魏 春,劉 春,劉心雨,張旭初,王 歡

(1.浙江工業(yè)大學 生物工程學院,浙江 杭州 310014;2.杭州紐龍日尚生物制品有限公司,浙江 杭州 310000)

膠原蛋白是一種生物高分子,它廣泛存在于動物結締組織中,約占體內蛋白總量的25%～30%,是哺乳動物體內分布最廣、質量分數(shù)最多的功能性蛋白。由于其良好的生物活性、生物相容性以及生物降解性,它在生物醫(yī)學、食品和化妝品等領域都有著廣泛的應用[1]。

膠原蛋白具有很強的穩(wěn)定性,是當下生物醫(yī)學、藥劑學、工業(yè)化學及材料學等研究的熱點之一。人源膠原蛋白的種類多且結構復雜,據統(tǒng)計,已經發(fā)現(xiàn)并且得到確認的共有30種以上的膠原蛋白,其中占比較多、研究較為透徹的是Ⅰ型、Ⅱ型以及Ⅲ型膠原蛋白[2]。從動物組織提取膠原蛋白成分雖然已有很長歷史,但是工藝復雜且單體分離較難,還可能攜帶病毒存在安全隱患,其產量較低不能滿足人們對膠原蛋白的巨大需求。相比之下,利用基因工程技術生產膠原蛋白具有提取法不具備的優(yōu)點,產品穩(wěn)定性及安全性高。因此,該技術近年來發(fā)展迅速,已經成功地進行了商化業(yè)開發(fā)與生產,各類相關研究也日趨深入。

1 膠原蛋白的結構

膠原蛋白由原膠原組成,每個原膠原都有一種特殊的三重螺旋結構,由3條α-螺旋的肽鏈纏繞而成,長度約為1 000個氨基酸殘基;每條α肽鏈通過左手螺旋纏繞,3條肽鏈一起形成一個大的右手螺旋結構(圖1)。膠原特有的左旋α鏈相互纏繞構成膠原的右手復合螺旋結構,這一區(qū)段稱為螺旋區(qū)段,區(qū)段最大特征是氨基酸呈現(xiàn)(Gly-X-Y)n周期性排列,其中X,Y位置為脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp)的比例很高,約占25%,是各種蛋白質中含量最高的;膠原蛋白中存在的羥基賴氨酸(Hyl)在其他蛋白質中不存在。羥脯氨酸(Hyp)不是以現(xiàn)成的形式參與膠原的生物合成,而是從已經合成的膠原肽鏈中的脯氨酸經羥化酶作用轉化來的。

圖1 膠原蛋白的三鏈螺旋結構

2 重組鼠膠原蛋白

1997年,Fukuda等[3]成功地將鼠IV型膠原α1鏈全克隆并轉染到CHO細胞株進行表達,但所得膠原蛋白以單鏈狀態(tài)居多,只有極少的三螺旋結構,大多數(shù)單鏈交聯(lián)成不規(guī)則的高級結構。1999年,Werten等[4]在畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)中成功分泌表達了大鼠Ⅰ,Ⅲ型膠原蛋白基因片段,分子質量約為2.1×104Da的片段表達量高達14.8 g/L,但是沒有三螺旋結構,也沒有發(fā)生羥基化。2002年,Bruin等[5]將一段分子質量約2.8×104Da的鼠Ⅰ型膠原α1鏈的螺旋結構區(qū)域克隆并轉化到多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)NCYC495中進行表達,由于酵母自身可以合成脯氨酸羥化酶(Prolyl 4-hydroxylase,P4H),對表達的膠原蛋白雖然具有一定的羥基化修飾能力,但是與天然膠原蛋白相比,羥基化并不充分,僅約65%。

3 重組人膠原蛋白

為了避免動物來源產品所帶來的高風險和不確定性,以及能充分利用膠原蛋白和明膠的優(yōu)良特性,許多研究人員利用基因工程的技術,選用各種宿主細胞,如轉基因植物、轉基因動物、昆蟲細胞、細菌和酵母等生產重組人膠原蛋白和明膠,其產品安全性好、質量穩(wěn)定,消除了傳統(tǒng)提取方法存在的病毒隱患,同時也改善了膠原蛋白和明膠的親水性及免疫排異性等問題。

3.1 動、植物表達重組人膠原蛋白

Toman等[6]報道了將膠原蛋白基因片段和αS1-乳腺酪蛋白特異性啟動子基因片段轉化小鼠,通過轉基因鼠的分泌型乳腺生產全長的人I型原膠原(Procollagen)。鼠乳中三螺旋結構的可溶性同型三聚體質量濃度達到8 mg/mL。該產量雖然較高,但是氨基酸分析顯示其中的羥脯氨酸質量分數(shù)只有正常水平的40%～45%。推測乳腺上皮細胞中P4H的水平是其羥基化的主要限速步驟,如果轉入編碼P4H的基因就可以大大降低這種限制。理論上共轉化膠原蛋白和P4H對應基因的動物能夠產生大量的作為重組膠原來源的乳汁,其中存在的安全隱患依舊沒有消除。

Tomita等[7]構建了載體并采用基因植入的方法,通過轉基因蠶的絲腺分泌表達人Ⅲ型膠原蛋白片段,其分泌的人Ⅲ型膠原蛋白片段的長度僅為人膠原蛋白全長的1/5,重組膠原蛋白質量分數(shù)也僅占蠶繭干質量的1%,且轉基因蠶絲腺中P4H活力偏低導致脯氨酸不能被充分羥基化。對此,日本廣島大學的Adachi等[8]采用多基因共表達技術實現(xiàn)膠原蛋白和高活力的P4H的共表達,結果顯示轉基因蠶的P4H活力是野生型的130倍,從而解決了脯氨酸不能充分羥基化的問題。2010年,該研究機構利用轉基因蠶的中部絲腺分泌表達了人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈,并通過導入桿狀病毒反式激活子IE1基因和培育純合子轉基因蠶,其表達量提高到了蠶繭干質量的8%[9]。由于目的蛋白分泌到蠶絲中親水的絲膠層,提取、純化雖然較為簡單,但仍因為轉基因蠶絲腺中P4H活力較低,造成所表達出的人Ⅰ型膠原蛋白α1鏈缺乏羥脯氨酸,不能形成三螺旋結構。

Merle等[10]通過共轉化人Ⅰ型膠原蛋白基因和嵌合的P4H對應基因至煙草植株,成功表達了羥基化的同型三聚體重組膠原蛋白。這是第一次運用瞬時表達技術,在煙草中共表達動物細胞來源的修飾酶,從而提高了植物中重組蛋白的質量。Eskelin等[11]以大麥種子作為宿主,成功表達了人Ⅰ型膠原蛋白的全長α1鏈。研究者同時也在嘗試利用昆蟲細胞表達人膠原蛋白。Nokelainen等[12]構建了兩株桿狀病毒表達系統(tǒng),其中一株編碼人Ⅲ型原膠原α1鏈,另一株編碼人P4H的α和β亞基,通過共感染昆蟲細胞,成功表達了人膠原蛋白,并具有穩(wěn)定三螺旋結構,表達量達50 mg/L。

由于動、植物細胞的培養(yǎng)難度大,成本高,想要大規(guī)模生產不太理想。因此,采用微生物作為宿主仍然是較為理想的選擇。

3.2 微生物表達重組人膠原蛋白

3.2.1 國外研究人膠原蛋白進展

1997年,Vuorela等[13]成功利用畢赤酵母表達了人Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ型膠原蛋白全序列。大量研究表明膠原蛋白與關鍵酶P4H在宿主細胞的共表達是一個較好的策略。與膠原蛋白共表達,不僅促進了宿主表達的P4H的亞基正確且高水平地組裝成具有活性的四聚體,同時也使得膠原蛋白能夠被P4H充分羥基化。研究表明:與膠原蛋白的共表達還能顯著提高P4H的半衰期,例如與Ⅲ型膠原蛋白共表達,其半衰期可顯著提高15倍;酵母共表達P4H得到的膠原蛋白能折疊成正確的空間結構,并能充分地被羥基化,并且表達量可達0.2～0.6 g/L,但是不能夠分泌表達出細胞,只能積累在細胞的內質網內腔。即使進一步嘗試使用α-MF信號肽也只能夠極少量地提高其分泌量,同時又會減少Ⅰ型膠原蛋白的表達總量。通過分析產物,得到各重組蛋白的4-羥脯氨酸質量分數(shù)與天然膠原蛋白一樣,并且能在體外正確組裝成膠原纖維。繼續(xù)對Ⅰ型膠原蛋白進行研究,將肽鏈的N末端基因切除,利用先前的方法構建重組酵母。結果表明:重組酵母表達得到的膠原分子其結構、性質等都接近于天然的膠原蛋白,同樣也能在體外組裝成膠原纖維,僅四基因的單拷貝重組子的膠原蛋白表達量就高達0.5 g/L,比在同樣條件下表達Ⅰ型膠原蛋白提高了1.5～3倍。

Werten等[14]利用重疊延伸PCR法獲得了約300 bp基因序列的高度親水的重組明膠,并在pPIC9K載體中重復連入目的基因形成4段重復,轉化到畢赤酵母中表達,單拷貝轉化子能產重組明膠3～6 g/L。Olsen等[15]研發(fā)了小分子質量的重組人源性明膠,其長度僅為101個氨基酸,并利用畢赤酵母X-33進行表達,經過高拷貝的篩選后發(fā)酵制備了具有生物活性的人源性明膠,產量達到1.47 g/L,經純化后替代動物來源的膠原蛋白用作疫苗穩(wěn)定劑。Pakkanen等[16]利用畢赤酵母選擇性地分泌表達缺失C端肽的單鏈重組膠原蛋白片段(分子質量為9×103～4.5×104Da),具有C端肽的膠原蛋白片段雖然可以形成三螺旋結構,但不能分泌表達。這從一定程度上表明膠原蛋白的分泌表達與其分子質量大小、三螺旋構象以及C端肽等因素有關。

3.2.2 國內研究人膠原蛋白進展

范代娣等[17]采用PCR技術獲得人膠原蛋白基因片段,進行拼接重組后轉化大腸桿菌,通過高密度發(fā)酵方式培養(yǎng)生產類人膠原蛋白,其表達量達到29.4%,并進行了發(fā)酵條件和純化等多方面的研究。為了獲得不含N和C末端肽的單鏈全長人膠原α1(Ⅲ)鏈(COL3A1)的高水平分泌表達,研究人員將人COL3A1對應基因的cDNA克隆到畢赤酵母分泌表達載體pPIC9K中,并整合到畢赤酵母GS115中[18]。SDS-PAGE和蛋白質印跡分析表明:未水解的重組人COL3A1(rhCOL3A1)被分泌到培養(yǎng)基中,并顯示出約130 kDa的表觀分子質量,這比理論值高1.4倍。最后,使用四步方法將未羥基化的rhCOL3A1純化至高于90%的純度。此外,甲基噻唑基二苯基四氮唑溴化物實驗表明低濃度的rhCOL3A1能有效促進幼倉鼠腎細胞(BHK21)增殖。

高立虎等[19]基于人Ⅲ型膠原α1鏈膠原域Gly-X-Y的三肽重復序列特征,以改善膠原蛋白水溶性和提高表達量為目的,設計并合成了一段編碼具高親水性的Gly-X-Y三肽重復序列人源膠原蛋白的基因單體,再通過同向串聯(lián)構建高重復序列人源膠原蛋白表達載體,最終轉化畢赤酵母,實現(xiàn)了重組人膠原蛋白的分泌表達,所表達的重組人膠原蛋白展現(xiàn)出良好的生物醫(yī)學應用前景。其優(yōu)點在于:完全人工合成,在保持天然膠原蛋白膠原域Gly-X-Y序列的高度重復前提下,可以更加靈活地改變人膠原蛋白氨基酸序列;通過改變酸性氨基酸和堿性氨基酸的比例,調節(jié)人膠原蛋白的等電點;編碼各種氨基酸的密碼子可以完全替換為畢赤酵母的偏好密碼子;單體的串聯(lián)策略允許構建成不同重復數(shù)的類人膠原蛋白基因;分泌表達有利于表達產物的分離純化,降低成本;在畢赤酵母表達系統(tǒng)中,所表達的外源蛋白有一定的翻譯后修飾功能,如糖基化、脂肪?；土姿峄?生產周期短[20]。

張自強等[21]研究了采用酶解、透析、凍干和滅菌等工藝所制備的去端肽Ⅰ型膠原蛋白,質量分數(shù)可達99.8%,DNA殘留量為4 μg/g,遠低于50～100 μg/g,C,N末端肽濃度低于試劑盒檢測限度,即未檢出Ⅰ型膠原C和N末端肽,α-Gal抗原質量分數(shù)低于檢測限度。說明在去端肽Ⅰ型膠原蛋白的制備過程中,酶解工藝對Ⅰ型膠原蛋白的端肽去除效果非常顯著,極大地降低了Ⅰ型膠原蛋白的免疫原性。

He等[22]研究表明:適當羥基化的人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈可以在畢赤酵母GS115中產生,其沒有N端前肽和C端前肽,也不能形成三螺旋結構。通過共表達重組人脯氨酰4-羥化酶(P4H),成功地產生了含有羥脯氨酸殘基的人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈。結果證實:羥脯氨酸殘基僅在Ⅲ型膠原蛋白α1基因與P4H的基因共表達時出現(xiàn)。液相色譜-質譜/質譜分析能夠測量不同樣品中特定氨基酸位置的羥基化脯氨酸。

由于對外用膠原蛋白能否被人體皮膚直接吸收利用的問題尚存爭議,如果不能被皮膚直接吸收,則意味著外用膠原蛋白的作用將大打折扣。因此,馬淑驊等[23]研究了重組人源膠原蛋白對小鼠皮膚激光損傷的修復作用,探究了其作用機制。在前期研究中應用二次諧波(Second harmonic generation,SHG)成像結合雙光子熒光成像[24]的方法觀察了重組人源膠原蛋白的透皮吸收情況,發(fā)現(xiàn)重組人源膠原蛋白可以沿著毛囊進入真皮層,并從毛囊中擴散至膠原纖維層從而補充皮膚中的膠原纖維。研究人員應用458～514 nm激光照射小鼠背部皮膚制作皮膚損傷模型,將重組人源膠原蛋白外涂于創(chuàng)傷皮膚,劑量為8 mg/mL(生理鹽水配制),每天涂抹1次,連續(xù)給藥14 d。分別于給藥后1,4,7,14 d用雙光子顯微鏡收集二次諧波信號檢測傷口真皮中的膠原纖維,并進行常規(guī)HE染色,觀察傷口局部的病理學改變。體外試驗檢測重組人源膠原蛋白對人皮膚角質形成細胞和成纖維細胞增殖活力的影響,計算細胞存活率。在小鼠模型上顯示,與對照組相比,重組人源膠原蛋白可明顯加速傷口的愈合,縮短傷口愈合時間;SHG顯示重組人源膠原蛋白能夠促進創(chuàng)傷局部膠原的產生;體外試驗也顯示它有促進人皮膚成纖維細胞和角質形成細胞增殖的能力。由此可見:重組人源膠原蛋白(8 mg/mL)對小鼠激光損傷皮膚有修復作用,可能是通過促進表皮角質細胞和真皮成纖維細胞的增殖,促進膠原的沉積而發(fā)揮修復作用的。

唐云平等[25]通過在大腸桿菌中將類人膠原蛋白基因與人脯氨酰-4-羥化酶(P4H)和D-阿拉伯-1,4-內酯氧化酶(ALO)共表達,構建了一個原核表達系統(tǒng)來生產羥基化類人膠原蛋白,并且研究了5種不同的培養(yǎng)基以及誘導條件對該蛋白可溶性表達的影響。結果表明:當重組細胞在MBL培養(yǎng)基中生長并在指數(shù)生長期中期由0.1 mmol/L IPTG誘導時,搖瓶獲得的目標類人膠原蛋白的最高可溶性表達水平為(49.55±0.36)mg/L。采用葡萄糖補料策略,在10 L的臺式發(fā)酵罐中,目標類人膠原蛋白的表達水平可提高到260 mg/L。此外,高效液相色譜分析顯示:在純化的類人膠原蛋白中,超過10%的脯氨酸殘基被成功羥基化。

4 結 論

膠原蛋白由于其良好的生物相容性、降解性及其他生物活性,越來越受到人們的關注,通過基因工程生產膠原蛋白的方法也由于其安全性高、產量高和成本低等優(yōu)勢,逐漸成為研究熱點。國內外膠原蛋白的需求量正穩(wěn)步增長,尤其是高質量的膠原蛋白,其產品市場前景廣闊。因此,有關基因工程技術生產重組膠原蛋白的研究也在不斷向前推進。利用重組技術生產膠原蛋白雖然已經取得了長足的進步,但是目前制備的重組膠原蛋白的產量、結構特性及純度仍有提升空間。

本文得到了杭州紐龍日尚生物制品有限公司、會稽山紹興酒股份有限公司及紹興黃酒學院的資助。