方敦煌，童治軍，焦芳嬋，吳興富，張光海，肖炳光，張誼寒，李永平，陳學(xué)軍

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家煙草基因工程研究中心，昆明市五華區(qū)圓通街33 號(hào) 650021

黑脛病是我國(guó)煙葉生產(chǎn)中的主要土傳病害之一，主要危害煙草根及莖基部，每年造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。普通煙草花葉病（TMV）也是云南等煙葉主產(chǎn)區(qū)分布廣、危害重的病害［1-2］。因此，選育推廣抗黑脛病及TMV 的品種，是應(yīng)對(duì)這兩種病害的最為經(jīng)濟(jì)和有效的防控手段。有性雜交、系統(tǒng)選育、雜種優(yōu)勢(shì)利用是傳統(tǒng)育種的3 種重要方法，目前我國(guó)主栽烤煙品種主要通過(guò)有性雜交育種、系統(tǒng)選育和雜種優(yōu)勢(shì)利用并重選育而成。但傳統(tǒng)育種存在周期長(zhǎng)、篩選效率低等問(wèn)題，而且育成的新品種單一、遺傳基礎(chǔ)狹窄、品質(zhì)與抗性不能兼顧。為創(chuàng)新種質(zhì)資源、培育多抗品種、縮短育種周期，開(kāi)發(fā)了單倍體育種技術(shù)，如利用單倍體通過(guò)2 個(gè)世代即可獲得純合雙單倍體（DH）系。利用花藥培養(yǎng)、遠(yuǎn)緣雜交及栽培種間雜交，因孤雌生殖獲得單倍體是包括煙草在內(nèi)的多種作物最常用的途徑［3］，遠(yuǎn)緣雜交及栽培種間雜交獲得的母本來(lái)源單倍體（MDH）除了能快速育成來(lái)自母本遺傳性狀的穩(wěn)定純系，還具有農(nóng)藝性狀及產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。花藥加倍培養(yǎng)獲得的雙單倍體（DH）存在農(nóng)藝性狀較差、產(chǎn)量低的缺陷［4］，栽培種之間雜交因孤雌生殖也可誘導(dǎo)MDH 單倍體，但頻率極低，已被Lewis 等［5］轉(zhuǎn)擬南芥花青素轉(zhuǎn)錄因子PAP1 基因的品種所證實(shí)。遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)單倍體技術(shù)是一種以普通煙草（Nicotiana tabacum）為母本、野生種非洲煙草（Nicotiana africana）為父本的雜交后代孤雌生殖所產(chǎn)生的單倍體［4］，因而在常規(guī)育種基礎(chǔ)上，母本起源單倍體育種等新技術(shù)也在育種實(shí)踐中得到廣泛使用，其在縮短育種周期、提高目標(biāo)性狀篩選效率等方面發(fā)揮了重要作用。20 世紀(jì)90 年代以來(lái)美國(guó)先后培育出NC2000、NC71 和NC196 等煙草品種［6-9］。本項(xiàng)目組在前期適宜的授粉時(shí)期和套袋方式對(duì)單倍體誘導(dǎo)頻率研究的基礎(chǔ)上［10］，獲得了雙抗TMV 和PVY 的煙草株系［11］。為此，采用野生種非洲煙草并通過(guò)雜交技術(shù)，以煙草黑脛?。≒hytophthora nicotianae）（0 號(hào)生理小種）抗源Coker 371［12］與普通花葉病（Tobacco Mosaic Virus，TMV）抗源Coker176［13］為材料進(jìn)行了雙抗黑脛病及TMV 的種質(zhì)資源創(chuàng)制，旨在為優(yōu)良、特色品種的抗病性定向改良提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

普通煙草（N. tabacum）紅花大金元（紅大）、Coker371 和Coker176，煙屬野生種非洲煙草（N.africana），均由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 母本來(lái)源雜交

以Coker371 為母本、Coker176 為父本進(jìn)行常規(guī)雜交，獲得Coker371×Coker176 雜交F1種（簡(jiǎn)稱(chēng)CC）。再以CC 為母本、野生種非洲煙草為父本，參照曾建敏等［9］優(yōu)化的方式授粉、紙管套袋，收獲成熟的煙草雜交種子。

1.2.2 母本來(lái)源單倍體鑒別

按Wernsman 等［3］描述的方法進(jìn)行單倍體苗期形態(tài)鑒別；用流式細(xì)胞儀測(cè)定其形態(tài)鑒別為單倍體植株的染色體倍型。

1.2.3 母本來(lái)源單倍體植株的分子標(biāo)記輔助選擇及組織培養(yǎng)加倍

分子標(biāo)記輔助選擇時(shí)，抗黑脛病的PhP基因分子標(biāo)記檢測(cè)、抗TMV 的N基因分子標(biāo)記檢測(cè)分別參照Lewis 等［13］和Johnson 等［12］的方法進(jìn)行。

組織培養(yǎng)加倍按Kasperbauer 等［14］和劉勇等［11］改進(jìn)的方法進(jìn)行。選擇的母本來(lái)源單倍體植株進(jìn)入現(xiàn)蕾期（圖1b）后，取中部葉片中脈，在超凈工作臺(tái)先用75 %乙醇消毒1 min，無(wú)菌水沖洗2 次，將切好的葉脈接種到MS+KT 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 的誘芽培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20 d 后且葉片長(zhǎng)出叢生芽2 cm 高時(shí)，切取芽接種到1/2MS 培養(yǎng)基+IBA 0.5 mg/L 中進(jìn)行誘根生長(zhǎng)培養(yǎng)。

1.2.4 雙抗種質(zhì)的鑒別

采用菌絲塊創(chuàng)傷貼接法進(jìn)行黑脛病抗性鑒定。每個(gè)株系處理24 株，重復(fù)3 次，以病情指數(shù)評(píng) 價(jià) 抗 感 性［15］；采 用 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)GB/T 23222—2008［16］進(jìn)行TMV 抗性鑒定，病毒汁液摩擦接種，3次重復(fù)，每重復(fù)16 株。按1.2.3 中母本來(lái)源單倍體植株的分子標(biāo)記輔助選擇方法進(jìn)行分子標(biāo)記輔助檢測(cè)。

在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗(yàn)基地進(jìn)行農(nóng)藝性狀試驗(yàn)。試驗(yàn)地塊為紅壤土，土壤肥力中等。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3 次重復(fù)，每小區(qū)面積40 m2，株行距0.50 m ×1.20 m，施純氮90 kg/hm2［m（N）∶m（P）∶m（K）=1∶1.5∶2］。移栽32 d 后，每周分別測(cè)定紅大、Coker371、Coker176 和篩選獲得的雙抗TMV 及黑脛病種質(zhì)的株高與葉片數(shù)，連續(xù)測(cè)定6周；煙株打頂后調(diào)查株高、腰葉長(zhǎng)寬、節(jié)距和莖圍等農(nóng)藝性狀指標(biāo)［17］。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 10.5 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 母本來(lái)源單倍體的鑒別

母本來(lái)源獲得的雜交種播種25 d 后，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交后代大部分苗出現(xiàn)致死性狀，這與前人的研究結(jié)果一致［15］。存活的煙苗中，多數(shù)為混倍體，兩片真葉表現(xiàn)凹痕的煙苗為單倍體苗（圖1a），至現(xiàn)蕾期仍有部分葉片表現(xiàn)為凹痕（圖1b）。流式細(xì)胞術(shù)倍性分析表明，母本來(lái)源的單倍體峰值位于24 500（圖1 c），而對(duì)照紅大的峰值位于49 800（圖1 d）。

2.2 分子標(biāo)記輔助篩選及組織培養(yǎng)加倍

對(duì)獲得的5 株母本來(lái)源單倍體材料進(jìn)行抗黑脛病PhP基因和抗TMVN基因分子標(biāo)記分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2 中可見(jiàn)，擴(kuò)增出約770 bp 的PhP基因特異片斷的單倍體植株為H1、H4 和H5，擴(kuò)增出約540 bpN基因特異片斷的植株為H1、H2、H3和H4，選擇能同時(shí)擴(kuò)增PhP基因片段和N基因片段的H1 和H4 作為雙抗母本來(lái)源的單倍體植株。

目標(biāo)單倍體植株現(xiàn)蕾后，H1 和H4 的總?cè)~片數(shù)相同，均為13 片，而H1 的腰葉（長(zhǎng)×寬為35 cm×25 cm）大于H4（37 cm×20 cm），故選擇H1 單倍體植株進(jìn)行組織培養(yǎng)加倍。取H1 植株中部葉片葉脈（圖3a），消毒并切除葉脈邊緣葉肉后接種到加倍培養(yǎng)基上（圖3b），35 d 左右葉脈長(zhǎng)出叢生芽（圖3c），叢生芽生根移栽后，獲得正常開(kāi)花結(jié)實(shí)的加倍母本來(lái)源單倍體（圖3d），命名為RBST［雙抗黑脛病及TMV 烤煙新種質(zhì)（Resistant to black shank and TMV）］，單株形態(tài)見(jiàn)圖4。

2.3 雙抗RBST 種質(zhì)的鑒別

黑脛病苗期抗性鑒定結(jié)果（表1）表明，加倍母本來(lái)源單倍體RBST 和Coker371 的病情指數(shù)均為0，Coker176 和紅大的病情指數(shù)分別為87 和92。TMV 抗病性鑒定結(jié)果（表1）表明，RBST 與Coker 176 表現(xiàn)出枯斑，而Coker371 和紅大無(wú)枯斑反應(yīng)，系統(tǒng)侵染表現(xiàn)為花葉。抗黑脛病的PhP基因分子標(biāo)記檢測(cè)和抗TMV 的N基因分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果（圖5）表明，RBST 材料可擴(kuò)增出抗黑脛病的PhP基因和抗TMV 的N基因特異片段，與常規(guī)抗性鑒定結(jié)果相吻合。

表1 雙單倍體的抗性鑒定Tab.1 Resistance identification of double haploid

農(nóng)藝性狀指標(biāo)調(diào)查結(jié)果（圖6）表明，供試材料均在移栽后39 d 生長(zhǎng)速率明顯加快。在移栽后53 d 3 份抗病材料煙株株高依然增長(zhǎng)，而常規(guī)紅大品種株高增長(zhǎng)則趨緩；Coker176 品種葉片數(shù)增加趨緩，而其他材料葉片數(shù)仍在較快增加。

株高、葉長(zhǎng)、葉寬、節(jié)距及莖圍等農(nóng)藝性狀指標(biāo)測(cè)定結(jié)果（圖7）表明，RBST 材料除株高與其他材料無(wú)顯著差異外，腰葉長(zhǎng)與寬、節(jié)距及莖圍均顯著低于主栽品種紅大，腰葉長(zhǎng)顯著低于雙親，但節(jié)距、莖圍與雙親差異不顯著。

3 討論

在前期研究基礎(chǔ)上［10-11］利用母本來(lái)源單倍體育種技術(shù)，采用流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）進(jìn)行苗期單倍體輔助篩選，并創(chuàng)制了雙抗黑脛病和TMV 的種質(zhì)RBST，可用于煙草品種的抗病改良和PhP基因的定位克?。?8］。母本來(lái)源單倍體育種技術(shù)也可快速聚合2 種及以上的其他性狀，獲得性狀穩(wěn)定的新品種。再次驗(yàn)證了母本來(lái)源單倍體育種技術(shù)在煙草育種中具有基因型多樣化、周期短、選擇效率高、易操作等優(yōu)點(diǎn)，能快速穩(wěn)定抗病等優(yōu)良性狀、提高育種篩選效率、加快煙草育種進(jìn)程，只需兩代即可獲高純度、不受遺傳背景限制的雙單倍體系。同時(shí)，在遺傳學(xué)研究上可應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位及克隆。

在利用母本來(lái)源單倍體育種技術(shù)實(shí)踐中，提高單倍體誘導(dǎo)率、篩選效率和加倍率是三大關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，決定著整個(gè)育種工作流程的效率和工效。Lewis 等［5］及Hancock 等［19］學(xué)者采用轉(zhuǎn)基因手段，實(shí)現(xiàn)了苗期單倍體植株的高效篩選，但因存在轉(zhuǎn)基因材料擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)而難以推廣使用。因此，在探究不同生態(tài)環(huán)境、不同母本基因型以及不同生態(tài)型與母本基因型互作對(duì)單倍體誘導(dǎo)率影響的基礎(chǔ)上，采用非轉(zhuǎn)基因手段，拓寬類(lèi)似非洲煙草單倍體誘導(dǎo)系，研究適宜的與單倍體密切相關(guān)的標(biāo)記，不斷提高雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體的誘導(dǎo)率方面還有待進(jìn)一步深入試驗(yàn)。同時(shí)，雜交誘導(dǎo)孤雌生殖的機(jī)理及其遺傳規(guī)律、加倍機(jī)制也是母本來(lái)源單倍體育種技術(shù)的重要課題，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

通過(guò)優(yōu)化的紙管法增加單倍體誘導(dǎo)率、苗期形態(tài)和流式細(xì)胞術(shù)配合快速高效篩選單倍體、分子標(biāo)記輔助選擇和人工接種相結(jié)合進(jìn)行抗病鑒定，利用母本來(lái)源單倍體育種技術(shù)將攜帶黑脛病抗性PhP基因的Coker 371 與TMV 抗性N基因的Coker 176 雜交F1與煙屬野生種非洲煙草雜交，創(chuàng)制了雙抗黑脛病及TMV 的種質(zhì)RBST。苗期人工接種抗病鑒定、分子標(biāo)記輔助檢測(cè)和田間農(nóng)藝性狀鑒定表明，RBST 的抗病性和農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，可用作煙草品種抗性定向改良的抗源材料。