韓 劍， 陳 杭， 艾克熱木·買買提， 羅 明， 唐章虎

1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052； 2新疆自治區(qū)高校農(nóng)林有害生物監(jiān)測與安全防控重點實驗室，新疆 烏魯木齊830052； 3新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院輪臺國家果樹資源圃，新疆 輪臺 841600

由于植原體至今無法分離培養(yǎng)，難以采用純培養(yǎng)的表型特征分類鑒定，主要依據(jù)其基因組核酸序列和分子特征進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。16S rDNA基因是植原體分類體系中的首選分子標(biāo)記，但大量研究表明，16S rDNA序列過于保守，不足以對于親緣關(guān)系較近的植原體作進(jìn)一步劃分(Duduketal.,2008)。核糖體蛋白(ribosomal protein,rp)基因是植原體進(jìn)化演變過程中一個重要的基因，其在植原體株系間關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)育的研究中能夠揭示更多有價值信息以及系統(tǒng)發(fā)育的標(biāo)記，能用于16S rDNA基因不易被區(qū)分的近緣株系的分類研究。Leeetal. (2000)通過16S rDNA和rp基因相結(jié)合的RFLP分析，將當(dāng)時的植原體株系詳盡地劃分為19個組46個亞組。Martinietal.(2002)基于rp基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究，將榆樹黃化組(16SrV)劃分為12個rpV亞組，表明rp基因在劃分親緣關(guān)系更近的植原體株系中是一個有效的分子標(biāo)記。在我國，蔡紅等(2003)首次報道了長春花黃化植原體的rp基因，并將其用于植原體系統(tǒng)分類研究。隨后，利用rp基因序列對棗瘋病植原體(王利平等,2014)、泡桐叢枝病植原體(和志嬌等,2014)、花生叢枝植原體(萬瓊蓮等,2014)等進(jìn)行系統(tǒng)分類的研究也陸續(xù)被報道。目前，國內(nèi)尚未見關(guān)于杏褪綠卷葉植原體rp基因的研究報道。本研究對杏褪綠卷葉植原體新疆分離物rp基因進(jìn)行克隆和序列分析，以期獲取其分子特征信息，分析其分子變異，在亞組水平上確定其分類地位。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品：2018—2019年在新疆輪臺縣和托克遜縣采集表現(xiàn)為葉片上卷、葉肉有不規(guī)則褪綠的疑似杏褪綠卷葉病樣品112份，將采集的葉片、枝條組織保存于保鮮袋內(nèi)，帶回實驗室后保存于4和-20 ℃冰箱中。經(jīng)植原體16S rDNA檢測，有54份樣品確定為感病樣品。普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker購自天根生化科技(北京)有限公司?？寺≥d體pMDTM19T以及其他酶類等分子生物學(xué)試劑均購自大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)。

1.2 方法

1.2.1 杏樹枝條韌皮部總DNA的提取 采用CTAB法(Greenetal.,1999)，提取杏樹多年生枝條韌皮部總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量后，置于-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2rp基因的PCR擴(kuò)增 參照Leeetal.(1998)報道的植原體rp基因引物對序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增：rpF1(5′-GGAGTAAGGTGAATTT-3′)，rpR1(5′-ACGTATTTACTTTTTGG-3′)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL)：DNA模板2.0 μL， 10 μmol·L-1rpF1/rpF2各1.0 μL，10 mmol·L-1dNTPs 1.5 μL，10×PCR Buffer(2.5 mmol·L-1MgCl2) 2.5 μL，2.5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.5 μL，補(bǔ)足滅菌超純水至25 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，51 ℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在添加Goldview染料的瓊脂糖(濃度為10 g·L-1)中進(jìn)行電泳(1×TAE緩沖系統(tǒng))，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存拍攝圖片。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的回收及克隆 將PCR產(chǎn)物中的特異性條帶切下，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，純化。回收的PCR產(chǎn)物與載體pMDTM19T在16 ℃下連接2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有X-gal (20 g·L-1)、IPTG (50 g·L-1)、Amp (100 mg·L-1)的LB瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)14～16 h，形成單菌落。將篩選出的陽性單菌落接種于含Amp (100 mg·L-1) LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，用rpF1/rpR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切鑒定。

1.2.4 序列測定與分析 隨機(jī)選取4個含有目的片段的重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測定。將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(https: ∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行BLAST檢索，通過DNAstar 軟件將所得rp基因序列進(jìn)行相似性比較，利用MEGA 5.0軟件分析，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，同時利用pDWAR 32軟件模擬實驗室的7種限制性內(nèi)切酶(AluⅠ、DraⅠ、HaeⅢ、HhaⅠ、MseⅠ、SspⅠ、TaqⅠ)對本研究獲得的杏褪綠卷葉植原體和已報道的16SrV-rp亞組參考株系(Martinietal.,2007)的rp基因序列(rpF1/rpR1擴(kuò)增片段)片段進(jìn)行RFLP虛擬酶切分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆杏褪綠卷葉病危害現(xiàn)狀及癥狀特點

本研究于2017—2019年連續(xù)3年對新疆輪臺縣、托克遜縣等杏樹生產(chǎn)區(qū)杏褪綠卷葉病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查。發(fā)現(xiàn)該病害有范圍擴(kuò)大、加重的趨勢，目前在新疆輪臺縣、托克遜縣、烏魯木齊市周邊均發(fā)現(xiàn)疑似病株，通過分子檢測和嫁接傳病試驗確定為植原體病原。部分杏園的發(fā)病率已超過30%，患病果園減產(chǎn)可達(dá)20%～50%，嚴(yán)重影響杏果品質(zhì)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)、不同品種的杏樹中表現(xiàn)的癥狀基本相似，表現(xiàn)為葉片邊緣沿葉脈向上卷。發(fā)病初期，感病植株的部分葉片會呈現(xiàn)卷葉癥狀，嚴(yán)重的整株葉片卷成筒狀呈失水狀，葉片表面呈現(xiàn)不規(guī)則的褪綠現(xiàn)象。發(fā)病植株果實的生長發(fā)育受到抑制，果實成熟期推遲，品質(zhì)變劣，產(chǎn)量嚴(yán)重下降，并伴有落葉落果現(xiàn)象。發(fā)病植株隨著發(fā)病年數(shù)的增長，病情逐漸加深，直至整株干枯、死亡(圖1)。

圖1 新疆杏褪綠卷葉病癥狀圖

2.2 杏褪綠卷葉植原體新疆分離物rp基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以54份杏褪綠卷葉病陽性樣品總DNA為模板，利用引物rpF1/rpR1對植原體rp基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果表明，部分樣品獲得了約1.2 kb的特異性條帶，同時，棗瘋病植原體也擴(kuò)增出相同的特異性條帶，而健康植株和滅菌超純水均未出現(xiàn)特異性條帶(圖2)。結(jié)果表明，所用引物對具有特異性，可從病樣中擴(kuò)增到與目的基因片段大小相符的條帶。

2.3 新疆杏褪綠卷葉植原體rp基因的克隆及序列分析

隨機(jī)選取4個杏褪綠卷葉病病樣(輪臺縣和托克遜縣病樣各2個)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化、克隆，提取質(zhì)粒、酶切鑒定，選取陽性克隆進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，新疆杏褪綠卷葉植原體核糖體蛋白基因片段長1196 bp，G+C含量為27.26%，包含部分rpS19基因以及完整的rpL22基因和rpS3基因。其中，rpL22基因以ATG為起始密碼子，由354個核苷酸組成的開放閱讀框編碼117個氨基酸；rpS3基因以ATG為起始密碼子，由753個核苷酸組成的開放閱讀框編碼250個氨基酸，在所含的3個基因中均以TAA作為終止密碼子，這些特性均與其他植原體核糖體蛋白基因序列相似。分別命名為ACLR-XJ01～ACLR-XJ04，登錄號分別為(MW366827～MW366830)。

將杏褪綠卷葉植原體新疆分離物的rp基因核苷酸序列在GenBank中經(jīng)BLAST比對檢索，并利用DNAstar軟件對核苷酸及氨基酸序列進(jìn)行相似性比較。結(jié)果表明，杏褪綠卷葉植原體新疆分離物ACLR-XJ01～ACLR-XJ04rp基因片段核苷酸序列無差異，相似性達(dá)到100%。杏褪綠卷葉植原體新疆分離物ACLR-XJ01～ACLR-XJ04與16SrⅤ-rp亞組各代表性植原體的rp基因核苷酸序列相似性達(dá)到95.7%～99.3%，其中與16SrⅤ組rpⅤ-C亞組的甜櫻桃綠化植原體SCV-JN-2013 (MF848954)和棗瘋病植原體分離物JWB(AY197681)、JWB-Zhangqiu(FJ154856)的親緣關(guān)系最近，序列相似性分別達(dá)到99.3%和99.2%，rpL22和rpS3基因編碼的氨基酸相似性分別達(dá)到98.3%和98.4%(表1)。

圖2 杏褪綠卷葉植原體rp基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

表1 杏褪綠卷葉植原體新疆分離物與其他植原體rp基因核苷酸和氨基酸同源性比較

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化及RFLP虛擬分析

將獲得的杏褪綠卷葉植原體新疆分離物rp基因序列與16SrV組及其他組代表性植原體rp基因序列進(jìn)行比較，共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，杏褪綠卷葉植原體新疆分離物與16SrV-rp亞組各株系聚在同一個大分支上，其中與rpV-C亞組的甜櫻桃綠化植原體SCV-JN-2013 (MF848954)和棗瘋病植原體分離物JWB(AY197681)、JWB-Zhangqiu(FJ154856)的親緣關(guān)系最近，聚為單獨(dú)的一個分支(圖3)。進(jìn)一步利用pDRAW 32軟件對杏褪綠卷葉植原體新疆分離物ACLR-XJ01和16SrV組中12個rpV亞組代表性分離物的rp基因序列(rpF1/rpR1擴(kuò)增片段)進(jìn)行AluⅠ等7種限制性內(nèi)切酶的虛擬RFLP分析，結(jié)果顯示，杏褪綠卷葉植原體新疆分離物rp基因的虛擬酶切圖譜不同于所有已建立的rpⅤ亞組參考模型，其中與rpV-C亞組(AY197681)相似性最高，但在MseⅠ、SspⅠ和TaqⅠ的酶切位點存在差異(圖4)，因此，推測杏褪綠卷葉植原體新疆分離物可能是16SrⅤ組中的一個新的rp亞組。

圖3 用鄰接法構(gòu)建的杏褪綠卷葉植原體新疆分離物rp基因系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 杏褪綠卷葉植原體新疆分離物與rpⅤ-C亞組代表性植原體rp基因虛擬RFLP酶切圖譜

3 討論

新疆作為杏的原生起源中心，擁有豐富的杏種質(zhì)資源，栽培面積和產(chǎn)量均居全國各省(區(qū)) 之首，形成了環(huán)塔克拉瑪干大沙漠獨(dú)特的杏生態(tài)品種群和杏產(chǎn)業(yè)帶。發(fā)展杏產(chǎn)業(yè)對于地處極端干旱荒漠區(qū)、生態(tài)環(huán)境極為脆弱的南疆地區(qū)的防風(fēng)固沙、生態(tài)環(huán)境保護(hù)和地區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展都有著重要的意義。筆者于2016—2019年連續(xù)4年對新疆輪臺縣、托克遜縣杏褪綠卷葉病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該病害從零星、局部發(fā)生到范圍迅速擴(kuò)大、加重，表明新疆的地理氣候環(huán)境適宜該病害的發(fā)生，目前該病原極有可能已成功定殖并逐漸進(jìn)入流行期，給近年來蓬勃發(fā)展的新疆經(jīng)濟(jì)支柱林果產(chǎn)業(yè)帶來巨大隱患。本研究首次獲取了杏褪綠卷葉植原體新疆分離物rp基因分子信息，從亞組水平上確定了其分類地位和遺傳變異，為研究杏褪綠卷葉植原體新疆分離物的來源、進(jìn)化關(guān)系，建立杏褪綠卷葉植原體快速診斷和檢測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

韓冰(2012)首次對新疆輪臺縣杏褪綠卷病植原體16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序和序列分析，結(jié)果顯示，杏褪綠卷葉植原體新疆分離物16S rDNA基因與16SrV-B亞組棗瘋病植原體的同源性最高達(dá)到99.8%以上，僅有1～2個堿基的差異。艾克熱木·買買提等(2020)驗證了杏褪綠卷葉植原體新疆分離物16S rDNA基因序列的同源性，發(fā)現(xiàn)與韓冰已報道的杏褪綠卷葉植原體新疆分離物親緣關(guān)系很近，同源性達(dá)到99.6%，與16SrV-B亞組的棗瘋病植原體山東分離株、甜櫻桃綠化植原體山東分離株同源性最高,達(dá)到99.4%～99.6%，同樣未能在分子水平上體現(xiàn)出不同株系間的差異。這說明植原體在長期的進(jìn)化過程中16S rDNA基因十分保守，并不適合親緣關(guān)系較近的植原體株系的分類。在植原體株系關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)rp基因能夠揭示出更多有價值的信息和系統(tǒng)發(fā)育的標(biāo)記。Martinietal. (2007)對植原體各代表株系進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示翠菊黃化組(16SrI組)和榆樹黃化組(16SrⅤ組)不同亞組間16S rDNA的序列相似性為98.4%～99.2%和98.6%～99.5%，rp基因的相似性為96.8%～98.2%和96.5%～98.1%，說明植原體rp基因較16S rDNA基因具有更大的變異性，更適合用于同一組內(nèi)親緣關(guān)系更近的株系間的分類。本研究通過對杏褪綠卷葉植原體新疆分離物rp基因的同源性分析發(fā)現(xiàn)，杏褪綠卷葉植原體新疆分離物與16SrV組(rpV-C)亞組的櫻桃綠化植原體和棗瘋病植原體親緣關(guān)系最近，核苷酸相似性達(dá)到99.2%～99.3%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一簇，并未表現(xiàn)出明顯的遺傳分化。但進(jìn)一步利用RFLP虛擬酶切分析發(fā)現(xiàn)，杏褪綠卷葉植原新疆分離物rp基因的酶切圖譜與已報到的12個rpV亞組代表性分離物之間均存在一定的差異，盡管與rpⅤ-C亞組代表性植原體的酶切圖譜最為相似，但在限制性內(nèi)切酶MseⅠ、SspⅠ和TaqⅠ的酶切位點上也存在明顯差異，因此推測杏褪綠卷葉植原體新疆分離物屬于榆樹黃化組(16SrV)的一個新rpV亞組。該結(jié)果不但證明了rp基因更適合親緣關(guān)系較近的植原體株系的分類，同時也表明RFLP分析更能有效地揭示植原體DNA水平上的遺傳多樣性。

杏褪綠卷葉病于1973年首次在法國杏樹上被發(fā)現(xiàn)，之后陸續(xù)在歐洲多國相繼發(fā)生，在亞洲國家土耳其、伊朗、黎巴嫩也有報道。研究發(fā)現(xiàn),盡管不同國家所報道的杏褪綠卷葉病癥狀相似，但所鑒定的ACLR病原在分類地位上差異顯著。如捷克、比利時、土耳其、白俄羅斯等國發(fā)生的ACLR病原被鑒定為16SrX-B亞組植原體(Navratiletal.,2001; Olivieretal.,2003; Sertkayaetal.,2005; Valasevichetal.,2016)；德國、黎巴嫩發(fā)生的ACLR病原被鑒定為16SrI-F亞組植原體(Abou-jawdaetal.,2011; Hodgettetal.,2008)；伊朗發(fā)生的ACLR病原被鑒定為16SrⅡ-C亞組植原體(Rasoulpouretal.,2019)；而本研究發(fā)現(xiàn)引起新疆杏褪綠卷葉病的植原體在系統(tǒng)分類上應(yīng)歸于16SrⅤ組。由此可見，杏樹可被多種植原體侵染并引起相似的癥狀，不同分類地位的植原體在杏樹上為何能夠引起相似的癥狀，其致病機(jī)制如何，還有待深入的研究。