,為水稻病害的識別與預測提供了一個快速有效的途徑。Qianetal.(2020)提出一種基于卷積云神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中VGG16的改進模型,對蘋果葉片病害進行識別，與VGG16模型相比，精準度提高了6.3%，達到99.1%。與上述方法不同的是，程榮花等(2014)通過HSV顏色分量過濾和中值濾波除噪，得到病斑與整個葉片的像素點數(shù)量，通過換算病斑區(qū)域的像素點數(shù)量和葉片像素點總量，計算出相對病斑面積，效果良好。目前，這些方法還未在識別薇甘菊銹病與計算病斑面積上應用。

基于圖像識別技術(shù)計算薇甘菊銹病相對病斑面積的核心在于圖像的分割，只有準確分割提取出病斑區(qū)域與健康區(qū)域，計算出的相對病斑面積才會準確。本研究采用超綠算法(excess green, ExG)與超紅算法(excess red, ExR)相結(jié)合的方法計算薇甘菊銹病的相對病斑面積。超綠算法與超紅算法是分離綠色植物與非綠色植物類圖像的常用技術(shù)，其原理是利用顏色特征因子的不同組合，如超綠算法的組合為2G-R-B、超紅算法的組合為2R-G-B(刁智華等，2013a，2013b)。本研究以薇甘菊銹病病斑葉片的彩色數(shù)字圖片為研究對象，采用ExG+ExR算法與復印稱重法、網(wǎng)格法計算相對病斑面積，并以Photoshop手動分割的結(jié)果作為真實值，計算精準度，評價各種算法的準確性和實用性。

1 材料與方法

1.1 圖像采集

在本研究中，薇甘菊銹病采用自然接種法接種(Ellisonetal.,2008)，接種15～17 d待銹色孢子長出后，拍攝感病葉片的照片120幅。拍攝感病葉片時，保持相機與葉片垂直，以A4紙為拍照底板，使葉片與底板緊貼，減少因葉片翹起而產(chǎn)生的陰影，圖像包括葉片的完整區(qū)域，保證有足夠的光照。感病葉片拍照后，將其放進具有掃描功能的復印機(HP LaserJet MFP M227fdw)內(nèi)，等比例掃描，以PDF文件保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 復印稱重法 參考陶洪斌和林杉(2006)的方法，并稍作修改。將等比例掃描得到的薇甘菊銹病葉片圖片打印在A4紙上，按照葉片的形狀剪取后放在1/1000電子分析天平(Meilen，MTQ 200)上稱重，將病斑剪掉后再次稱重，兩者的差值就是病斑所占的質(zhì)量，病斑與葉片的質(zhì)量之比，就是該葉片中病斑的占比。

RLA= (Ma-Mb)/Ma×100%

其中，Ma是葉片形狀A4紙的重量，Mb是減去病斑后的重量。

1.2.2 網(wǎng)格法 根據(jù)劉學敏等(1991)的方法，稍作修改，將等比例掃描得到的薇甘菊銹病病葉圖片打印在已知面積的網(wǎng)格紙上(0.01 cm2·格-1)，數(shù)葉片和病斑占的格數(shù)，統(tǒng)計葉片、病斑的面積。統(tǒng)計原則：葉片或病斑占滿一格按一格計算，多于半格不滿一格按半格計算，少于半格不做統(tǒng)計。

RLA=Sb/Sz×100%

其中，Sb是病斑的面積，Sz是葉片面積。

1.2.3 基于圖像處理的方法 超綠算法是一種基于RGB顏色空間的閾值分割方法(刁智華等，2013a)。由于該算法對樣本中的綠色目標比較敏感，因此常被應用于綠色植物的分割。算法的分割原理是利用超綠因子(2G-B-R)對彩色樣本圖像進行處理，增加G分量在顏色空間中的比重，從而增強圖像中綠色分量與其他分量之間的對比度。之后對處理所得的圖像進行閾值分割，即將圖像中每個像素的灰度值與選定的閾值T進行對比，大于T的像素被標記為目標，其余像素被標記為背景。算法中閾值T的選取常采用最大類間方差法(OTSU)，OTSU是一種無監(jiān)督無參的分類方法，由于其有穩(wěn)定有效、自適應強以及計算簡單的特性，從而被廣泛應用于自動閾值的分割(白元明等，2019)，在實際應用中也可采用經(jīng)驗法對分割閾值T進行賦值，以達到最佳分割效果。

超紅算法與超綠算法的原理類似，不同的是超紅算法的作用是突出圖像中的紅色分量，可用于葉片病斑的分割(刁智華等，2013b)。采用的超紅算法表達式為：

ExR=2.1R-G-B

1.2.4 病情分級 參考商鴻生等(1990)對小麥銹病的等級劃分，將薇甘菊有銹病病斑的葉片分為5個等級：1級為冬孢子覆蓋度介于0～5%；2級為冬孢子覆蓋度介于5%～15%；3級為冬孢子覆蓋度介于15%～30%；4級為冬孢子覆蓋度介于30%～60%；5級為冬孢子覆蓋度介于60%～100%。

1.3 評價方法

相對病斑面積反映了病原真菌或細菌侵染葉片的程度，不僅是定量評估病害程度的指標，也是評估生防菌防控效果的指標。本研究通過圖像識別技術(shù)實現(xiàn)對RLA的無損測量。為了體現(xiàn)測量方法的準確性，將采用絕對準確率(absolute accuracy, AA)、絕對誤差(absolute error, AE)這2個指標評價RLA的準確性。

采用絕對準確率評估病斑面積分割的精度(陳冬梅等，2019)，其計算公式為：

Ra=La/Sa×100%

Ri=Li/Si×100%

AA=(1-|Ra-Ri|)×100%

其中，La、Sa是利用Photoshop 2020軟件對樣本進行人工分割所得的結(jié)果作為目標葉片像素點數(shù)和病斑的像素點數(shù)真實值，即利用Photoshop 2020軟件中的快速選擇工具將目標葉片與病斑選中，并填充不同的顏色，再利用計數(shù)工具統(tǒng)計目標葉片像素點與病斑像素點。

Ra是計算出來的相對病斑面積，作為真實值；Li、Si是利用本研究方法計算出目標葉片和病斑面積的像素點或目標葉片和病斑的面積，Ri是本研究的算法計算出來的相對病斑面積。AA越大，表明計算方法的精度越大，方法的性能越好。

采用絕對誤差衡量相對病斑面積計算的準確性(胡維煒等，2016)，其計算公式為：

AE=|Ra-Ri|×100%

采用錯分率(misclassification error, ME)衡量圖像識別技術(shù)對病斑區(qū)域與健康區(qū)域分割的準確度，其計算公式為：

ME= (La-Li)/Sa×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 背景與病斑分割

為提高葉片病斑的分割精度，先將帶有病斑的葉片從圖像樣本的背景中分割出來，再從葉片上分割出目標病斑。ExG算法、ExR算法分割方法中，ExR算法對綠色特征并不敏感，因此分別采用ExG算法進行葉片背景分割,ExR算法進行病斑分割。

采用ExG算法進行背景分割時，采用OTSU方法計算所得的閾值。采用ExR算法分割病斑時，同樣將OTSU方法計算所得的閾值作為初始閾值，在該閾值附近尋找整體最優(yōu)閾值，最終采用閾值T=0.37。實驗發(fā)現(xiàn)，由于取樣時拍攝背景的光照強度和葉片綠度不同，不同圖像的最優(yōu)閾值有一定的差別。為達到最佳的分割效果，本研究嘗試采用多閾值法使不同的圖像在整體最優(yōu)閾值附近(0.29≤T≤0.45)自動選用最優(yōu)整體閾值進行分割。

由圖1可知，ExG算法很好地將葉片從背景中分割出來，雖然分割精度只有97.7%，但不會出現(xiàn)將病斑分割掉的現(xiàn)象。ExG算法的誤分情況主要表現(xiàn)在將背景區(qū)域識別為葉片，具體結(jié)果如圖1F所示。對比原圖發(fā)現(xiàn)，誤分區(qū)域為葉片邊緣的深色陰影區(qū)域，大面積的陰影使得聚類算法將部分靠近葉片的背景區(qū)域分割為葉片，但整體來說ExG算法分割背景的效果良好。

病斑的分割是在ExG算法分割背景的基礎(chǔ)上采用ExR算法，該方法能夠準確地將病斑分割出來(圖1G～I)，分割效果較好。

圖1 ExG+ExR算法病斑分割結(jié)果

2.2 病斑計算結(jié)果

將圖像識別技術(shù)與傳統(tǒng)方法計算葉片相對病斑面積的結(jié)果比較，結(jié)果可知，與傳統(tǒng)方法相比，ExG+ExR算法計算得到的病斑相對面積的絕對準確率的均值為98.19%，高于網(wǎng)格法的96.19%、復印稱重法的94.93%(表1)。絕對誤差反映了相對病斑面積計算的準確度，絕對誤差越小，表明分割的精度越高。ExG+ExR算法絕對誤差率的均值小于2%，表明相對病斑面積計算準確度均值超過98%，高于網(wǎng)格法與復印稱重法。錯分率反映了圖像識別技術(shù)分割葉片病斑區(qū)域與健康區(qū)域的準確程度，ExG+ExR算法錯分率的均值為1.81%，不高于2%，表明葉片的病斑區(qū)域與健康區(qū)域的分割準確度平均達到98%以上。由表1可知，3種方法的絕對準確率都會隨著病級的增加而下降，絕對誤差都會隨著病級的增加而增加，但ExG+ExR算法的絕對準確率和絕對誤差的變化要小于其他2種方法，絕對準確率都在94%以上。

基于上述實驗結(jié)果，對于計算薇甘菊銹病相對病斑面積來說，ExG+ExR算法能夠有效地分割病斑面積，并計算出相對病斑面積，能夠有效地對利用薇甘菊柄銹菌防控薇甘菊的防控效果做出評價。

2.3 執(zhí)行效率

使用ExG+ExG算法處理一幅4608×3456像素的彩色圖像,消耗時間為45.77 s，明顯比傳統(tǒng)的方法快(表2)。

表1 3種方法對不同病級分割評價指標

表2 不同方法分割病斑消耗時間

3 討論

本文通過對3種病斑相對面積計算方法(ExG+ExR算法、復印稱重法、網(wǎng)格法)進行比較，給予系統(tǒng)、科學的評價。網(wǎng)格法計數(shù)格的過程中容易漏數(shù)、重復數(shù)，并且每個人對不滿格的判斷不同，這些都會產(chǎn)生較大的人為誤差。復印稱重法將目標區(qū)域剪出的過程中，容易產(chǎn)生誤差，最終影響相對病斑面積計算的準確度。此外，人工采集葉片過程中，會對實驗樣本造成不可恢復性的破壞。與傳統(tǒng)方法相比，基于圖像識別的ExG+ExR算法在不破壞實驗樣本的前提下，能夠快速、準確地分割病斑，并精準地計算出相對病斑面積，已在多種植物上應用，但超綠算法分割病斑時易將病斑誤分為背景?；诰矸e云神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的病害識別技術(shù)(Fangetal.,2020； Qianetal.,2020)、高光譜成像技術(shù)(楊嘉瑞，2018)也在病害識別、病級判定與病斑分級方面得到應用，但卷積云神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)識別植物病害前需要大量的樣本進行訓練，建立模型的過程需要經(jīng)過多次過濾，訓練十分復雜；高光譜成像技術(shù)能夠根據(jù)成像光譜與病斑面積的關(guān)系計算出病斑面積，但高光譜成像系統(tǒng)相關(guān)儀器較昂貴，不能普及應用。本文提出的在超綠算法分割背景的前提下采用超紅算法分割病斑，則沒有上述分割算法的缺點，且成本低，使用性較強。

本研究根據(jù)薇甘菊銹病的顏色特征，采用ExG算法有效地將背景分割；采用ExR算法準確地將病斑分割，克服ExG算法分割病斑時將病斑誤分為背景的缺點。采用ExG+ExR算法計算薇甘菊銹病的相對病斑面積絕對準確率的均值已經(jīng)超過98%，為后續(xù)評價薇甘菊柄銹菌防控薇甘菊的效果提供了科學依據(jù)。

由于本文采用的圖像樣本背景比較簡單且光照差異不大，背景分割過程中會發(fā)生誤分現(xiàn)象。鑒于本文的分割結(jié)果，下一步研究可直接采集自然生長狀態(tài)下的薇甘菊葉片作為樣本，通過拍攝不同角度、不同部位的圖像進行測試，同時優(yōu)化背景分割算法與病斑分割，以使整體的分割算法能夠適應復雜的圖像背景和更加精準的分割病斑。