陳科諺，何海洪，柯娟玉，余蕙君，張立俊，王靜，周義文

南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，廣東 深圳 518110

在死亡的相關(guān)原因中，癌癥是四大原因之一，而肝癌在全球中致死率位列第三，它嚴(yán)重危害著人類的身心健康[1-2]。更為突出的是，肝癌患者五年存活率不到10%，一年存活率低于50%[3]。近年來(lái)，肝癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，不僅預(yù)后差，而且容易發(fā)生癌癥的轉(zhuǎn)移[4-5]。有研究通過(guò)基因治療精準(zhǔn)靶向定位殺傷腫瘤細(xì)胞，以及修正和替代病變基因，從而達(dá)到治療的效果[6-7]。

Survivin基因是一種存在于惡性腫瘤及胚胎組織中的獨(dú)特標(biāo)記物[8]，Survivin 是一種凋亡抑制蛋白，基因位于常染色體17q25，大小約14.7 kb，含有4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)顯子。Survivin 可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖分化和腫瘤血管生成。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)Survivin 基因的過(guò)度表達(dá)與多種腫瘤相關(guān)，包括胃癌、肝細(xì)胞癌以及頭頸部腫瘤，提示其可能作為一種新的腫瘤標(biāo)志物而成為檢測(cè)惡性腫瘤的指標(biāo)。而Survivin 的表達(dá)在很大程度上是從轉(zhuǎn)錄水平上來(lái)控制的，其主要通過(guò)位于Survivin 啟動(dòng)子鄰近區(qū)域的細(xì)胞周期依賴性元件(cell cycle-dependent elements，CDEs)和細(xì)胞周期同源區(qū)域(cell cycle homology regions，CHRs)來(lái)調(diào)節(jié)。它在正常組織中不存在，但在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分裂中發(fā)揮著重要的作用，具有一定的安全選擇性，且在腫瘤基因的靶向治療中，起著很強(qiáng)的促進(jìn)作用[9]。目前已有關(guān)于Survivin 信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的相關(guān)報(bào)道，但是Survivin 基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制并沒(méi)有明確。由于Survivin基因是目前發(fā)現(xiàn)的作用較強(qiáng)的凋亡抑制基因，而Survivin 基因與肝癌的發(fā)病及臨床病理特征具有一定的相關(guān)性，因此探討Survivin 基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制具有重要的意義。Survivin 不同于凋亡抑制蛋白家族的其他成員，其基因結(jié)構(gòu)中含有很多個(gè)細(xì)胞凋亡的氨基酸殘基，這種結(jié)構(gòu)能與半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶直接或間接相結(jié)合，進(jìn)而影響半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶與細(xì)胞凋亡存在著直接關(guān)系。因此，Survivin基因可作為靶向選擇的安全且特異腫瘤靶向治療基因，通過(guò)介導(dǎo)病毒載體攜帶基因?qū)氚屑?xì)胞而達(dá)到抗腫瘤的治療效果[10]。

1 材料與方法

1.1 材料 Caspase-3染色試劑盒(BioVision)、肝癌HepG2細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫(kù))、AV-PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Invitrogen)、胎牛血清(Gibco)、MTT 細(xì)胞增殖試劑盒(Solarbio)、蛋白定量試劑盒(BOSTER)、轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)、DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher)。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng) 肝癌HepG2 細(xì)胞種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用顯微鏡觀察，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%時(shí)，收集細(xì)胞。

1.2.2 慢病毒shRNA-Survivin 載體構(gòu)建 吉?jiǎng)P基因有限公司合成提供了shRNA-Survivin 慢病毒載體以及表達(dá)的質(zhì)粒，元件順序?yàn)閜HBLV-U6-Zs-Green-PGK-Pu-ro，克隆位點(diǎn)為XhoI/BamHI。

1.2.3 肝癌細(xì)胞的分組 將肝癌HepG2 細(xì)胞分A組、B組、C組三個(gè)組。A組作為對(duì)照組，此組未經(jīng)過(guò)任何處理。B 組為經(jīng)過(guò)空白載體慢病毒轉(zhuǎn)染；C 組為經(jīng)過(guò)shRNA-Survivin 載體慢病毒轉(zhuǎn)染。用熒光顯微鏡觀察經(jīng)過(guò)ZsGreen 熒光探針標(biāo)記后，細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染率。

1.2.4 檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖情況 將空白組、載體病毒組、shRNA-Survivin 慢病毒組三個(gè)組的細(xì)胞按照說(shuō)明書(shū)要求接種，37℃孵育箱培養(yǎng)，4 d 后加MTT 溶液20 μL，搖床上晃動(dòng)15 min后通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。

1.2.5 檢測(cè)肝癌細(xì)胞AV-PI凋亡情況 將A組、B組、C 組三個(gè)組的細(xì)胞按照AV-PI 操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)流式細(xì)胞分析儀器來(lái)檢測(cè)三組細(xì)胞的凋亡變化情況。

1.2.6 檢測(cè)Caspase-3 的表達(dá)量 根據(jù)熒光定量PCR 試劑盒的說(shuō)明書(shū)要求三組細(xì)胞融合率達(dá)80%后再經(jīng)2.5 g/L 的胰蛋白酶消化，離心后，進(jìn)行PCR 檢測(cè)預(yù)變性→變性→退火→延伸→終延伸，分別是94℃2 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃60 s，72℃5 min，25 個(gè)循環(huán)后計(jì)算目的基因的表達(dá)量。其中Survivin、Caspase-3、內(nèi)參基因(GAPDH)引物由上海生物工程有限公司生產(chǎn)，見(jiàn)表1。

表1 目的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌HepG2 細(xì)胞在37℃孵育箱內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)的細(xì)胞顯微鏡下觀察，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%時(shí)，可見(jiàn)到HepG2 肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)良好，見(jiàn)圖1。

圖1 肝癌HepG2 細(xì)胞形態(tài)圖(100×)

2.2 慢病毒shRNA-Survivin 載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)果 ShRNA-Survivin 載體慢病毒轉(zhuǎn)染率為87%，以HepG2 肝癌細(xì)胞為靶點(diǎn)種子細(xì)胞轉(zhuǎn)染，成功構(gòu)建了以熒光蛋白為熒光探針進(jìn)行轉(zhuǎn)染，見(jiàn)圖2。

圖2 熒光蛋白構(gòu)建的慢病毒shRNA-Survivin載體(200×)

2.3 各組細(xì)胞增殖能力比較 經(jīng)吸光度測(cè)定結(jié)果顯示，A 組、B 組和C 組肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，HepG2 肝癌細(xì)胞增殖率分別為(7.38±0.422)%、(8.99±0.382)%和(14.09±0.291)%，A 組、B 組的HepG2 肝癌細(xì)胞增殖率明顯低于C 組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=76.85，P＜0.05)。

2.4 各組細(xì)胞凋亡抑制率比較 各組數(shù)據(jù)顯示，A 組、B 組和C 組肝癌細(xì)胞凋亡抑制率分別為(4.56±1.37)%、(3.05±1.08)%和(39.45±12.88)%，A組、B組肝癌細(xì)胞凋亡抑制率明顯低于C組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.59，P＜0.05)。

2.5 各組肝癌HepG2細(xì)胞Survivin、Caspase-3的mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 經(jīng)熒光定量PCR 檢測(cè)，A組、B 組和C 組中Survivin 基因相對(duì)表達(dá)量分別為0.938±0.049、0.979±0.068和0.488±0.085，A組、B組的Survivin 基因相對(duì)表達(dá)量明顯多于C 組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；A組、B組和C組在Caspase-3中的Survivin mRNA 表達(dá)量分別為0.938±0.041、0.983±0.057 和0.388±0.076，A 組、B 組在Caspase-3 中的Survivin mRNA表達(dá)量亦明顯多于C組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，然而其發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯，但進(jìn)展卻十分迅速，確診時(shí)大多數(shù)患者己屬于晚期或已發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。同時(shí)原發(fā)性肝癌的治療也十分困難，預(yù)后也不是很好，自然生存時(shí)間很短，嚴(yán)重地威脅著人們的身體健康和生命安全?？焖賶堉呈歉伟┲匾纳飳W(xué)特點(diǎn)之一，肝癌的快速增殖是導(dǎo)致許多癌患者預(yù)后較差，5年生存率低的重要因素之一。因此，在我國(guó)研究肝癌的發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)行為、診療、預(yù)后等顯得更為重要和迫切。

目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡失衡與腫瘤發(fā)病有關(guān)，而參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的凋亡相關(guān)基因與腫瘤有顯著相的關(guān)性。Survivin參與疾病的發(fā)生與發(fā)展，是目前發(fā)現(xiàn)作用較強(qiáng)的凋亡抑制基因。在凋亡抑制蛋白家族中，它是分子量最小同時(shí)也是最強(qiáng)的凋亡抑制因子[11-12]。Survivin 在大多數(shù)腫瘤組織中都有一定的表達(dá)，并且與腫瘤的復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移等都有一定的關(guān)系[13]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)Survivin 基因與肝癌也有很密切的相互關(guān)系[14-17]。因此，本研究旨在通過(guò)研究構(gòu)建shRNA-Survivin 慢病毒載體，來(lái)探索Survivin 基因?qū)Ω伟┘?xì)胞增殖、凋亡過(guò)程中的表達(dá)分析。原發(fā)性肝癌的Survivin基因發(fā)病機(jī)理尚不明確，且十分復(fù)雜，它的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與基因的多態(tài)性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及新生血管增生異常等有關(guān)，且存在多個(gè)關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。因此，進(jìn)行Survivin基因在肝癌細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程中的表達(dá)及意義的研究非常重要。

之前研究主要集中在癌基因、抑癌基因方面。目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡失衡與包括腫瘤在內(nèi)的多種人類疾病有關(guān)。細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡，是多細(xì)胞生物維持生長(zhǎng)發(fā)育和組織形態(tài)所特有的，由多種基因參與表達(dá)、精密調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程，在維護(hù)多細(xì)胞生物的組織內(nèi)穩(wěn)定性方面有著重要作用。凋亡的發(fā)生主要有兩條途徑：死亡受體介導(dǎo)的外部凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)部凋亡途徑。細(xì)胞凋亡可分為兩大類：一是凋亡促進(jìn)基因，起著促進(jìn)凋亡作用。二是凋亡抑制基因，起著抑制凋亡的作用。這兩種凋亡涉及一系列相關(guān)基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控，同時(shí)也存在一定的關(guān)聯(lián)。通常情況下細(xì)胞在沒(méi)有受到凋亡信號(hào)的刺激時(shí)，凋亡蛋白表達(dá)量是不會(huì)增加的，促凋亡與促生存蛋白之間的蛋白表達(dá)量處于相對(duì)的穩(wěn)態(tài)，只有細(xì)胞受到凋亡信號(hào)的刺激，兩種蛋白的表達(dá)平衡被打破，細(xì)胞才會(huì)走向凋亡。如果對(duì)凋亡機(jī)制得以進(jìn)一步了解，將為腫瘤的治療開(kāi)辟一個(gè)新的方向。因此，對(duì)于凋亡相關(guān)基因的研究具有很重要的意義。

Caspase-3 是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用。Survivin 基因是通過(guò)與Caspase-3 直接結(jié)合后，使抑癌基因磷酸化周期蛋白依賴性激酶4活化，從而阻止Procaspase-3的激活，進(jìn)而參與調(diào)控細(xì)胞的病理生理過(guò)程。Survivin也可以對(duì)線粒體和死亡受體介導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑產(chǎn)生強(qiáng)大的抑制作用，其作用方式主要是通過(guò)蛋白直接結(jié)合和抑制上下游Caspases 分子而發(fā)揮作用。Survivin基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制基因,主要是通過(guò)直接抑制Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游的終末子Caspase-3 的活性，從而發(fā)揮抗凋亡作用。Survivin 基因可通過(guò)加快腫瘤細(xì)胞由G1→S 期的轉(zhuǎn)換以及使腫瘤細(xì)胞在G2/M 期逃避對(duì)凋亡的識(shí)別，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化。Survivin 基因能通過(guò)血管形成因子(VEGF、bFGF、Ang-1和COX-2)在血管形成的中間環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用。

因?yàn)镾urvivin 可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖分化和腫瘤血管生成，提示其可能作為一種新的腫瘤標(biāo)志物，成為檢測(cè)惡性腫瘤的指標(biāo)。通過(guò)Survivin 基因與中國(guó)人群腫瘤易感性的分析，進(jìn)而研究Survivin 基因與中國(guó)人群肝癌細(xì)胞的關(guān)系。

半胱氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)與ICE/CED-3 具有同源活性中心的序列，它是存在于胞質(zhì)溶膠結(jié)構(gòu)中的一種酶。Caspases 的共同特點(diǎn)是都含有半胱氨酸。本研究通過(guò)熒光定量PCR (RT-qPCR)方法檢測(cè)空白組、載體病毒組、shRNA-Survivin 慢病毒組Survivin mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平以及這三個(gè)組在Caspase-3的Survivin mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Caspase-3活性升高時(shí)，Survivin 蛋白及mRNA 的表達(dá)會(huì)明顯降低，并且細(xì)胞的凋亡比率上升同時(shí)結(jié)構(gòu)發(fā)生典型凋亡改變，與此同時(shí)微絲形態(tài)結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)也遭到了破壞。這就證明了轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞降低了細(xì)胞內(nèi)Survivin 基因的表達(dá)并激活了Caspase-3，進(jìn)一步通過(guò)活化的Caspase-3，從而破壞細(xì)胞骨架和微絲系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，可見(jiàn)shRNA-Survivin 對(duì)肝癌細(xì)胞具有抑制增殖和促進(jìn)凋亡的調(diào)節(jié)作用，可以抑制Survivin基因的表達(dá)。因此，Survivin 基因在肝癌組織中的表達(dá)含量與該腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后評(píng)估和治療效果密切相關(guān)。

本研究結(jié)果有助于指導(dǎo)原發(fā)性肝癌的早期篩查和預(yù)防，提前預(yù)知可能發(fā)生肝癌的預(yù)先評(píng)估和診斷時(shí)機(jī)。所以在未患肝癌時(shí)，提前篩查Survivin 基因?qū)Ω伟┮赘腥巳旱脑\斷開(kāi)辟了一個(gè)令人興奮的新途徑。傳統(tǒng)肝癌的篩查主要結(jié)合臨床癥狀、生化指標(biāo)AFP、B超等手段進(jìn)行檢測(cè)，但常常發(fā)現(xiàn)肝癌時(shí)已經(jīng)是晚期，而Survivin 基因的研究對(duì)于未患肝癌的易感人群來(lái)說(shuō)，卻可能起到提前預(yù)知、提前預(yù)測(cè)肝癌的發(fā)病概率，提前篩查出可能會(huì)有肝癌的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)的作用。由于肝癌與遺傳因素、環(huán)境因素、生活習(xí)慣、飲食習(xí)慣有很大關(guān)系，因此通過(guò)早期篩查Survivin 基因可能對(duì)提前制定預(yù)防原發(fā)性肝癌的個(gè)體化相關(guān)方案、提前采取相應(yīng)的預(yù)防措施起到重要作用。