周子維 ， 劉寶順 ， 武清揚(yáng) ， 畢婉君 ， 倪子鑫 ， 賴鐘雄 ， 孫 云

（1.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點實驗室，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002；3.武夷山市幔亭巖茶研究所，福建 武夷山 354300）

武夷巖茶是我國的傳統(tǒng)名茶，它是在武夷山自然生態(tài)環(huán)境條件下，選用適宜茶樹品種的鮮葉為原料，經(jīng)曬青、做青、殺青、揉捻、干燥、揀剔、篩分、勻堆、焙火等工藝制成的烏龍茶，具有“巖骨花香”的品質(zhì)特征[1]。 作為武夷巖茶的主要花色品種，武夷肉桂因香氣馥郁，似有辛辣的桂皮香而得名[2-3]，頗受市場青睞。

香氣是衡量茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，除茶樹品種所賦予的基底外，更多源自茶樹鮮葉采摘后的加工工藝[4-6]。 目前，茶樹鮮葉中已被分離鑒定的揮發(fā)性物質(zhì)約有80 余種， 烏龍茶中約有近400 種[7]。脂肪族類揮發(fā)性成分是茶葉中重要的香氣組分之一[8]，茶樹鮮葉在采后的萎凋、做青過程中產(chǎn)生的高溫、機(jī)械損傷等非生物脅迫，誘導(dǎo)了不飽和脂肪酸的脂氧合酶代謝途徑（LOX pathway）[1]中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而提升關(guān)鍵酶活力，促使離體鮮葉中以亞油酸、α-亞麻酸為代表的不飽和脂肪酸氧化降解，形成豐富的脂肪族類香氣物質(zhì)[9-10]。 根據(jù)LOX pathway 中關(guān)鍵限速酶LOX 的氧化產(chǎn)物氫過氧化物（9/13-HPOT） 的代謝差異， 可分為 LOX-AOS 和LOX-HPL 兩個支路途徑[11-12]， 前者在逆境脅迫中13S-HPOT 在丙二烯合酶（AOS） 、丙二烯氧化物環(huán)化酶（AOC）作用下形成12-氧植物二烯酸（OPDA），該物質(zhì)再歷經(jīng)還原和3 次β-氧化反應(yīng)后形成茉莉酸（JA），這是植物在生長發(fā)育過程中，最為迅捷的應(yīng)激信號物質(zhì)之一[13]。 后者主要響應(yīng)外源生物及非生物脅迫，在 HPL、ADH、AAT 的氧化、還原、酯化作用下，形成青葉醛、青葉醇、己酸己酯、乙酸葉醇酯等綠葉型揮發(fā)物及帶有彌散香味的果酯類[9，14]。

圖1 植物中不飽和脂肪酸脂肪氧合酶代謝途徑的兩個支路途徑Fig.1 Two branches of unsaturated fatty acid lipoxy genase pathway in plant

茶樹在不同口器昆蟲的危害下， 能激活LOXHPL 途徑上的基因，釋放GLVs 驅(qū)趕害蟲，吸引天敵[15-16]，與此同時，GLVs 又是茶葉加工過程中香氣構(gòu)成的重要組分[17]。 王晶（2010）研究了不同茶樹品種加工過程中LOX 與香氣形成的關(guān)系[18]。 GUI J 等（2015）以金萱為供試材料，發(fā)現(xiàn)脂肪氧合酶活力隨著工藝過程的推進(jìn)而升高，認(rèn)為烏龍茶的花果香與脂肪酸氧化降解的關(guān)系更為密切[19]。 HU CJ 等（2018）以佛手和浙農(nóng) 139 為試材，利用 GC-MS 與轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)， 指出LOX pathway 形成的GLVs是烏龍茶花果香品質(zhì)形成過程中的主要化學(xué)組分[20]。CHO 等[21]以青心大冇為材料，研究了臺式烏龍茶加工過程中關(guān)鍵代謝物及基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)在做青后期 LOX-HPL 途徑的 C6 醛類、C6 醇類、C6 酸類含量均有上升。ZENG L 等以金萱為材料，探究在茶葉采后持續(xù)的機(jī)械力損傷及低溫脅迫下α-亞麻酸（ALA）、亞油酸（LA）的含量及 LOX 基因相對表達(dá)量變化規(guī)律， 發(fā)現(xiàn)烏龍茶做青過程中的CsLOX1 基因能響應(yīng)持續(xù)的機(jī)械損傷及低溫脅迫[22]。 綜上，GLVs 既是茶樹應(yīng)對外界脅迫的防御策略， 同時在講究“看青做青”的烏龍茶加工過程中，它既是制茶過程中的重要指示物，又是烏龍茶天然花果香的前體， 但武夷巖茶加工過程中GLVs 形成及轉(zhuǎn)化的研究尚未見報道。

作者采用理想化的做青工藝參數(shù)探討了鮮葉、搖青葉、攤放葉在脂肪族類香氣組分及前體物質(zhì)上的差異， 認(rèn)為做青過程中的機(jī)械力損傷上調(diào)了LOX、ADH 相關(guān)基因的表達(dá)量， 促使烏龍茶形成天然的花果香[9]， 但僅基于 LC-MS，GC-MS 和 qRTPCR 技術(shù)分析LOX-HPL 途徑上部分基因轉(zhuǎn)錄水平和脂肪族類香氣揮發(fā)物的變化和相關(guān)性分析，缺乏了關(guān)鍵酶活性的探究，關(guān)鍵基因的選擇缺乏轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)的支撐。 而作者以武夷肉桂實際生產(chǎn)中的鮮葉（F）、曬青葉（SW）、做青過程葉（1T～5T）、殺青前葉（BP）為試材，采用 GC-TOF-MS 技術(shù)，獲得高通量香氣揮發(fā)物， 并結(jié)合LOX-HPL 途徑上關(guān)鍵酶LOX、ADH 及AAT 活力變化和基于轉(zhuǎn)錄組測序篩選獲得的關(guān)鍵基因表達(dá)量，構(gòu)建武夷巖茶加工過程中LOX-HPL 途徑中“香氣-酶活-基因”的代謝調(diào)控模型， 篩選LOX-HPL 途徑中與香氣品質(zhì)形成相關(guān)的潛在基因，旨在探究實際生產(chǎn)加工過程中脂肪族類香氣物質(zhì)的形成機(jī)理[3]。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

武夷肉桂鮮葉采自武夷山慧苑坑山場，采摘時間為2018 年5 月上旬。

1.2 主要試劑

植物中脂肪氧合酶（LOX）活力檢測試劑盒、乙醇脫氫酶（ADH）活力檢測試劑盒及乙醇?；D(zhuǎn)移酶（AAT）試劑盒：北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；總RNA 抽提試劑盒： 北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR 預(yù)混液：日本Takara 公司產(chǎn)品。

1.3 儀器設(shè)備

LGJ-25C 型真空冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)公司產(chǎn)品；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：德國 Gerstel 公司產(chǎn)品；7890B 氣相色譜： 美國 Agilent 公司產(chǎn)品；Pegasus HT 飛行時間質(zhì)譜：美國 LECO 公司產(chǎn)品；紫外/可見分光光度計：上海元析公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品；K5500 超微量分光光度計：北京凱奧公司產(chǎn)品；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀：美國羅氏公司產(chǎn)品。

1.4 工藝過程

以武夷巖茶初制過程進(jìn)行加工制作，工藝過程和主要技術(shù)參數(shù)、各工藝過程的表觀葉態(tài)成像及取樣節(jié)點如圖1 和表1 所示。 日光萎凋（曬青）溫度為20 ℃，歷時30 min；采用綜合做青機(jī)對萎凋葉進(jìn)行做青處理，做青期間溫度為26～30 ℃，做青總歷時為6 h 17 min。在武夷巖茶的做青結(jié)束后，往往并未立即進(jìn)行高溫殺青， 而是出做青桶堆積靜置1 h 左右，故增設(shè)殺青前葉。

圖2 武夷肉桂加工過程中的表觀葉態(tài)成像Fig.2 The apparent imaging of primary manufacturing process of Wuyi Rougui tea

1.5 分析方法

1.5.1 GC-TOF-MS 檢測脂肪族類香氣武夷肉桂過程樣經(jīng)真空冷凍干燥處理72 h 后，達(dá)“梗折即短”狀態(tài)，采用研缽充分研磨呈粉末狀，稱取2.0 g 粉末于20 mL 頂空瓶中[7]，SPME 法進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)的提取， 通過GC-TOF-MS 對提取到的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測。

表1 武夷肉桂加工過程取樣點Table 1 Sampled points during manufacturing process of Wuyi Rougui tea

SPME 條件：萃取針：PDMS/DVB（23 Ga，Plain，65 μm，美國 Supelco 公司產(chǎn)品）；孵育溫度：80 ℃；孵育時間：31 min；萃取時間：60 min；解析時間：3.5 min。

色譜條件： 色譜柱：Rxi?-5silMS （30 m×0.25 mm×0.25 μm）； 進(jìn)樣口溫度：250 ℃； 傳輸線溫度：275 ℃；載氣：氦氣；氦氣流量：1 mL/min；程序升溫：50 ℃保持 5 min，以 3 ℃/min 的速率升至 210 ℃，保持 3 min，以 15 ℃/min 的速率升至 230 ℃；不分流進(jìn)樣品。

質(zhì)譜條件：溶劑延遲時間：300 s；掃描范圍：30～500； 檢測器電壓：1 530 V；EI 電離能量：70 eV；離子源溫度：250 ℃。

1.5.2 紫外/可見分光光度法檢測關(guān)鍵酶活力LOX-HPL 途徑的關(guān)鍵酶LOX （紫外分光光度法），ADH（紫外分光光度法）及AAT（可見分光光度法）的活力檢測，具體步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5.3 葉片的總RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄稱取1.0 g供試材料， 利用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒抽提取樣品的總RNA，用1.2 g/dL 變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性， 并對吸光度及濃度進(jìn)行檢測，而后將提取的總RNA 采用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.5.4 qRT-PCR 檢測基因相對表達(dá)量以加工過程樣的mRNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 為模板，基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選出LOX-HPL 途徑關(guān)鍵基因7 條，利用qRT-PCR 技術(shù)對關(guān)鍵基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。采用DNAMAN 6.0 軟件設(shè)計基因的qRT-PCR 引物（表2），以 CsACT 為內(nèi)標(biāo)基因[23]。 反應(yīng)體系、PCR 反應(yīng)程序參照周子維等[9]進(jìn)行。采用2-△△Ct分別計算出關(guān)鍵基因的相對表達(dá)量[24]。

表2 茶樹LOX-HPL 途徑相關(guān)基因的引物列表Table 2 Primer sequences of related genes in LOX-HPL pathway in tea tree

1.5.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析差異顯著性分析采用SPSS 18.0 軟件中的圖凱（Tukey）HSD 法，P＜0.05 表示差異顯著。 相關(guān)性分析采用SPSS 18.0 軟件中雙變量相關(guān)性檢測，以皮爾森（Pearson）相關(guān)系數(shù)評估變量間的線性關(guān)系，采用雙尾檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 武夷肉桂加工中的脂肪族類香氣變化

武夷肉桂加工過程中脂肪族類香氣的動態(tài)變化如圖3 所示，共檢測獲得脂肪族醛類、醇類、酸類和酯類。 脂肪族醛類為2-己烯醛，該物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在工藝過程中呈下降趨勢，鮮葉在萎凋和第一次搖青后質(zhì)量分?jǐn)?shù)有大幅度的降低（43.20 %，59.40 %）。

脂肪族醇類有反-2-己烯醇、正己醇和反-3-己烯醇3 種， 反-2-己烯醇和正己醇的含量變化較為相似， 它們均在 5T 中累積達(dá)到最大值 （3.74×106、4.95×106）[8]， 且與其他過程樣品中的含量差異顯著（P＜0.05），而反-3-己烯醇的峰面積豐度較小，且在1T 中就達(dá)到最大值（3.96×104），在后期工藝過程中有所降低。 脂肪族酸類為己酸，它在工藝過程中呈上升趨勢，在 BP 中達(dá)到最大值（3.36×106）。

脂肪族酯類較為豐富，共測得20 種，將其分為葉醇酯、己烯酯和己酸酯3 個類別，其中葉醇酯類包含苯甲酸-3-葉醇酯、丁酸甲基葉醇酯、異戊酸葉醇酯、戊酸葉醇酯、己酸葉醇酯、苯乙酸葉醇酯和柳酸葉醇酯共7 種， 除苯甲酸-3-葉醇酯在第三次搖青后再未測得外， 該類型在加工過程中變化較一致， 均是隨著工藝過程的推進(jìn)而逐步積累提升的，在BP 中大部分的葉醇類仍有累積，達(dá)到最大值，且與先前工藝過程中的樣品間差異均達(dá)顯著水平。 己烯酯類包含乙酸-2-己烯酯、乙酸-3-己烯酯、三氟乙酸4-己烯酯、順-3-己烯基丁酯、順-2-己烯基丁酯、順-3-己烯酸己烯酯、反-2-己烯酸己酸酯、反-2-苯甲酸己烯酯共8 種，是脂肪族酯類中最為豐富的亞類。 在該亞類中乙酸-2-己烯酯、反-2-己烯酸己酸酯、 三氟乙酸-4-己烯酯具有類似的動態(tài)變化趨勢，三者均在做青工藝中累積增多，于5T 中達(dá)最大值（1.28×106、7.04×106、5.45×105），并與先前的過程樣間的差異達(dá)顯著水平，值得注意的是，三者在BP 中含量出現(xiàn)降低，其中乙酸-2-己烯酯、反-2-己烯酸己酸酯在BP 與5T 中的差異存在顯著性； 反-2-苯甲酸己烯酯、順-3-己烯丁酯和順-2-己烯丁酯在武夷肉桂加工過程中，具有與葉醇酯相似的動態(tài)變化規(guī)律，三者均隨著工藝過程的推進(jìn)不斷累積增多， 在 BP 中達(dá)到最大值 （1.87×106、1.22×107、2.39×106），且與先前樣品中的含量均存在顯著性差異（除順-3-己烯丁酯的BP 與5T 外）。 而剩余的乙酸-3-己烯酯在萎凋后有大幅度提升（191.10%），而隨著做青工藝的開展，含量逐步下降，而順-3-己烯酸己烯酯則呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，在4T中達(dá)到最大值（6.81×106），但在 5T 和 BP 中含量有所降低，但與鮮葉間的差異仍存在顯著性差異。 己酸酯包含己酸甲酯、環(huán)戊基己酸酯、4-戊基己酸酯、己酸己酯、2-戊基己酸酯共5 種類型， 其中己酸甲酯、 己酸己酯、4-戊基己酸酯和2-戊基己酸酯在武夷肉桂加工過程中均呈上升趨勢，除2-戊基己酸酯在 5T 中達(dá)到最大值（7.04×106）外，其余三者均在BP 中達(dá)到最大值（2.87×105、9.10×106、2.11×105），而BP 中的己酸甲酯和己酸己酯均與前期處理樣品中存在顯著差異， 而環(huán)戊基己酸酯在第三次搖青葉（2T）方測得（3.92×106），但 5T 和 BP 中有所降低，但與2T～4T 階段并不存在顯著性差異。

圖3 武夷肉桂加工過程中脂肪族類香氣物質(zhì)的動態(tài)變化Fig.3 The dynamic variation of aliphatic aroma-related volatiles during manufacturing process of Wuyi Rougui tea

2.2 武夷肉桂加工過程中LOX-HPL 途徑關(guān)鍵酶活力變化

武夷肉桂加工過程中LOX-HPL 途徑關(guān)鍵酶LOX、ADH 及 AAT 的活性變化如圖4 所示。 LOX 活力在萎凋過程中有所降低，做青階段開始活力逐步上升并于第三次搖青葉（3T）達(dá)到最大值（1.04×104U/g），而后開始逐步下降，在5T 中達(dá)到最低值（4.7×103U/g）， 且與 3T 中的活力存在顯著性差異 （P＜0.05）， 但在做青結(jié)束后的靜置攤放過程中LOX 活力又有所上升。 ADH 在工藝過程前期變化并不明顯，直至 4T 中活力達(dá)到最大值（1.94 μmol/（min·g）），而后又呈下降趨勢， 在 BP 中將至最低值（0.71 μmol/（min·g））， 同時與 4T 中的活力存在顯著性差異（P＜0.05）。 與 ADH 相似，AAT 在鮮葉（F）至 4T 中的工藝前階段活力變化幅度較小，兩兩間并無顯著性差異，但在5T 中，活性陡然提升至最大值（207.69 U/g）， 并與其他樣品中的活力均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 武夷肉桂加工中LOX-HPL 途徑結(jié)構(gòu)基因的相對表達(dá)量

采用離心柱法對武夷肉桂加工過程樣進(jìn)行總RNA 的抽提， 通過RNA 完整性及純度的檢測結(jié)果表明， 武夷肉桂加工過程樣總RNA 的凝膠電泳均具備較清晰的18 S 和28 S 亞基條帶， 且無明顯的拖尾彌散，見圖4（a），這表明離體的武夷肉桂鮮葉在曬青和做青處理過程中，RNA 未出現(xiàn)明顯降解，而超微量分光光度計檢測的結(jié)果表明，武夷肉桂加工過程樣總RNA 的質(zhì)量濃度介于400～800 ng/mL，A260nm與 A280nm比值介于 2.00～2.10 之間， 且所有樣品在 A260nm處均具備單一的吸收峰，見圖4（b）。 因此， 武夷肉桂加工過程樣進(jìn)行總RNA 符合試驗要求，可開展下一步試驗[10]。

武夷肉桂加工過程中LOX-HPL 途徑關(guān)鍵基因表達(dá)譜熱圖如圖5 所示。 LOX 相關(guān)基因CsLOX2 及CsLOX5 具有較為相似的表達(dá)模式， 均是隨著工藝過程的推進(jìn)先升高而后降低， 這契合了2.2 中LOX活力的變化趨勢，且CsLOX2 與CsLOX5 均在2T 中達(dá)到最大值（6.96、7.53），且與其他樣品的表達(dá)量存在顯著性差異，CsLOX3 基因則在BP 中有所表達(dá)，CsLOX1 基因在做青前期表達(dá)略微上調(diào)后， 呈下降趨勢， 同時CsLOX3 與CsLOX1 基因表達(dá)量在武夷肉桂加工過程中兩兩均不存在顯著性差異。

CsADH2-1 基因在第四次搖青前相對表達(dá)量較低，兩兩間均不存在顯著差異，但在5T、6T 中表達(dá)量陡然上調(diào)至最大值（2.79），且與先前處理中表達(dá)量存在顯著差異。CsAAT 基因在2T、4T 中存在上調(diào)表達(dá)現(xiàn)象， 盡管CsLOX3 基因在BP 中表達(dá)量有所提升，但它與 CsADH2-2、CsLOX1 基因相似，在武夷肉桂加工過程中表達(dá)量變化幅度較小，兩兩間均不存在顯著性差異。

圖5 武夷肉桂加工過程中RNA 的凝膠電泳圖及樣品總RNA 的吸光度Fig.5 Electrophoretogram of total RNA and absorbance fluctuations of Wuyi Rougui tea samples during manufacturing process

圖6 武夷肉桂加工過程中LOX-HPL 途徑關(guān)鍵基因表達(dá)譜熱圖Fig.6 Heat map of LOX-HPL pathway key genes expression profile during manufacturing process of Wuyi Rougui tea

2.4 武夷肉桂加工過程中LOX-HPL 途徑脂肪族類香氣-酶活-基因的關(guān)聯(lián)性分析

LOX-HPL 途徑中脂肪族類香氣、酶活力、基因表達(dá)量在武夷肉桂加工過程中的相關(guān)性熱圖如圖7所示。

在脂肪族類香氣與酶活力之間，與LOX 存在顯著正相關(guān)的有順-3-己烯酸己烯酯（0.740*）、環(huán)戊基己酸酯（0.764*），而并未發(fā)現(xiàn)與ADH 存在顯著正相關(guān)的香氣物質(zhì)。

在脂肪族類香氣與基因表達(dá)量之間，CsLOX1與苯甲酸-3-葉醇酯存在顯著正相關(guān) （0.800*）。 與LOX 相似，CsLOX5 基因與順-3-己烯酸己烯酯、環(huán)戊基己酸酯也存在顯著正相關(guān)（0.786*，0.740*）。 作為LOX-HPL 途徑中將C6 醛還原為C6 醇的關(guān)鍵酶相關(guān)基因，CsADH2-1 基因與順-2-己烯基丁酯（0.906**）、戊酸葉醇酯（0.857** ）、反-2-己烯酸己酸酯（0.920**）、反-2-苯甲酸己烯酯（0.902** ）、己酸己酯（0.904** ）、2-戊基己酸酯（0.920**）存在極顯著正相關(guān)，同時與反-2-己烯醇（0.774*）、正己醇（0.790*）、順-3-己烯基丁酯（0.734*）、丁酸甲基葉醇酯（0.793*）、苯乙酸葉醇酯（0747* ）、柳酸葉醇酯（0.825* ）、 己酸甲酯 （0.734* ）、4-戊基己酸酯（0.771*）存在顯著正相關(guān)。 CsADH2-2 基因則與2-己烯醛存在顯著正相關(guān)（0.727*），而與反-3-己烯醇存在顯著性負(fù)相關(guān)（-0.796*）。

圖7 武夷肉桂加工過程中LOX-HPL 途徑中脂肪族類香氣-酶活力-基因表達(dá)量的相關(guān)性熱圖Fig.7 Heat map of correlation coefficient among aliphatic aroma enzyme activity gene expression level during manufacturing process of Wuyi Rougui tea

在基因之間，CsLOX2 基因與 CsLOX5 和CsAAT 基因分別存在極顯著 （0.914**） 和顯著（0.762*）的正相關(guān)，同時 CsLOX5 與 CsAAT 基因亦存在顯著正相關(guān)（0.732*）。

在脂肪族類香氣之間，2-己烯醛與反-3-己烯醇存在極顯著負(fù)相關(guān)（-0.901**）、與順-3-己烯基丁酯（-0.761* ）、己酸葉醇酯（-0.708*）、順-3-己烯酸己烯酯（-0.785*）、柳酸葉醇酯（-0.720* ）、己酸（-0.798*）間存在顯著負(fù)相關(guān)；己酸與三氟乙酸4-己烯酯（0.832*）、順-3-己烯基丁酯（0.830*）、異戊酸葉醇酯（0.712*）及己酸葉醇酯（0.822*）間存在顯著正相關(guān)； 與乙酸-3-己烯酯存在顯著負(fù)相關(guān)的有三氟乙酸4-己烯酯 （-0.794*）、 順-3-己烯基丁酯（-0.724*）、順-2-己烯基丁酯（-0.726*）、丁酸甲基葉醇酯（-0.739*）、異戊酸葉醇酯（-0.725*）、戊酸葉醇酯（-0.722*）、己酸葉醇酯（-0.777*）、反-2-己烯酸己酸酯（-0.724*）、柳酸葉醇酯（-0.757*）、己酸甲酯（-0.725*）、4-戊基己酸酯（-0.735*）、2-戊基己酸酯（-0.724*）。 而在葉醇酯、己烯酯和己酸酯的3 個亞類兩兩之間普遍存在著極顯著或顯著的正相關(guān)。 此外， 順-3-己烯酸己烯酯和環(huán)戊基己酸酯與其他酯類間不存在顯著的相關(guān)性， 但兩者與LOX 及CsLOX5 存在顯著正相關(guān)。

3 討 論

3.1 武夷肉桂加工過程中的香氣變化

在茶樹鮮葉中，長鏈不飽和脂肪酸α-亞麻酸和亞油酸是LOX-HPL 代謝的前體物質(zhì)[26]，在LOX/HPL 酶系統(tǒng)的氧化裂解下，α-亞油酸降解己烯醛、己烯醇及相應(yīng)的葉醇酯類，而亞油酸則降解形成正己醛、正己醇及相應(yīng)的己醇酯類[27-28]。 在武夷肉桂的加工過程中，乙酸-2-己烯酯、反-2-己烯酸己酸酯、三氟乙酸-4-己烯酯等以亞油酸為前體的己烯酯類在最后一次搖青處理（5T）中達(dá)到最大值，而在殺青前的靜置攤放過程中，含量有所降低。 以異戊酸葉醇酯、戊酸葉醇酯、己酸葉醇酯、苯乙酸葉醇酯和柳酸葉醇酯等7 種以α-亞油酸為前體的葉醇酯類，它們在加工過程中不斷累積，在殺青前的攤放過程中亦然。 該結(jié)果說明，亞麻酸的代謝可能主要響應(yīng)做青過程中所產(chǎn)生的外源機(jī)械力損傷，而α-亞油酸的代謝則可能不完全依賴于機(jī)械力的刺激，而主要響應(yīng)鮮葉靜置失水。 作者在先前的研究中，發(fā)現(xiàn)烏龍品種毛蟹（Camellia sinensis cv.Maoxie）在搖青葉中積累較多的己烯醇，如反-2-己烯醇（0.48%） 、反-3-己烯醇（0.30%） 以及反-4-己烯醇（3.75%），而未搖青的攤放葉中則僅有反-2-己烯醇（0.47%）[9，11]這也說表明外源機(jī)械損傷可以推進(jìn)亞油酸的氧化裂解。 脂肪醛類具有強(qiáng)烈的青草氣，在茶樹鮮葉芳香油中占比約3%，作為茶葉中低級脂肪醛類的代表，2-己烯醛 （CH3CH2CH2-CH ＝CH-CHO， 分 子 量98.14）具備較高的沸點（150～152 ℃），是茶葉清香氣味的主要成分之一[7，29]。 在武夷肉桂的加工過程中，脂肪族醛類僅測得2-己烯醛，這可能是茶樹鮮葉在采摘形成的第一次機(jī)械損傷后[9]、再經(jīng)回廠過程中，促進(jìn)了脂肪族醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化和揮發(fā)，而僅測得較為穩(wěn)定的高沸點脂肪族醛——2-己烯醛。

己醛類物質(zhì)被ADH 還原為己醇的同時， 還有一部分被氧化為己酸， 而后形成己酸酯類物質(zhì)，具備清新果香[30-31]。 在武夷肉桂加工過程中，測得了己酸甲酯、 己酸己酯、4-戊基己酸酯和2-戊基己酸酯等己酯類，其中己酸甲酯呈似菠蘿香氣，己酸己酯有生水果的清香。 己酸酯類的形成得益于己醛氧化形成的己酸。 不同于鐵觀音做青過程的搖青與靜置，武夷肉桂的做青在綜合做青機(jī)中完成，是在較為溫暖（25～30 ℃）的做青間對青葉進(jìn)行“送風(fēng)-搖青-停機(jī)”的過程。 搖青的同時，伴隨著做青設(shè)備內(nèi)部風(fēng)管的送風(fēng)，風(fēng)壓將氣流穿過風(fēng)管的孔洞，在鮮葉加溫走水的同時[32]，也帶來了一定的氧氣，這可能是己醛類物質(zhì)氧化的主要驅(qū)動力。 因此，武夷肉桂加工工藝在給離體鮮葉帶來外源機(jī)械力的同時，還存在著溫度、氣流等的影響，許多LOX 相關(guān)基因則還可響應(yīng)溫度[33]、光質(zhì)[34]等因素，所以基于氣流、溫度、 光質(zhì)等因子的烏龍茶加工過程中LOX-HPL 代謝通路的研究還有待進(jìn)一步深入。

3.2 武夷肉桂加工過程中的LOX-HPL 酶活力和基因轉(zhuǎn)錄

對多元不飽和脂肪的酶促反應(yīng)，形成的C-6/-9類揮發(fā)性物質(zhì)，這既是植物應(yīng)對逆境脅迫的生長和生存機(jī)制[35]，也是植物形成特征性風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)鍵基礎(chǔ)[36]。 通過對武夷肉桂加工過程中LOX-HPL 途徑關(guān)鍵酶的活性檢測， 發(fā)現(xiàn)隨著工藝過程的推進(jìn)，代謝途徑的關(guān)鍵酶LOX、ADH 和AAT 接連在3T，4T和5T 中達(dá)到最大值，其中關(guān)鍵限速酶LOX 先升高后下降的結(jié)果與王晶的研究基本一致[18]，而CHO 等的研究也指出東方美人茶在做青后期，脂肪族類香氣的增多與LOX 活力提升有關(guān)[21]。 3T-5T 階段作為酶活變化最為明顯的時期，LOX-HPL 支路關(guān)鍵酶可能積極響應(yīng)該時期劇烈的二次機(jī)械損傷[9]、溫度[32]、失水[37]等的脅迫，而成為武夷肉桂香氣形成的重要階段。

LOX-HPL 途徑相關(guān)基因在番茄[38]、桃子[39]、白梨[40]、等許多園藝植物成熟及采后處理過程中香氣品質(zhì)的形成起重要作用。Liu 等[17]鑒定出了茶樹中首個脂肪氧合酶調(diào)控的基因CsLOX1， 該研究認(rèn)為CsLOX1 基因主要在茶花的衰老過程中大量表達(dá)。近年來，基于茶樹阿薩姆變種和中國變種的LOX 基因家族成員的鑒定已先后見報[32]。 在武夷肉桂的加工過程中，LOX-HPL 途徑 CsLOX2、CsLOX5 基因均有上調(diào)表達(dá)，且與部分脂肪族酯類間存在極顯著或顯著的正相關(guān)。而作者所在課題組先前的報道[9，23]指出，在搖青處理下CsLOX1 基因表達(dá)顯著上調(diào)，與青葉醛、正己醛含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與正己醇、反-3-己烯醇、反-4-己烯醇、丁酸葉醇酯、己酸葉醇酯、苯甲酸葉醇酯、異戊酸葉醇酯及丁酸己酯含量間均存在極顯著正相關(guān)， 認(rèn)為CsLOX1 是做青過程中的“明星基因”，其高表達(dá)與烏龍茶的花果香有著密切相關(guān)[12]。但是，在武夷巖茶的做青過程中，CsLOX1 基因在2T 中已達(dá)到最高值， 且整個加工過程中變化并不顯著。 該現(xiàn)象形成的原因除了茶樹品種的差異外，更多的是實際生產(chǎn)樣品與實驗室處理樣品的差異。 在閩北烏龍茶產(chǎn)區(qū)有著“勤肉桂，懶水仙”之說，這反映了武夷肉桂生產(chǎn)加工過程中，伴隨著頻繁且大量的外源機(jī)械力刺激，這在一定程度上可能推進(jìn)了LOX-HPL 途徑的代謝進(jìn)程，進(jìn)而初始CsADH2-1、CsAAT 基因在做青后期顯著上調(diào)表達(dá)， 其中CsADH2-1 基因與多種具備天然花果香的酯類存在極顯著或顯著相關(guān)，該結(jié)果與HU C J 等[20]的研究結(jié)果較為接近，盡管CsAAT 基因與脂肪族酯類物質(zhì)間未呈現(xiàn)出顯著水平， 但該基因與CsLOX3、CsLOX5基因具有相似表達(dá)模式，它們間形成的協(xié)同共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，或許正是武夷肉桂加工過程中脂肪族類香氣品質(zhì)形成的重要分子機(jī)理之一。