馬黎，程英，周宏，徐雅菲，談益妹，鄒穎

（上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200443）

防腐劑作為化妝品中不可缺少的組分之一，可以保護(hù)產(chǎn)品在使用過(guò)程中免受微生物污染，延長(zhǎng)產(chǎn)品保質(zhì)期。隨著化妝品消費(fèi)的提升，其引發(fā)不良反應(yīng)問(wèn)題也日益凸顯。近年來(lái)在我國(guó)與國(guó)外的化妝品上市后不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中，防腐劑是導(dǎo)致化妝品過(guò)敏性接觸性皮炎的第二大原因[1-2]。因此化妝品中防腐劑的種類和限量對(duì)化妝品的安全性至關(guān)重要。近年來(lái)全球各國(guó)進(jìn)行的化妝品不良反應(yīng)以及臨床研究中發(fā)現(xiàn)，使用含異噻唑啉酮類的化妝品和接觸性皮炎有一定關(guān)聯(lián)，各國(guó)化妝品法規(guī)對(duì)甲基異噻唑啉酮（Methylisothiazolinone，MI）的限量標(biāo)準(zhǔn)和適用范圍都進(jìn)行了修改，甚至禁止使用某些種類[3-4]。為了研究MI在中國(guó)健康人群和化妝品接觸性皮炎患者中引起皮膚不良反應(yīng)的限量閾值，本項(xiàng)目旨在通過(guò)人體皮膚斑貼試驗(yàn)，檢測(cè)MI在不同濃度下發(fā)生接觸性致敏的嚴(yán)重程度及比例，從而為我國(guó)化妝品安全技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)提供翔實(shí)的研究基礎(chǔ)與指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對(duì)象 本次項(xiàng)目共招募并測(cè)試完成健康受試者124例，其中男43例，女81例，年齡18～60歲，平均（48.88±9.82）歲。共招募并測(cè)試完成化妝品接觸性皮炎患者98例，其中男6例，女92例，年齡 18～69 歲，平均（37.68±12.06）歲。所有受試者在參加試驗(yàn)前均充分知曉整個(gè)測(cè)試過(guò)程，自愿簽署知情同意書。

1.1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 健康志愿者組：受試者身體健康，沒(méi)有任何化妝品過(guò)敏史；化妝品接觸性皮炎患者組：被診斷為化妝品接觸性皮炎。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①處于懷孕期、哺乳期；②在皮膚待試部位有由于瘢痕、色素、萎縮、鮮紅斑痣或其他瑕疵而影響試驗(yàn)結(jié)果的判定者；③正在使用可能影響測(cè)試結(jié)果判定的藥物者。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)材料 MI購(gòu)置于瑞典（Chemotechnique MB Diagnostics AB公司，貨號(hào) M-035B），濃度為0.2%水溶液，使用雙蒸水按梯度稀釋，分別配置了0.02%，0.01%和0.001%3個(gè)濃度。采用蒸餾水作為陰性對(duì)照。

1.2.2 試驗(yàn)方法 在溫濕度控制的房間內(nèi)（溫度18～26℃，相對(duì)濕度＜70%）進(jìn)行試驗(yàn)。將準(zhǔn)備好的變應(yīng)原使用移液器取0.02 mL加入事先放置濾紙的斑試器內(nèi)，用低致敏膠帶貼敷于受試者的背部肩胛骨下、脊柱中央外雙側(cè)，24 h或48 h后去除斑試器并標(biāo)記，0.5 h（待壓痕消失后）、24 h和48 h根據(jù)國(guó)際接觸性皮炎研究組（ICDRG）推薦的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS Statistics 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。皮膚不良反應(yīng)發(fā)生率的比較使用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MI在健康受試者中引起的皮膚反應(yīng) 為了研究不同濃度MI對(duì)健康人群皮膚的反應(yīng)，筆者使用0.2%，0.02%，0.01%和0.001%4個(gè)濃度梯度，在124例健康志愿者中進(jìn)行了封閉型人體皮膚斑貼試驗(yàn)。受試者在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)不同濃度MI的皮膚不良反應(yīng)評(píng)分詳見(jiàn)表1。其中，0.2%MI在斑貼試驗(yàn)后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)發(fā)生的可疑陽(yáng)性反應(yīng)（±）和弱陽(yáng)性反應(yīng)（+）均顯著多于其他3組。所有受試者中沒(méi)有發(fā)生強(qiáng)陽(yáng)性（++）、極強(qiáng)陽(yáng)性（+++）皮膚不良反應(yīng)。

表1 不同濃度MI在健康受試者中引起的皮膚反應(yīng) 例

比較4種濃度的MI在斑貼試驗(yàn)72 h后引起的皮膚不良反應(yīng)，結(jié)果顯示：0.2%MI、0.02%MI和0.01%MI引起的皮膚不良反應(yīng)發(fā)生例數(shù)分別為7例、3例和2例，發(fā)生率分別為5.65%、2.42%和1.61%，與0.001%MI以及蒸餾水對(duì)照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度MI在健康受試者中引起的各級(jí)皮膚反應(yīng)發(fā)生率

2.2 不同濃度MI在化妝品接觸性皮炎患者中引起的皮膚反應(yīng) 筆者分別使用不同濃度的MI在98例化妝品接觸性皮炎患者中進(jìn)行了封閉型人體皮膚斑貼試驗(yàn)，患者在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)不同濃度MI的皮膚反應(yīng)評(píng)分詳見(jiàn)表2。其中0.2%MI、0.02%MI和0.01%MI在斑貼試驗(yàn)后的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)各級(jí)陽(yáng)性反應(yīng)均顯著多于0.001%MI。其中0.2%MI和0.02%MI在斑貼試驗(yàn)后出現(xiàn)了超強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)（+++）。

表2 不同濃度MI在化妝品接觸性皮炎患者中引起的皮膚反應(yīng) 例

筆者接下來(lái)比較了4種濃度的MI在斑貼試驗(yàn)去除48 h后引起的皮膚不良反應(yīng)例數(shù)和發(fā)生率。結(jié)果顯示，0.2%MI，0.02%MI和 0.01%MI引起的皮膚不良反應(yīng)的例數(shù)分別為44例，37例和33例，發(fā)生率分別為44.90%，37.76%和33.67%，與0.001%MI以及蒸餾水對(duì)照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4種濃度的MI引起的皮膚反應(yīng)發(fā)生率呈劑量依賴遞增，見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度MI在化妝品接觸性皮炎患者中引起的各級(jí)皮膚不良反應(yīng)發(fā)生率

3 討論

單獨(dú)使用MI是近年來(lái)較新應(yīng)用的化妝品防腐劑，但已位列第4種最易引起接觸致敏的化妝品防腐劑[5]。世界各國(guó)化妝品法規(guī)都將MI收錄在防腐劑目錄中，但均對(duì)其限量進(jìn)行了詳細(xì)規(guī)定。基于MI的易接觸致敏性，本研究旨在通過(guò)梯度稀釋4種濃度的MI，分別在健康人群和化妝品接觸性皮炎患者中進(jìn)行人體斑貼試驗(yàn)，研究MI的安全限量。

目前我國(guó)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）中規(guī)定，MI在駐留類產(chǎn)品和淋洗類產(chǎn)品中的添加量均不得超過(guò)0.01%。這和澳大利亞、加拿大、東盟等國(guó)的要求是一致的。而歐盟法規(guī)EC1223/2009 Annex V補(bǔ)充修訂案中規(guī)定，駐留類產(chǎn)品中不得添加MI，淋洗類產(chǎn)品中添加量不得超過(guò)0.001 5%[6]。因此在本研究中，筆者針對(duì)我國(guó)與歐盟法規(guī)的差異，在中國(guó)人群中選擇使用封閉型人體皮膚斑貼試驗(yàn)，來(lái)模擬MI在駐留類化妝品中對(duì)皮膚的影響。在受試物貼敷的時(shí)間上，筆者分別在健康志愿者和化妝品接觸性皮炎患者中使用了24 h和48 h。根據(jù)以往研究顯示，受試物貼敷24 h已經(jīng)可以判斷其是否致敏，但在化妝品接觸性皮炎患者中進(jìn)行診斷性斑貼試驗(yàn)時(shí)，使用48 h的貼敷時(shí)間會(huì)更加有利于判斷過(guò)敏原[7]。

在本研究中，共選擇使用了4種濃度梯度的MI，分別為0.2%，0.02%，0.01%和0.001%。在健康人群和化妝品接觸性皮炎患者斑貼試驗(yàn)結(jié)果中，引起皮膚不良反應(yīng)的最低濃度均為0.01%。在化妝品接觸性皮炎患者中，MI的陽(yáng)性率較高，并且0.2%，0.02%和0.01%MI所引起的2分皮膚反應(yīng)發(fā)生率呈劑量依賴性遞增，提示MI的致敏性隨濃度升高而增強(qiáng)。而0.001%MI在健康人群和化妝品接觸性皮炎患者中均未發(fā)生皮膚反應(yīng)。丹麥有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)MI接觸致敏患者在斑貼試驗(yàn)中對(duì)MI產(chǎn)生反應(yīng)的最低劑量為0.004 9%（49百萬(wàn)分比濃度，49 ppm）[8]。而5 ppm MI與0.4%苯氧乙醇聯(lián)合使用時(shí)就足以作為化妝品防腐劑使用[9]。因此，10 ppm MI可以作為既能夠達(dá)到防腐效果又較為安全的濃度。

綜上所述，本研究通過(guò)在健康人群和化妝品接觸性皮炎患者中的人體皮膚斑貼試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，我國(guó)現(xiàn)行法規(guī)中MI的限量濃度0.01%MI，在駐留類化妝品中較易引起皮膚不良反應(yīng)，而0.001%MI的劑量較為安全?；诒狙芯拷Y(jié)果，筆者建議降低目前化妝品法規(guī)中MI的限量，從而保證和提高化妝品的安全性。