龍 祝 胡 佳 楊慶金 方 瑩 郭小華

(中南民族大學生命科學學院，武漢 430074)

大米蛋白粉是稻米加工淀粉后的副產(chǎn)物，過濾掉大米漿液后，剩下的殘渣中的蛋白質(zhì)含量高達50%(干基)以上[1]。作為一種低過敏性的植物高蛋白來源，大米蛋白粉與豆粕、棉粕和菜粕不同，自身不含抗營養(yǎng)因子、激素和其他有毒成分，是一種安全、衛(wèi)生、環(huán)保和綠色的材料[2]。大米蛋白具有良好的氨基酸組成配比，其飼用品質(zhì)要優(yōu)于小麥蛋白和玉米蛋白，必需氨基酸組成的配比與WHO 1973年認定的蛋白質(zhì)最佳氨基酸配比模式最為符合[3]。目前已有較多的研究證明了大米蛋白粉的飼用價值，付京花等[4]在凡納濱對蝦日糧中使用大米蛋白替代魚粉，發(fā)現(xiàn)60%的魚粉被大米蛋白替代后對對蝦的生長無顯著影響。Oujifard等[5]的研究結(jié)果也表明，南美白對蝦日糧中大米蛋白濃縮物可以有效代替達50%的魚粉。大米蛋白粉的飼用開發(fā)既可以提高稻谷的附加值，更能有效替代魚粉，從而能減少飼料日糧中對魚粉蛋白的依賴，大大降低飼料配方成本。

本研究嘗試利用有益微生物采用固態(tài)發(fā)酵的方法對大米蛋白粉進行處理，擬提高蛋白水解率和酸溶蛋白含量，增加飼用營養(yǎng)價值，為生產(chǎn)質(zhì)量更高的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料源提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

采用3種常見的有益微生物發(fā)酵劑，分別是：BacillusamyloliquefaciensBS-20(以下簡稱BS-20)、LactobacillusreuteriC5(以下簡稱C5)、SaccharomycescerevisiaeSC18(以下簡稱SC18)，菌株均為實驗室自行分離鑒定并評估具有良好益生菌潛力。菌種保存于-80 ℃下含20%甘油的凍存管中。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：芽孢桿菌培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、氯化鈉5 g/L)；酵母菌培養(yǎng)用YPD培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖20 g/L)；乳酸菌培養(yǎng)用MRS培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L、牛肉浸粉5 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、吐溫80 1 mL/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L)。

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)：以大米蛋白粉、麩皮(均為市售)按照一定比例混合作為固體組分；液體組分中含有葡萄糖8 g/L、蛋白胨2 g/L、硫酸錳0.001 mol/L。發(fā)酵基質(zhì)以固態(tài)組分和液體組分根據(jù)實驗需要按照一定比例混合形成一定的初始含水量。

1.3 主要儀器

K-360 BUCHI凱氏定氮儀，V-5600可見光分光光度計，SPX智能型生化培養(yǎng)箱，SX-500型自動高壓滅菌鍋。

1.4 發(fā)酵劑的制備

BS-20從斜面刮取一接種環(huán)于含有50 mLLB液態(tài)培養(yǎng)基的三角瓶中，放入37 ℃搖床培養(yǎng)箱中200 r/min隔夜培養(yǎng)；C5從含有15%甘油保存的厭氧管中接種1%于50 mLMRS培養(yǎng)基中，放入37 ℃靜置培養(yǎng)箱中隔夜培養(yǎng)，SC18從斜面刮取一接種環(huán)于含有50 mLYPD液態(tài)培養(yǎng)基的三角瓶中，放入30 ℃搖床培養(yǎng)箱中200 r/min隔夜培養(yǎng)。

1.5 發(fā)酵底物的處理

稱取一定量的大米蛋白粉和麩皮按照一定配比混合置于250 mL的三角瓶中，總裝樣量為30 g，加入液體組分混合均勻后置于滅菌鍋中115 ℃滅菌處理20 min，待涼至室溫后于超凈工作臺中接入新鮮的發(fā)酵劑，混合均勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每間隔一段時間搖動拍打三角燒瓶，使均勻發(fā)酵。

1.6 單因素實驗

1.6.1 固態(tài)基質(zhì)中初始大米蛋白粉含量對發(fā)酵的影響

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)采用在大米蛋白粉中加入麩皮來促進發(fā)酵基質(zhì)疏松度，初始大米蛋白粉的含量分別是90%、80%、70%、60%，按照10%的接種量(以固態(tài)基質(zhì)總量計)接種單一芽孢桿菌BS-20，補加液體組分使固態(tài)基質(zhì)初始含水量均為53%，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵基質(zhì)中酸溶蛋白的含量。同時分別測定每個固態(tài)基質(zhì)中初始的酸溶蛋白水平，計算發(fā)酵前后基質(zhì)中酸溶蛋白的增加量。

1.6.2 初始含水量對發(fā)酵的影響

以1.6.1中優(yōu)化的初始大米蛋白粉含量為基礎，根據(jù)固液混合比例的不同設置發(fā)酵基質(zhì)中不同的初始含水量水平分別為44%、47%、50%、53%，其余條件同1.6.1,測定發(fā)酵完成后固態(tài)基質(zhì)中酸溶蛋白的含量。

1.6.3 不同菌株組合對發(fā)酵效果的影響

以1.6.2中優(yōu)化的合適初始含水量為基礎，以接種10%單一的芽孢桿菌BS-20單菌株發(fā)酵為對照，在保持初始含水量一致的條件下，分別接種乳酸桿菌(即5%的BS-20+5%的C5)、酵母菌(即5%的BS-20+5%的SC18)以及三種復合發(fā)酵劑(即3.4%的BS-20+3.3%的C5+3.3%的SC18)，其余條件同1.6.2，測定發(fā)酵完成后固態(tài)基質(zhì)中酸溶蛋白的含量。

1.6.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響

以1.6.3中優(yōu)化的菌株組合為基礎，固態(tài)基質(zhì)在采用不同的發(fā)酵時間，即分別24、36、48、60、72、84、96、108、120 h時取樣測定基質(zhì)中酸溶蛋白的含量。

1.7 Box-Behnken實驗

利用JMP11.0進行響應面設計，對單因素實驗中篩選出的對發(fā)酵影響較顯著的三個因子設計三水平的Box-Behnken中心復合實驗，測定各組實驗固態(tài)基質(zhì)中酸溶蛋白含量并作為響應值，共設計15組實驗，其中3個中心點重復實驗，實驗設計因素水平及編碼見表1，實驗設計見表2。

1.8 固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化的結(jié)果驗證

根據(jù)響應面優(yōu)化的發(fā)酵條件進行實際重復發(fā)酵實驗，對發(fā)酵前后固態(tài)基質(zhì)中中粗蛋白和酸溶蛋白含量進行定量檢測，比較發(fā)酵前后大米蛋白粉中粗蛋白和酸溶蛋白含量的變化情況。

1.9 分析方法

發(fā)酵優(yōu)化實驗中，固態(tài)基質(zhì)中的酸溶蛋白采用三氯乙酸法，即取一定量固體發(fā)酵后的樣品經(jīng)無菌生理鹽水10倍稀釋，充分震蕩混勻后靜置，6 000r/min離心5 min得到上清液，取一定量上清液與10%三氯乙酸1∶1反應2 h，離心取上清，采用福林酚法檢測上清中可溶于三氯乙酸中的蛋白質(zhì)濃度[6]。

在發(fā)酵驗證實驗中，粗蛋白和酸溶蛋白含量的定量檢測分別參照GB/T 22492—2008中大豆肽粉酸溶蛋白含量的測定[7]及GB/T 6432—2018中飼料中粗蛋白的測定全量凱氏定氮法[8]進行操作及計算，即分別對發(fā)酵前后的樣品真空干燥后，用研缽磨成粉末狀，再按照國標中的檢測方法來分別進行測定。

1.10 數(shù)據(jù)處理

本實驗中每個實驗均是基于3個平行實驗的結(jié)果，統(tǒng)計結(jié)果以3個平行結(jié)果的均值±標準差的形式來表示；單因素實驗均采用Origin9.1進行數(shù)據(jù)分析，采用One-Way ANOVA程序?qū)?shù)據(jù)進行單因素方差分析，用Duncan氏法進行多重比較檢驗，P<0.05表明數(shù)據(jù)差異性顯著。Box-Behnken實驗用JMP11.0進行響應面擬合模型設計和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素條件確定

2.1.1 初始大米蛋白粉含量對發(fā)酵效果的影響

固態(tài)發(fā)酵中添加麩皮一方面可以降低大米蛋白粉的黏度，增加物料的通氣性，另外還能改善培養(yǎng)基的營養(yǎng)，彌補固態(tài)基質(zhì)中碳源的不足[9]。本實驗添加麩皮后不同的大米蛋白粉含量對發(fā)酵效果的影響結(jié)果如圖1所示，當大米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)為80%和70%時，酸溶蛋白含量較高。當大米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)為70%時，酸溶蛋白增加最多。過高的初始大米蛋白粉添加會降低發(fā)酵基質(zhì)中的疏松度，不利于好氧性芽孢桿菌的增殖代謝，減少酸溶蛋白的積累；而當添加的麩皮含量進一步提高時，固態(tài)基質(zhì)中酸溶蛋白增加量有所降低，這可能是過多的麩皮改變了基質(zhì)的C/N比值，降低了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，不利于芽孢桿菌的生長代謝[10]。因此，本實驗選擇初始大米蛋白粉含量為70%進行下一步實驗。

圖1 初始大米蛋白含量對發(fā)酵效果的影響

2.1.2 培養(yǎng)基含水量、不同菌株組合、發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響

基質(zhì)含水量對固態(tài)發(fā)酵過程具有重要影響，這可能是由于高水分含量會形成低的基質(zhì)孔隙率而導致氧氣轉(zhuǎn)移的減少，而低的水分含量可能會導致營養(yǎng)物質(zhì)擴散不良[11]。培養(yǎng)基中含水量對發(fā)酵效果的影響如圖2所示，結(jié)果表明，在含水量從44%增加至50%時，酸溶蛋白水平隨含水量的增加而增加，當含水量達到50%時，酸溶蛋白水平達到最大；當含水量進一步增加時酸溶蛋白含量反而顯著降低，這可能是因為過多的水分降低了固態(tài)基質(zhì)的疏松性，導致了芽孢桿菌生長環(huán)境中溶解氧的降低。此結(jié)果與張連忠等[12]的研究固態(tài)發(fā)酵時含水量在50%～60%較為適宜相一致。最終選擇含水量為50%進行下一步實驗。

復合菌株進行協(xié)同發(fā)酵可發(fā)揮不同微生物之間的協(xié)同性和互補性，總體上對發(fā)酵效果產(chǎn)生良好的影響[13]。本研究嘗試在芽孢桿菌BS-20單菌株發(fā)酵的基礎上添加酵母菌SC18和乳酸菌C5來提高發(fā)酵基質(zhì)中酸溶蛋白的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在芽孢桿菌BS-20進行單菌株發(fā)酵時，發(fā)酵基質(zhì)中的酸溶蛋白含量反而最高，其他添加了酵母菌SC18和乳酸菌C5的處理組中酸溶蛋白的含量都顯著降低(圖2)。這可能是由于不同的菌株在同一基質(zhì)中生長存在拮抗作用，酵母菌及乳酸菌的接入抑制了芽孢桿菌的生長，降低了對大米蛋白中大分子蛋白的降解效果[14]。劉雪花[15]研究證明混菌株發(fā)酵豆粕與單菌株相比酸溶蛋白含量反而有所下降。進行單菌株發(fā)酵還能簡化生產(chǎn)工藝，大幅度降低工業(yè)生產(chǎn)成本。最終選擇芽孢桿菌BS-20單菌株發(fā)酵進行下一步實驗。

發(fā)酵時間是固態(tài)發(fā)酵過程中非常重要的一個環(huán)節(jié)，適宜的發(fā)酵時間可以得到最大的酸溶蛋白得率[16]。本實驗中發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)酸溶蛋白水平的影響結(jié)果如圖2所示，時間從24～84 h時，酸溶蛋白含量持續(xù)有較大增幅，從40 mg/g增至180 mg/g左右，且在發(fā)酵時間為84 h時含量達到最高。繼續(xù)延長發(fā)酵時間，固態(tài)基質(zhì)中酸溶蛋白含量不再增加，說明芽孢桿菌在發(fā)酵周期內(nèi)其代謝能力已經(jīng)釋放完全。在固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)過程中，更短的發(fā)酵時間能減少成本與能源的消耗。發(fā)酵時間過長一方面增加發(fā)酵成本，另一方面增加污染的可能性，影響產(chǎn)品的品質(zhì)。故大米蛋白粉發(fā)酵時間選擇84 h左右效果較好。

圖2 培養(yǎng)基含水量、不同菌株組合、發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響

2.2 Box-Behnken實驗結(jié)果

從上述單因素實驗結(jié)果可知，大米蛋白粉含量、含水量和發(fā)酵時間對發(fā)酵效果有顯著影響，以大米蛋白粉質(zhì)量分數(shù)為70%、含水量50%、發(fā)酵時間84 h為中心點，固態(tài)基質(zhì)中酸溶蛋白含量為響應值進行響應面優(yōu)化。實驗因素水平及編碼如表1所示，其相應的實驗設計及結(jié)果見表2。使用軟件JMP11對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到二次多項響應面回歸模型：

根據(jù)方差分析結(jié)果(表3)可知，R2=0.931 3，P值為0.019 3，表明該模型擬合良好且回歸顯著，由F值可知，各因子貢獻率X3>X2>X1，即對發(fā)酵效果影響因子主次順序為：發(fā)酵時間>含水量>大米蛋白含量。

表1 實驗因素水平與編碼表

表2 響應面實驗設計與結(jié)果

表3 響應面模型的方差分析

由響應面實驗結(jié)果可知，大米蛋白含量、含水量和發(fā)酵時間具有顯著的交互作用。當大米蛋白質(zhì)量分數(shù)為70%、含水量52%、發(fā)酵時間為87 h時，酸溶蛋白含量有最大值為175.63 mg/g。

2.3 固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化的結(jié)果驗證

酸溶蛋白由小分子肽和游離氨基酸組成，能被動物腸道直接消化吸收利用，其含量的高低反應出原料中大分子蛋白被降解的情況，決定了大米蛋白經(jīng)發(fā)酵處理后的品質(zhì)高低[17]。本實驗中大米蛋白粉經(jīng)微生物發(fā)酵后，由于所用解淀粉芽孢桿菌具有良好的產(chǎn)酶特性[18]，將大米蛋白粉中大部分原本難以被直接利用的大分子蛋白降解成小分子蛋白和肽類，發(fā)酵產(chǎn)物中酸溶蛋白的含量大幅度提高，使得大米蛋白粉的營養(yǎng)和功能特性得到了大幅度的改善。其驗證結(jié)果如表4所示。

發(fā)酵后基質(zhì)中粗蛋白含量也有一定的增加。一方面可能是由于微生物具有利用大米蛋白粉中營養(yǎng)物質(zhì)，降解纖維素合成自身菌體蛋白的能力[19]。另一方面有可能是由于發(fā)酵過程中微生物能夠利用物料中的糖分，使得發(fā)酵后物料的總質(zhì)量減少從而間接提高粗蛋白的含量[20]。

表4 發(fā)酵前后基質(zhì)中粗蛋白和酸溶蛋白含量的變化

3 結(jié)論

本實驗為大米蛋白粉的開發(fā)利用提供了一種工藝條件：在大米蛋白粉添加量為70%，添加水分達到52%時，采用單菌株BacillusamyloliquefaciensBS-20按照10%的接種量接種發(fā)酵，發(fā)酵時間87 h。在此條件下發(fā)酵后的產(chǎn)物中酸溶蛋白含量達到40.5%，與發(fā)酵前相比提高率為128.7%，產(chǎn)物中粗蛋白含量達到59.5%,與發(fā)酵前相比提高率為12.5%。此發(fā)酵工藝條件使得大米蛋白粉的營養(yǎng)成分得到較大提高，大幅度提升了飼用大米蛋白粉的品質(zhì)。