陳 俊，曹 陽(yáng)，汪定奇，李娟娟，易夢(mèng)凡，周 衛(wèi)，吳曉琴

(武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢，430081)

利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)有機(jī)酸，具有原料來源豐富、產(chǎn)品成本低廉、食用安全性高等優(yōu)點(diǎn)[1]，而谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum，C.glutamicum)則是經(jīng)典的食品安全級(jí)微生物，其培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快，并且全基因組序列已知，遺傳背景清晰，利于遺傳改造[2-4]，經(jīng)遺傳改造的C.glutamicum可以高效用于生產(chǎn)琥珀酸[5]、丙酮酸[6]和L-蘋果酸[7]等有機(jī)酸。C.glutamicum經(jīng)糖酵解所產(chǎn)生的丙酮酸在有氧條件下經(jīng)過TCA循環(huán)最終生成草酰乙酸，在此循環(huán)中，多種有機(jī)酸如琥珀酸、富馬酸和蘋果酸等被合成；而在厭氧條件下，丙酮酸將通過還原TCA或rTCA途徑，經(jīng)草酰乙酸直接轉(zhuǎn)化成蘋果酸、富馬酸和琥珀酸，該途徑是合成四碳二羧酸得率較高的途徑，丙酮酸通過固定二氧化碳，使得理論上的糖酸轉(zhuǎn)化率高達(dá)200%[8]，因此，無(wú)論從有機(jī)酸的產(chǎn)率、安全性還是立體選擇性等方面考慮，C.glutamicum都是非常理想的有機(jī)酸生產(chǎn)菌株。不過，野生型C.glutamicum雖在代謝途徑中生成多種有機(jī)酸，但并不積累這些有機(jī)酸，故本課題組構(gòu)建了阻斷乙酸和乳酸合成途徑的C.glutamicumCZ04重組菌株[9]，在此基礎(chǔ)上，本文采用同源重組的方法，通過引入超氧化物歧化酶基因啟動(dòng)子(Psod)以增強(qiáng)羧化途徑的關(guān)鍵酶活性，進(jìn)而強(qiáng)化C.glutamicum的羧化代謝途徑，同時(shí)檢測(cè)了相應(yīng)有機(jī)酸的積累情況，以期為微生物發(fā)酵技術(shù)在實(shí)踐中的應(yīng)用提供參考。

1 試驗(yàn)

1.1 材料及重組菌株的構(gòu)建

1.1.1 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基中胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉的質(zhì)量濃度分別為10、5、10 g/L，在此基礎(chǔ)上按15 g/L添加瓊脂粉制得LB固體培養(yǎng)基。

LBG液體培養(yǎng)基中葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉的質(zhì)量濃度分別為10、10、5、10 g/L，在此基礎(chǔ)上按15 g/L添加瓊脂粉制得LBG固體培養(yǎng)基。

BHIS液體培養(yǎng)基中胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、腦心浸粉、山梨醇的質(zhì)量濃度分別為5、2.5、5、18.5、91 g/L，在此基礎(chǔ)上按15 g/L添加瓊脂粉制得BHIS固體培養(yǎng)基。

發(fā)酵種子液培養(yǎng)基中葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、NaAc的質(zhì)量濃度分別為 20、5、2.5、5、2.5 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖、NaAc、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4·4H2O、FeSO4·7H2O的質(zhì)量濃度分別為20、5、0.75、0.75、5、0.5、0.2、0.02、0.005 g/L，VH和VB1的質(zhì)量濃度均為0.2 mg/L。

1.1.2 主要試劑

質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均為美國(guó)Omega公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶為美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；T4 DNA ligase為寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品，fastpfuPCR Mix DNA聚合酶購(gòu)自北京佳蘭生物科技有限公司；所用引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；乙腈(色譜純)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其它均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 重組菌株的構(gòu)建

本研究所用C.glutamicum出發(fā)菌株(編號(hào)CZ04)為本課題組前期構(gòu)建，C.glutamicum的部分代謝路徑如圖1所示。

圖1 C.glutamicum部分代謝流程圖

在CZ04的ppc基因前敲入超氧化物歧化酶基因啟動(dòng)子(Psod)，具體步驟如下：以C.glutamicumATCC 13032的基因組DNA為模板，擴(kuò)增ppc基因上、下游同源臂及Psod三個(gè)片段，采用融合PCR將上述三個(gè)片段融合，并將其克隆至pK19mobsacB載體，重組質(zhì)粒命名為pK19mobsacB-Psod-ppc。采用同樣的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pK19mobsacB-Psod-pyc。

通過電轉(zhuǎn)化法[10-11]將重組質(zhì)粒pK19mobsacB-Psod-ppc轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞CZ04中，涂布到含有卡那霉素(30 μg/mL)的BHIS固體平板上，經(jīng)初篩和復(fù)篩后，正確的重組菌株命名為CZ05，按同樣方法構(gòu)建重組菌株CZ06和CZ07。本研究中所用菌株和質(zhì)粒列于表1，所用引物列于表2。

表1 菌株和質(zhì)粒

表2 引物

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 酶活測(cè)定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PPC)酶活測(cè)定參照文獻(xiàn)[12-13]進(jìn)行。丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PYC)酶活測(cè)定參照文獻(xiàn)[14-15]進(jìn)行。

1.2.2 菌體密度測(cè)定

挑取新鮮的單菌落，接種到LBG培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取1 mL菌液接種到種子培養(yǎng)基中并測(cè)定菌液初始OD600的值，之后每3 h測(cè)一次菌液濃度，直至衰亡期，每種菌株設(shè)置3個(gè)平行樣。測(cè)定過程中，將菌液稀釋一定的倍數(shù)，使用752N型紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)量，檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm。

1.2.3 葡萄糖濃度及有機(jī)酸含量測(cè)定

菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)厭氧培養(yǎng)時(shí)，每12 h檢測(cè)葡萄糖的濃度，所用儀器為SBA-40E型葡萄糖分析儀。

使用P680型高效液相色譜儀檢測(cè)樣品中的L-蘋果酸、琥珀酸及丙酮酸含量，分析條件為：色譜柱為AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為KH2PO4、乙腈混合液二者體積比為99∶1， KH2PO4濃度為20 mmol/L，進(jìn)樣量為20 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為25 ℃，流速為0.5 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的鑒定

菌株CZ05、CZ06及CZ07的PCR鑒定結(jié)果如圖2所示。已知用于同源重組的上、下游同源臂片段大小約為500 bp，psod片段大小約為200 bp。由圖2(a)中的泳道1可知，當(dāng)以重組菌株CZ05的基因組DNA為模板、以同源臂引物ppcU1和ppcD2擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物為上游同源臂、啟動(dòng)子和下游同源臂三者融合片段，擴(kuò)增條帶大小介于1000～2000 bp之間，這與理論值1200bp相吻合；由圖2(a)中的泳道2可知，當(dāng)以對(duì)照菌株CZ04的基因組DNA為模板、以同源臂引物ppcU1和ppcD2擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物為上、下游同源臂融合片段，因缺乏sod基因啟動(dòng)子，該片段介于1000～2000 bp之間但略小于泳道1相應(yīng)值，這也與理論值(1000 bp)相一致；由圖2(a)中的泳道3可知，當(dāng)以CZ05基因組DNA為模板、以同源臂引物ppcU1和啟動(dòng)子引物sod-ppc-U2擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物為上游同源臂、啟動(dòng)子二者融合片段，擴(kuò)增條帶大小介于500～1000 bp之間，這仍與理論值(700 bp)相吻合；圖2(a)中的泳道4所示為以CZ04基因組DNA為模板、以同源臂引物ppcU1和啟動(dòng)子引物sod-ppc-U2擴(kuò)增時(shí)的情形，由于對(duì)照菌株CZ04的ppc基因前面缺乏sod基因啟動(dòng)子，故而不能擴(kuò)增出產(chǎn)物；圖2(a)中的泳道5所示為以CZ05基因組DNA為模板、以啟動(dòng)子引物sod-ppc-U1和同源臂引物ppcD2進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)的情形，擴(kuò)增產(chǎn)物為啟動(dòng)子、下游同源臂融合片段，實(shí)測(cè)值與理論預(yù)期值(700 bp)一致，而對(duì)照菌株CZ04則未能擴(kuò)增出條帶(見圖2(a)泳道6)。綜合上述結(jié)果可以判斷，sod基因啟動(dòng)子已成功敲入到ppc基因前面。至于重組菌株CZ06、CZ07，相應(yīng)的鑒定結(jié)果(分別見圖2(b)、圖2(c))也均與預(yù)期相符，此處不再贅述。

(a)CZ05 (b)CZ06

(c)CZ07

2.2 酶活檢測(cè)結(jié)果與分析

PCR鑒定證實(shí)sod基因啟動(dòng)子已成功敲入相應(yīng)的靶基因前面，為了確定sod基因啟動(dòng)子是否能夠增強(qiáng)靶基因表達(dá)，對(duì)靶基因ppc和pyc的編碼產(chǎn)物進(jìn)行了酶活檢測(cè)與分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，與對(duì)照菌株CZ04相比，單獨(dú)上調(diào)ppc基因的重組菌株CZ05，其PPC酶活提高了62%，而PYC酶活則略有降低；單獨(dú)上調(diào)pyc基因的菌株CZ06，其PYC酶活提高了116%，PPC酶活也略有升高；同時(shí)上調(diào)ppc和pyc基因的菌株CZ07，其PPC酶活提高了67%，PYC酶活提高了120%。檢測(cè)結(jié)果表明，將C.glutamicum超氧化物歧化酶基因sod啟動(dòng)子敲入ppc和pyc基因的上游，可以有效提高PPC和PYC這兩種酶的活性，尤其對(duì)PYC酶活的促進(jìn)作用更為顯著，并且ppc和pyc基因雙上調(diào)的菌株CZ07，其PPC和PYC酶活均高于單獨(dú)上調(diào)ppc或pyc基因的菌株CZ05及CZ06。

(a)PYC

(b)PPC

2.3 菌株的生長(zhǎng)特性

菌株CZ04、CZ05、CZ06、CZ07分別在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。從圖4(a)中可以看出，各菌株在種子培養(yǎng)基中經(jīng)搖瓶培養(yǎng)12 h后，相應(yīng)生長(zhǎng)周期均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，其中對(duì)照菌株CZ04的生長(zhǎng)速度最快，在培養(yǎng)15 h時(shí)即達(dá)到最大值，之后進(jìn)入平臺(tái)期。菌株CZ05、CZ06、CZ07生長(zhǎng)速度達(dá)到最大值的時(shí)刻均比CZ04滯后約6 h，但四者的最大生物量沒有顯著差異。另外，單獨(dú)上調(diào)PYC的CZ06與單獨(dú)上調(diào)PPC的CZ05及PPC、PYC雙上調(diào)的CZ07相比，前者的最大生物量較后兩者略高，并且后兩者最大生物量非常接近，這表明PPC的上調(diào)對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響占主導(dǎo)作用。從圖4(b)中可看出，4種菌株都以較快速度在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，在培養(yǎng)階段前18 h內(nèi)，各菌株生長(zhǎng)速度幾乎相同，且均在培養(yǎng)24 h時(shí)達(dá)到最大濃度，此時(shí)轉(zhuǎn)厭氧發(fā)酵效果最好。菌株按最大濃度由高到低排序，依次為CZ04、CZ06、CZ05、CZ07。綜上所述，Psod啟動(dòng)子的敲入，雖大幅提高了PPC和PYC的酶活，但對(duì)菌株的生長(zhǎng)速度卻沒有明顯影響，這對(duì)于目的產(chǎn)物的積累是有利的。

(a)種子培養(yǎng)基

(b)發(fā)酵培養(yǎng)基

2.4 增強(qiáng)C.glutamicum羧化途徑對(duì)有機(jī)酸積累的影響

為了考察增強(qiáng)羧化途徑對(duì)有機(jī)酸積累的影響，將菌株在厭氧條件下培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液中有機(jī)酸的成分和濃度測(cè)試結(jié)果如圖5所示，相應(yīng)葡萄糖消耗量見圖6。由圖5及圖6數(shù)據(jù)計(jì)算可知，與出發(fā)菌株CZ04相比，單獨(dú)上調(diào)PPC或PYC的菌株CZ05和CZ06，其相應(yīng)的L-蘋果酸產(chǎn)率分別提高了63.2%和29.2%，琥珀酸產(chǎn)率分別提高了25%和23.2%，而丙酮酸產(chǎn)率則分別下降了38.6%和18.0%，總產(chǎn)酸率分別提高了7.2%和4.8%，同時(shí)，葡萄糖消耗量分別提高了11.1%和5.5%。因此，當(dāng)Psod分別單敲入時(shí)，相應(yīng)的總產(chǎn)酸率及葡萄糖消耗量均有一定程度的增加，這表明強(qiáng)啟動(dòng)子的敲入增強(qiáng)了CZ05、CZ06的羧化代謝通路，使磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸更多地轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，再通過草酰乙酸進(jìn)一步生成L-蘋果酸及下游產(chǎn)物琥珀酸，而L-蘋果酸的生成更依賴于丙酮酸的消耗轉(zhuǎn)化。當(dāng)同時(shí)上調(diào)PPC和PYC獲得CZ07時(shí)，相應(yīng)L-蘋果酸產(chǎn)率提高了63.7%，丙酮酸產(chǎn)率下降了32.6%，琥珀酸的產(chǎn)率提高了35.7%，總產(chǎn)酸率提高了11.8%，葡萄糖消耗量提高了22.2%，總產(chǎn)酸率和葡萄糖消耗量的提升效果均優(yōu)于單一上調(diào)PPC或PYC時(shí)的效果，這表明菌株CZ07的羧化途徑在菌株CZ05和CZ06的基礎(chǔ)上進(jìn)一步得到強(qiáng)化。

圖5 有機(jī)酸的檢測(cè)

圖6菌株的葡萄糖消耗

通過對(duì)野生型菌株進(jìn)行代謝途徑優(yōu)化來提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率，一般有以下兩個(gè)策略：第一，阻斷底物流向非目標(biāo)產(chǎn)物，即阻斷底物的消耗；第二，加速底物向目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。在本研究中，通過在催化底物向目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶基因前敲入強(qiáng)啟動(dòng)子Psod，增強(qiáng)關(guān)鍵酶活性，進(jìn)而加速催化底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。需要指出的是，雖然pyc和ppc基因前面敲入的都是sod基因啟動(dòng)子，但本研究結(jié)果表明，敲入sod基因啟動(dòng)子對(duì)PYC酶活性的提升作用較其對(duì)PPC酶活性的提升作用更強(qiáng)，這應(yīng)歸因于PPC酶活會(huì)被胞內(nèi)多種物質(zhì)抑制[16]，在C.glutamicum中，二羧酸代謝產(chǎn)物對(duì)PPC酶活均有一定的抑制作用，天冬氨酸和蘋果酸是PPC的強(qiáng)抑制劑，尤其天冬氨酸的抑制效果更強(qiáng)[17]。不過，在PPC中有一種氨基酸取代物D299N，可以減輕天冬氨酸的反饋抑制，提高草酰乙酸生成量以增強(qiáng)TCA循環(huán)并提高谷氨酸的產(chǎn)量[16]，這意味著PPC酶活性的提高，除了借助引入強(qiáng)啟動(dòng)子外，還可以聯(lián)合使用有效的PPC拮抗抑制劑，從而最大限度地釋放PPC的活性。此外，本研究中PPC酶活是在粗酶液條件下檢測(cè)的，粗酶液中可能有一些成分會(huì)抑制PPC酶活性，導(dǎo)致測(cè)量值低于相應(yīng)實(shí)際值。再則，在實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)過程中，胞內(nèi)有機(jī)酸如蘋果酸和天冬氨酸等的積累也會(huì)嚴(yán)重抑制PPC的活性，同時(shí)對(duì)其它關(guān)鍵酶亦有抑制作用[18-19]，造成有機(jī)酸合成能力下降。上調(diào)PPC和PYC，有利于有機(jī)酸的生成和積累，但是高濃度的有機(jī)酸又對(duì)PPC和PYC形成反饋抑制，因此，盡快地轉(zhuǎn)移產(chǎn)物，減少產(chǎn)物反饋抑制，也是大量生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)必須考慮的因素。在本研究中，單獨(dú)上調(diào)PPC或PYC的菌株CZ05和CZ06都能有效提高有機(jī)酸的產(chǎn)量，而PPC、PYC雙上調(diào)的菌株CZ07，其PPC、PYC酶活以及產(chǎn)生有機(jī)酸的能力均高于PPC或PYC單獨(dú)上調(diào)的菌株，這表明PPC和PYC可能在谷氨酸棒狀桿菌的糖酸轉(zhuǎn)換中存在協(xié)同作用。單獨(dú)上調(diào)PPC或PYC時(shí)，菌株CZ05的PPC酶活提高了62%，而菌株CZ06的PYC酶活則提高了116%，但菌株CZ05產(chǎn)酸量卻較菌株CZ06相應(yīng)值高2.26%，這表明C.glutamicum在厭氧發(fā)酵過程中，PPC較PYC的羧化作用更強(qiáng)，當(dāng)兩者同時(shí)過表達(dá)時(shí)發(fā)揮了協(xié)同作用。但是，增強(qiáng)羧化途徑后，相應(yīng)L-蘋果酸產(chǎn)量及葡萄糖消耗量的增幅并不是特別顯著，這可能是有機(jī)酸的累積形成了較強(qiáng)的產(chǎn)物反饋抑制所致，因?yàn)樵谕ǔＧ闆r下，有機(jī)酸不會(huì)自發(fā)分泌到胞外。為了提高有機(jī)酸分泌到胞外的量，可以嘗試改變發(fā)酵培養(yǎng)基成分，增加細(xì)胞壁的通透性，使胞內(nèi)積累的物質(zhì)更容易分泌到胞外，或者過表達(dá)有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，及時(shí)將產(chǎn)物運(yùn)出細(xì)胞，這對(duì)持續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物具有重要意義。

3 結(jié)語(yǔ)

利用同源重組的方法，在本課題組前期所構(gòu)建菌株C.glutamicumCZ04的ppc和pyc基因前敲入強(qiáng)啟動(dòng)子Psod，成功構(gòu)建了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)單獨(dú)上調(diào)的重組菌株CZ05、丙酮酸羧化酶(PYC)單獨(dú)上調(diào)的重組菌株CZ06以及PPC、PYC同時(shí)上調(diào)的重組菌株CZ07。經(jīng)酶活檢測(cè)，相比出發(fā)菌株CZ04，重組菌株CZ05的PPC 酶活提高了62%， CZ06的PYC 酶活提高了116%，而CZ07的PPC、PYC酶活則分別提高了67%、120%，三種重組菌株對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸得率分別為1.358、1.328、1.416 mol/mol葡萄糖。這表明，強(qiáng)啟動(dòng)子的引入有效提高了羧化途徑關(guān)鍵酶活性，進(jìn)而強(qiáng)化了C.glutamicum通過羧化途徑產(chǎn)酸的能力，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在厭氧條件下，上調(diào)PPC比上調(diào)PYC更有利于有機(jī)酸的積累。在本研究中，積累有機(jī)酸能力最強(qiáng)的是PPC和PYC同時(shí)上調(diào)的重組菌株CZ07，該菌株在厭氧發(fā)酵72h時(shí)L-蘋果酸、琥珀酸的積累量分別達(dá)到0.761、0.228 mol/mol葡萄糖，主要副產(chǎn)物為丙酮酸。