許亞龍，陳千思，謝小東，劉萍萍，翟 妞，金靜靜，王 晨，曹培健

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號 450001

煙堿是煙草中含量最高的生物堿，約占總生物堿含量的90%左右［1］。生物堿與很多植物的抗蟲性密切相關(guān)［2］。煙堿在煙草根組織中合成［3］，通過木質(zhì)部運輸?shù)狡渌M織器官，主要在葉片中累積。煙堿是由四氫吡咯和吡啶環(huán)相連組成的，參與四氫吡咯環(huán)形成的有鳥氨酸脫羧酶（Ornithine decarboxylase，ODC）［4］、精氨酸脫羧酶（Argine decarboxylase，ADC）［5］、N-甲 基 轉(zhuǎn) 移 酶（N-methyltransferase，PMT）［6］和N-甲基腐胺氧化酶（N-methylputrescine oxidase，MPO）［7］。參與煙堿吡啶環(huán)形成的有天冬氨酸氧化酶（Aspartate oxidase，AO）、喹 啉 酸 合 成 酶（Quinolinic acid synthase，QS）［8］和喹啉酸核糖轉(zhuǎn)移酶（Quinolinic acid phosphoribosyl trasferase，QPT）［9-11］。煙 草中A622基因和小檗堿連接酶家族-黃素-氧化酶（Flavin-containing oxidases of the berberine bridge enzyme family，BBLs）基因可能參與了最后的吡咯和吡啶環(huán)的縮合［12］。細胞色素氧化酶P450 家族的煙堿-N-去甲基化酶（NicotineN-demethylase，NND）可催化煙堿生成降煙堿［13-14］。MATE（Multi antimicrobial extrusion）和NUP（Nicotine uptake permease）蛋白在煙堿轉(zhuǎn)運中起重要作用［15-16］。ERF（Ethylene responsive factor）和bHLH（Basic helix-loop-helix）兩個轉(zhuǎn)錄因子家族的一些成員是煙堿合成通路上一些基因的重要順式調(diào)控元件［17-20］。

miRNA 是一類在各物種中廣泛存在的長度為21～24 個堿基的內(nèi)源性小RNA［21］，對靶基因起負調(diào)控作用，可通過堿基互補配對在轉(zhuǎn)錄后水平介導靶基因的切割，或者通過降低靶基因的翻譯來調(diào)節(jié)基因的表達。miRNA 在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。例如：在擬南芥中，At-miR2923 與花粉發(fā)育有關(guān)［22］，At-miR164 可以調(diào)控擬南芥花瓣的數(shù)目［23］，At-miR160 可以通過與ARF10、ARF16 作用來調(diào)控根冠細胞的形成［24-25］；在水稻中，miR399 可以抑制磷饑餓應(yīng)答關(guān)鍵調(diào)控基 因LTN1［26］。Li 等［27］發(fā) 現(xiàn)nta-miRX27 能 夠 抑制煙堿合成途徑中的NtQPT2；Guo 等［28］基于Small RNAseq 在煙草中發(fā)現(xiàn)了33 個保守的和51 個新miRNA，同時使用芯片技術(shù)分析了它們在根、莖、葉和花組織中的表達情況以及受打頂響應(yīng)的miRNA。另外Guo 等［29-31］也分析了煙草中打頂和機械損傷響應(yīng)的miRNA。

雖然人們對特定物種中miRNA 的種類和數(shù)量以及少量miRNA 的功能和作用機制有一定的了解，但對煙草中煙堿合成相關(guān)miRNA 的研究還不多。為此，利用生物信息學方法，對煙草小RNA 二代測序數(shù)據(jù)進行分析，挖掘出煙堿相關(guān)miRNA 及其靶基因，并利用分子生物學技術(shù)構(gòu)建miRNA 過表達轉(zhuǎn)基因材料，通過檢測過表達材料的靶基因相對表達量和相對煙堿含量，旨在篩選煙堿相關(guān)的miRNA 并明確候選miRNA 對煙草中煙堿含量的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 煙草材料

miRNA 測序所用樣品：本研究中選取煙草的品種為紅花大金元，在山東省青島市的試驗基地采用常規(guī)的栽培措施進行種植。選擇盛花期（大田移栽60 d 左右），打頂前和打頂后3 個發(fā)育時期，取長勢一致的9 株煙，采集第15 片葉，每3 片葉為1 組，葉片去梗后用錫箔紙包好，快速放入液氮中。取完葉片的煙株，繼續(xù)采集根系。打掉葉片，挖出根系，盡量減少須根損失，沖洗根，剪取須根，清洗至無明顯土壤殘留，用吸水紙盡量擠干水分，用錫箔紙包好后快速放入液氮中。

過表達材料：過表達miRNA2635 和miRNA203轉(zhuǎn)基因幼苗轉(zhuǎn)移至MS 培養(yǎng)基上，待幼苗長至4 片真葉時，移栽到小盆缽中，置于國家煙草基因研究中心溫室生長，溫室條件為28 ℃光照16 h，23 ℃黑暗8 h。分別收集旺長期根和葉的樣品，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃保存。

1.1.2 試劑和儀器

TriZol 試劑購買自美國Invitrogen 公司；高保真DNA 聚合酶Prime STAR GXL DNA Polymerase、DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA 小量純化試劑盒、限制性內(nèi)切酶購于大連寶生物工程有限公司；In-Fusion HD Cloning Plus 試劑盒購于美國Clontech 公司；cDNA 合成試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 購 自 瑞 士Roche 公 司。5424 型離心機（德國Eppendorf 公司）；2720 型PCR 儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；DYY-7C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；1600 型凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；1652100 型電轉(zhuǎn)化儀［伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司］；DK-98-Ⅱ型水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；GX-45B 型培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；ZHWY-1102C 型搖床（上海智誠分析儀器制造有限公司）；Nanodrop 2000 分光光度計（美國Thermo Fisher 公司）；Agilent 2100 生物分析儀（美國Agilent 公司）；HiSeq 2500 測序儀（美國Illumina 公司）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取

采用TriZol 法提取煙草各組織RNA，實驗操作嚴格按照產(chǎn)品說明書進行。在提取過程中，加入RNase-free DNase I 消化可能殘留的基因組DNA。提取完成后，各RNA 樣品的濃度和質(zhì)量分別用Nanodrop 2000 分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.2 小RNA 文庫構(gòu)建及測序

完成樣品RNA 提取并通過質(zhì)控后，使用PAGE 膠分離不同片段大小的RNA。切取18～30個堿基之間的條帶，回收小RNA。按照華大基因標準的Illumina smRNA 建庫方法構(gòu)建測序文庫。使用Agilent 2100 生物分析儀和PCR 儀對建好的文庫進行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測。檢測合格后，按照Illumina 標準的測序流程和方法在HiSeq 2500 測序儀上進行測序。

1.2.3 煙草miRNA 的鑒定及靶標預(yù)測

使用fastq_to_fasta 將fq格式的軟件轉(zhuǎn)換為fasta格式，然后使process-reads-fasta.py 腳本對轉(zhuǎn)換后的fa 文件進行轉(zhuǎn)換預(yù)處理，使用bowtie-align-reads.py腳本將轉(zhuǎn)換后的序列比對到煙草參考基因組，隨后使用miR_PREFeR.py 預(yù)測流程腳本進行煙草miRNA 預(yù) 測［32］。使 用psRobot_tar 對 候 選 煙 草miRNA 進行靶基因預(yù)測［33］。

1.2.4 miRNA 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

miRNA 前體可形成發(fā)卡狀的二級結(jié)構(gòu)，使用RNALfold 預(yù)測前體的二級結(jié)構(gòu)并使用RNAplot 軟件繪圖［34］。

1.2.5 過表達載體構(gòu)建

加入設(shè)計好的目標片段引物（表1），以紅花大金元煙草基因組DNA 樣品為模板進行PCR 擴增目標片段。PC2300S 載體用SacI與BamHI雙酶切處理并回收，與PCR 擴增產(chǎn)物進行重組，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂抗性平板，挑選克隆子搖菌，用上游引物與PCB-seqE 菌落PCR 驗證陽性克隆，然后進行測序驗證。

表1 過表達載體構(gòu)建引物Tab.1 Primers for over-expression vector

1.2.6 RT-PCR

以cDNA 反轉(zhuǎn)錄原液的30 倍稀釋液為模板，以煙草U6（miRNA 定量）和26S（NtQPT2定量）基因為內(nèi)參基因，擴增體系如下：10 μL 2×SYBR Green Mix，4 μL cDNA，2 μL Primer F（2 μM）、Primer R（2 μM）和ddH2O。反應(yīng)程序為95 ℃10 min；95 ℃15 s，60 ℃50 s，40 個循環(huán)。擴增引物如表2 所示。

表2 定量PCR 引物Tab.2 Primers for qPCR

1.2.7 煙堿含量檢測

新鮮煙葉冷凍干燥，稱取0.15 g凍干鮮葉粉置于15 mL螺口耐壓試管中，加入1.75 mL 質(zhì)量分數(shù)5%的氫氧化鈉溶液，濕潤試樣，靜置15 min，加入10 mL 質(zhì)量分數(shù)0.01%的三乙胺/甲基叔丁基醚溶液，加蓋密封后置于超聲波發(fā)生器內(nèi)室溫下超聲萃取15 min，然后在6 000 r/min條件下離心5 min。取2 mL 有機相進行GC/MS 分析，檢測煙堿含量；準確移取5 mL有機相濃縮到0.5 mL，進行GC/MS 分析，檢測其他低含量生物堿。煙堿與其他低含量生物堿的檢測分兩次進樣完成，采用保留時間和選擇離子監(jiān)測（SIM）模式定性，雙內(nèi)標定量［35］。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草miRNA 的鑒定及分析

39 個測序樣品冗余數(shù)據(jù)量平均為17.72 MB，非冗余數(shù)據(jù)量平均為5.55 MB（圖1）。經(jīng)過分析，從39個樣品中共預(yù)測了2 925個非冗余的miRNA成熟體和3 082個前體。通過和miRbase［36］中已知的植物miRNA（包含164 個已知的煙草miRNA）成熟體比對，其中有1 245 個miRNA 能夠比對上，這些miRNA 被認定為具有高可信度的miRNA，其中有43 個是煙草中已知的miRNA。對預(yù)測成熟miRNA 序列長度和堿基組成進行分析，發(fā)現(xiàn)miRNA 的長度主要集中在21～22 個堿基之間，在堿基偏好性方面，首堿基更偏向為A 和U（圖2）。

2.2 煙堿相關(guān)miRNA 篩選

以紅花大金元71 456 條cDNA 序列為靶基因庫，對煙草miRNA 進行靶標預(yù)測，2 925 個miRNA中的1 607 個miRNA 共預(yù)測出了5 309 個靶基因，平均每個miRNA 能夠調(diào)控3.3 個靶基因。根據(jù)已有的煙堿通路相關(guān)的基因信息，獲得了多個與煙堿相關(guān)的miRNA。表3 列出了部分篩選到的煙堿相關(guān)miRNA，其可能的靶基因位點如表4 所示。對miRNA 前體二級結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)表3 中的miRNA 前體均能形成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.3 煙堿相關(guān)miRNA 對靶基因的調(diào)控

為確定候選的煙堿相關(guān)miRNA 是否調(diào)控了煙堿相關(guān)基因的表達，本研究中構(gòu)建了miRNA203 和miR2635 的過表達轉(zhuǎn)基因株系，對隨機挑選的過表達株系進行qPCR 檢測，發(fā)現(xiàn)OE-miRNA203-4/5、OE-miR2635-3/5 株系的miRNA表達量有較大提升。隨后對篩選到的高表達株系（OE-miRNA203-4/5 和OE-miR2635-3/5）進行靶基因表達量qPCR 檢測，結(jié)果顯示靶基因表達量都有不同程度降低，在miRNA203 高表達株系中靶基因NtMATE1下降了近98%，在miRNA2635 高表達株系中靶基因NtQPT2下降了約48%～67%，miRNA 的表達量和靶基因的表達量明顯負相關(guān)（圖4）。

2.4 煙堿相關(guān)miRNA 對煙堿含量的影響

QPT基因在煙草煙堿的合成途徑中有重要作用［11］，而NtMATE1在煙堿合成后的轉(zhuǎn)運過程中有重要作用［15］。為了研究miRNA 過表達植株的煙堿含量是否受到了影響，對篩選到的miRNA 高表達株系進行了煙堿含量檢測，發(fā)現(xiàn)miRNA 高表達株系中的煙堿、降煙堿含量均有不同程度下降。如圖5 所示，在過表達miRNA203 和miRNA2635株系中，平均煙堿含量下降了約62%和69%，同時平均降煙堿含量分別下降了約69%和70%。故可得出結(jié)論，miRNA203 和miRNA2635 可通過降低相應(yīng)靶基因表達量進而降低煙草中煙堿的含量。

表3 煙堿相關(guān)miRNA 及其潛在靶基因Tab.3 Nicotine related miRNAs and their potential target genes

3 討論

本研究中從全基因組范圍鑒定了2 925 個潛在的煙草miRNA，將預(yù)測出miRNA 的數(shù)量和miRbase 對比分析，本研究中預(yù)測的總數(shù)相對較多，不排除部分假陽性結(jié)果的存在，同時通過和其他植物的miRNA 比對，發(fā)現(xiàn)1 245 個miRNA 有同源序列，說明本研究中鑒定出了一些新的煙草miRNA。

通過對miRNA 靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)了多個可能調(diào)控煙堿的miRNA 基因。對預(yù)測的miRNA 序列進行分析，發(fā)現(xiàn)大部分成熟miRNA 的表達量較低，同時有很多miRNA*（來自前體的相對臂且表達豐度相對較低的miRNA）存在，說明可能有很多miRNA 的前體能夠加工出兩個成熟miRNA，miRNA 和對應(yīng)的miRNA*雖然來自同一個前體，但在序列上仍有不同程度的差異，此特性可以加強miRNA 基因?qū)Π谢虻恼{(diào)控廣度。

普通煙草是異源4 倍體，通過對預(yù)測的miRNA 序列和位置進行分析，發(fā)現(xiàn)有15 個miRNA存在多個拷貝現(xiàn)象，其中有2 個miRNA 的拷貝數(shù)分別為10 個和4 個，其余均為2 個拷貝。分析中還發(fā)現(xiàn)存在不同的miRNA 前體加工成相同的miRNA 成熟體的現(xiàn)象，通過此機制，可以增加特定miRNA 的表達量。此外，通過靶基因預(yù)測軟件分析，發(fā)現(xiàn)煙草也存在1 個miRNA 同時靶向多個基因的現(xiàn)象，例如miR2635 除了能靶向NtQPT2，還能靶向1 個糖苷水解酶的基因。miRNA203 除了靶向NtMATE1外還能靶向1 個未知功能的基因，但互作區(qū)域序列相似性相對較低。

Li 等［27］發(fā) 現(xiàn) 的nta-miRX27 和 本 研 究 中 的miRNA2635 都能夠抑制煙堿合成途徑中的NtQPT2基因，經(jīng)過序列比對，它們是兩個不同的miRNA。為了驗證候選miRNA 和煙堿相關(guān)靶基因的關(guān)系，本研究中建立了miRNA203 和miR2635的過表達遺傳材料，雖然前面提到miRNA203 和miR2635 也有多個靶基因的情況，但從過表達植株的外在表型上看并未發(fā)現(xiàn)明顯的異常性狀，推測這可能與miRNA 與不同靶基因的作用強度以及時空表達有關(guān)。

此外，打頂是煙草種植過程中一項重要的農(nóng)藝措施，能夠去除煙草的頂端優(yōu)勢，直接或間接地改變激素的平衡、根的發(fā)育以及煙堿的合成等生物過程。很多學者對打頂響應(yīng)的miRNA 進行了研究，例如Guo 等［28］發(fā)現(xiàn)了4 個打頂響應(yīng)的miRNA；Qi 等［30］發(fā)現(xiàn)了15 個打頂響應(yīng)差異表達的miRNA，并發(fā)現(xiàn)nta-miR164a、nta-miR159 和nta-miR167d*能夠分別靶向與煙堿合成調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NAC、MYB 和WRKY；Tang 等［31］在根組織中也發(fā)現(xiàn)了15 個打頂響應(yīng)的miRNA。雖然上述研究中發(fā)現(xiàn)了多個打頂響應(yīng)的miRNA，同時打頂能夠直接或間接地引起多種代謝途徑的反應(yīng)，但是這些miRNA 最終能否直接靶向煙堿合成通路中的基因進而影響煙堿含量仍有待進一步研究。

4 結(jié)論

對3 個發(fā)育時期5 個不同組織的39 個紅大品種煙草樣品進行小RNA 高通量測序和生物信息學分析，從全基因組水平鑒定了2 925 個潛在的miRNA 基 因，其 中 有1 245 個miRNA 是 植 物 中 已發(fā)現(xiàn)的，包括43 個煙草中已知的miRNA。通過對miRNA 靶基因分析，發(fā)現(xiàn)了多個煙堿相關(guān)的miRNA。 過 表 達 實 驗 結(jié) 果 表 明，miR2635 和miRNA203 能夠通過分別調(diào)控靶基因NtQPT2和NtMATE1的表達進而調(diào)控煙草中的煙堿含量，煙堿含量平均下降約69%和62%。這些發(fā)現(xiàn)增進了對煙草miRNA 的了解，為煙堿的生物合成調(diào)控提供了新的調(diào)控元件。