潘佳昕， 楊 恒， 時(shí)海波， 張新笑， 鄒 燁， 徐為民， 王道營(yíng)

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇 南京 210014）

2017 年，中國(guó)的雞肉產(chǎn)量為 1 200 萬(wàn)噸[1]，雞肺產(chǎn)量約為8.5 萬(wàn)噸， 但其高值化產(chǎn)品的開發(fā)與綜合利用卻沒有很好地進(jìn)行。 雞肺難以清洗，故不為人類食用。 目前，雞肺基本以贈(zèng)送的方式外包給養(yǎng)殖戶作為狐貍和貂等的動(dòng)物飼料或直接棄置于環(huán)境中，造成副產(chǎn)物資源浪費(fèi)以及環(huán)境污染。 雞肺干物質(zhì)中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)70%，但現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)雞肺的研究極少。 李小勇[2]、王春煥等[3]對(duì)豬肺及牛肺中的膠原蛋白進(jìn)行了提取和純化，為從動(dòng)物肺中提取蛋白質(zhì)提供了可行性參考，但有關(guān)雞肺膠原蛋白的理化性質(zhì)研究并未見報(bào)道。 明膠是一種從豬、牛、魚等動(dòng)物性食品副產(chǎn)物中提取的天然高分子化合物，是膠原在酸、堿、酶或高溫下的水解變性產(chǎn)物[4]，可廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。

膠原明膠化的過(guò)程涉及膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的共價(jià)交聯(lián)的維系和穩(wěn)定及非共價(jià)鍵的破壞，三螺旋結(jié)構(gòu)從而展開，非螺旋結(jié)晶區(qū)的破壞使得膠原亞基分子游離出來(lái)[5]。 制備明膠預(yù)處理的方法主要包括酸法、堿法、酶法、超高壓法等，目前，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的只有傳統(tǒng)的酸堿法，而對(duì)于酶法制膠的理論研究較少。 伴隨著常規(guī)酸堿法產(chǎn)率低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)及廢液污染等問(wèn)題，Singh 等[6]比較了酸和胃蛋白酶預(yù)處理的明膠得率和特性，發(fā)現(xiàn)酶法提取率高，且對(duì)膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。 超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)等多重效應(yīng)不但能加快化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行，促進(jìn)蛋白質(zhì)溶出，還能打開膠原的纖維結(jié)構(gòu)促進(jìn)酶解[7]。 Kim[8]等發(fā)現(xiàn)超聲輔助乙酸提取鱸魚皮膠原的得率較高。Li[7]等發(fā)現(xiàn)超聲輔助胃蛋白酶提取的膠原與單一酶法比較，得率較高且生產(chǎn)周期縮短。

作者采用超聲輔助酶解法從雞肺中提取明膠，研究超聲輔助酶提明膠的效果及在食品體系中的應(yīng)用，為肉雞副產(chǎn)物的高值化利用與綜合開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞肺：常州市立華牧業(yè)有限公司提供；胃蛋白酶（USP 級(jí)）：上海源葉生物科技有限公司提供。

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（SCIENTZ-IID）：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；磁力加熱攪拌器（78-1）：常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：南京科爾儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；CHRIST 冷凍干燥機(jī)（Alpha 1-2 LDplu）：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品； 差示掃描量熱儀（STA-449C）：德國(guó) NETZSCH 公司產(chǎn)品；圓二色譜儀（Jasco-715）：日本Jasco 公司產(chǎn)品；掃描電子顯微鏡 （EVO-LS10）： 德國(guó) ZEISSE Oberkochen 公司產(chǎn)品；紫外分光光度儀（UV-6100）：上海美普達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品； 馬爾文激光粒度分析 （Zetasizer Nano Zs90）：英國(guó)Malvern 儀器有限公司產(chǎn)品；分散均質(zhì)機(jī)T25：德國(guó)IKA 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞肺除雜雞肺雜蛋白質(zhì)去除參照李越[9]的方法，并加以修改。

1.2.2 常規(guī)熱水提取雞肺明膠參考張思琦[10]的方法提取明膠，并作改進(jìn)。

1.2.3 超聲輔助酶解提取雞肺明膠取10 g 脫雜雞肺， 溶于 0.5 mol/L 乙酸，200 W 超聲處理 10 min，超聲處理器工作 2 s，停歇 3 s。 隨后于 42 ℃恒溫水浴鍋中150 r/min 磁力攪拌，加胃蛋白酶1 mL，酶提 4 h， 反應(yīng)結(jié)束后 100 ℃滅酶 10 min。 放置室溫，再將樣品通過(guò)真空抽濾瓶抽濾，收集濾液，倒入干凈的表面皿， 于-40 ℃冰箱冷凍， 最后冷凍干燥24 h，收集樣品。

1.2.4 明膠得率的計(jì)算明膠的得率根據(jù)Nagarajan[11]等報(bào)道的方法測(cè)定，以去雜原料與制得樣品經(jīng)冷凍干燥后的質(zhì)量的比值計(jì)。

1.2.5 熱穩(wěn)定性明膠的玻璃轉(zhuǎn)化溫度用差示掃描量熱（DSC）儀測(cè)定，參考汲聰玲[12]的方法。 精準(zhǔn)稱量8 mg 樣品蛋白于鋁坩堝中，加蓋密封，設(shè)置溫度的掃描范圍為 20～200 ℃，升溫速率為 2 ℃/min。 以空鋁坩堝為參比。

1.2.6 圓二色譜 （CD）明膠溶液的近紫外圓二光譜變化通過(guò)圓二色譜儀測(cè)定。 將制備的樣品配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 蛋白溶液， 注入1 mm 厚的樣品池。 設(shè)置掃描范圍為190～260 nm，掃描速度為50 nm/min，光譜間隔為1.0 nm。CD 數(shù)據(jù)以平均橢圓率表示，采用CD Pro 軟件分析明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析配制分離膠（12 g/dL）和濃縮膠（5 g/dL），明膠的亞基組分測(cè)定參照汲聰玲[12]的方法并作改進(jìn)。 將明膠溶液與pH 8.8 的0.06 mol/L Tris-HCl 緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù) 25%甘油、2% SDS、0.1%溴酚藍(lán)、5% β-巰基乙醇混合，沸水煮 10 min 后 10 000 g 離心 3 min，取 10 μL上清液上樣。用相對(duì)分子質(zhì)量為11 000～135 000 的蛋白Markers 做對(duì)照。 加入電泳緩沖液 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% SDS、0.192 mol/L 甘 氨 酸 、0.025 mol/L Tris-HCl），在 16 mA 電流下進(jìn)行 30 min 電泳后，調(diào)節(jié)電流強(qiáng)度為32 mA 繼續(xù)進(jìn)行1.5 h。 電泳結(jié)束后，取用R-250 考馬斯亮藍(lán)對(duì)其染色30 min，然后用混合液（體積分?jǐn)?shù)20%乙醇與80%蒸餾水） 脫色至能辨清條帶為止。

1.2.8 紫外吸收光譜掃描雞肺明膠的紫外吸收光譜采用紫外分光光度儀測(cè)定。 取適量明膠水解液，在190～500 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)，設(shè)置分辨率為0.5 nm，用紫外分光光度儀對(duì)明膠溶液進(jìn)行掃描。 以去離子水為參比。

1.2.9 粒徑分布采用馬爾文激光粒度分析儀檢測(cè)明膠顆粒的分布。 設(shè)置高穩(wěn)定氦-氖激光器的光源為633 nm，固體藍(lán)光光源波長(zhǎng)為466 nm，掃描速度為 1 000 次/秒， 重復(fù)性誤差≤±0.5%， 準(zhǔn)確性誤差≤±1.0%。 取 0.5 mol/L 乙酸的多分散系數(shù)（Polydispersity Index） 為 1.320， 明膠的散射指數(shù)（refractive index of the scatterers）為 1.500。 以濕法進(jìn)樣，每個(gè)樣品測(cè)3 次，取平均值。

1.2.10 掃描電鏡（SEM）取凍干后的明膠切片，置于EVO-LS10 型掃描電子顯微鏡的樣品艙中，在15 mA 的電流下噴金90 s。 取出置于掃描電鏡觀察室，以200 倍的放大倍數(shù)，選取不同位置的數(shù)點(diǎn)，調(diào)節(jié)圖像至清晰，觀察并拍攝雞肺明膠的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.11 乳化性利用濁度法測(cè)定明膠的乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）。 用磷酸鈉鹽緩沖溶液（PBS，0.1 mol/L）配制 10 g/L 明膠溶液 12 mL，并調(diào)節(jié)pH 至3.0，加入花生油5 mL。 采用均質(zhì)機(jī)將混合液于10 000 g 下均質(zhì)1 min，制得乳狀液，分別在0 min 和 10 min 時(shí)從容器底部取 50 μL，加入 5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的SDS， 混勻后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的SDS 溶液作參比， 立即測(cè)定其在500 nm 處的吸光度 A0，10 min 后，測(cè)吸光度值 A10。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，樣品作3 次平行試驗(yàn)。 用組間 ANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Turkey 檢驗(yàn)用于組間數(shù)據(jù)分析，P＜0.05，表示兩組之間差異顯著，并用Origin 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 明膠得率和效率

明膠的得率為干燥后明膠干質(zhì)量（g）與脫雜雞肺干質(zhì)量（g）的比例。 本試驗(yàn)中，胃蛋白提取的雞肺明膠得率為30.08%，比常規(guī)熱水提取的雞肺明膠得率（8.77%）提高了2.43 倍。通常，魚皮明膠的得率為50%左右[13]，雞肺中的雜蛋白較多，并且雞肺的韌性及分子內(nèi)與分子間的交聯(lián)程度較高， 導(dǎo)致雞肺明膠的提取率較低， 僅高于經(jīng)常規(guī)熱水提取法制得的軍曹魚 （13.8%）[14]、 舌鰨 （10.3%）[14]、 羅非魚魚鱗（7.08%）[15]等少數(shù)魚源明膠。

2.2 熱穩(wěn)定性

明膠的熱變性溫度通過(guò)差示量熱掃描（DSC）法進(jìn)行測(cè)定。加熱過(guò)程的DSC 曲線中的吸熱峰所對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)變斜線中點(diǎn)即為明膠的熱變性溫度，它表示明膠分子的結(jié)構(gòu)由螺旋向卷曲轉(zhuǎn)變[16]。圖1 顯示，明膠胃蛋白酶提取的熱變性溫度為90.22 ℃， 略低于常規(guī)熱水提取，這一結(jié)果與陳日春[17]的研究相符，通常酸法提取的膠原蛋白變性溫度稍高于酶法提取的膠原蛋白。 明膠分子的交聯(lián)作用越多，其變性溫度越高[18]，表明胃蛋白酶提取的明膠分子間的交聯(lián)程度較高。 試驗(yàn)提取的雞肺明膠的熱變性溫度高于一般的魚類明膠，如黃華雙[19]提取的魚鱗明膠（27 ℃）以及劉全嬌[20]提取的羅非魚皮明膠（76.36 ℃）。因此雞肺明膠具有熱變性溫度高的優(yōu)勢(shì)，可通過(guò)復(fù)合改性制備可食性膜用于食品的天然包裝中，因?yàn)槠浼炔粫?huì)因?yàn)闇囟鹊纳咴诒４嫫趦?nèi)熔化，又方便產(chǎn)品的運(yùn)輸。 此外也可作為穩(wěn)定劑和增稠劑添加至對(duì)溫度敏感的冷品，如冰淇淋、酸奶等食品中，能更好地抑制結(jié)晶[21]，降低熔化速度，使產(chǎn)品組織更堅(jiān)實(shí)細(xì)膩。

圖1 雞肺明膠的DSC 曲線Fig.1 DSC curves of chicken lung gelatin films

2.3 圓二色譜（CD）

通常， 膠原在CD 光譜圖中會(huì)表現(xiàn)出典型的三股螺旋結(jié)構(gòu)的分子特征， 即在220～230 nm 和200 nm 處分別出現(xiàn)正吸收峰和負(fù)吸收峰[22]。 由圖2 可見， 超聲輔助酶提明膠在201 nm 波長(zhǎng)處存在負(fù)吸收峰，在223 nm 波長(zhǎng)出現(xiàn)了一定程度的正吸收峰。220～230 nm 波段的正值吸收對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)α-螺旋[23]，胃蛋白酶切斷膠原分子的N 及C 端的非膠原性肽[24]，對(duì)膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，但會(huì)導(dǎo)致α鏈的降解[25]，導(dǎo)致正吸收峰不明顯。 有研究表明，負(fù)峰強(qiáng)度越大，無(wú)規(guī)則卷曲程度越大[26]，圖2 中胃蛋白酶提取的明膠的負(fù)峰強(qiáng)度明顯小于常規(guī)熱水提取的明膠，膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)較為完好，與鄭雅爻等[27]的測(cè)試結(jié)果相符。 利用胃蛋白酶提取的明膠形成類膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)[28]， 天然膠原的α-螺旋部分解鏈，但仍維持著膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，說(shuō)明超聲輔助酶提明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加有序。

圖2 雞肺明膠的CD 圖Fig.2 The CD spectra of gelatin extracted from chicken lung films

2.4 SDS-PAGE 分析

采用SDS-PAGE 檢測(cè)明膠樣品的亞基組成與相對(duì)分子質(zhì)量分布，明膠分子包含 α1、α2、β 這 3 條鏈，相對(duì)分子質(zhì)量在 130 000～250 000 之間[9]。 雞肺膠原轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z的過(guò)程涉及次級(jí)鍵的斷裂，隨機(jī)斷裂的鍵造成了膠原水解產(chǎn)物組分的多樣化，明膠分子既可能是單鏈，也可能是α 鏈片段的共價(jià)交聯(lián)體[29]。 如圖3，電泳條帶2 顯示，常規(guī)熱水提取的雞肺明膠組分包括α1、α2 鏈，以及不清晰的小分子片段，與李越[9]在SDS-PAGE 圖譜中觀察到的市售明膠類似。 雞肺胃蛋白酶提取的明膠電泳條帶1 沒有明顯的 α1、α2、β 這 3 條鏈對(duì)應(yīng)的電泳條帶中出現(xiàn)45 000～95 000 之間的一些占絕大部分的蛋白降解條帶，沒有明顯的 α1、α2、β 這 3 條鏈對(duì)應(yīng)的電泳條帶。 在酸性條件下用胃蛋白酶處理可切斷膠原分子N 及 C 端的非膠原性肽[24]，導(dǎo)致 α1、α2 鏈的展開。超聲波可以對(duì)雞肺膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)造成輕微降解，氫鍵的斷裂使得肽鏈變得松散，利于后期酸性pH 條件下的酶處理。 隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，加熱過(guò)程中膠原的肽端受到破壞， 分子間的共價(jià)鍵斷裂，高分子組分更容易降解，明膠分子游離出來(lái)。 孫藝等[30]在提取大目金槍魚皮明膠中的發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性蛋白酶的存在使明膠降解為小分子，電泳條帶1 中出現(xiàn)了低于45 000 的幾條模糊的小分子蛋白條帶，可能是由于進(jìn)一步的酶解， 明膠斷裂為更小的分子。也可能是在酸性條件下浸提使明膠發(fā)生了熱降解[26]，溶脹的膠原由于其疏松的結(jié)構(gòu)在熱水提取時(shí)更容易降解。

圖3 雞肺明膠的SDS-PAGE 圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis pattern of gelatin from chicken lung

2.5 紫外吸收光譜圖

明膠中由于存在 C＝O、CONH2、—COOH 等發(fā)色基團(tuán)， 紫外特征吸收峰通常出現(xiàn)在220 nm 波長(zhǎng)左右[31]，結(jié)果見圖4。 與圖中曲線吸收峰（229 nm）吻合，證明明膠肽鏈分子中存在酰胺鍵[32]，雞肺明膠溶液的紫外吸收光譜與Chandra[32]等的結(jié)果類似。大多數(shù)蛋白質(zhì)中存在的一些芳香族氨基酸殘基在波長(zhǎng)270～280 nm 處存在紫外吸收峰，在一般經(jīng)純化的明膠中不會(huì)出現(xiàn)，超聲輔助酶提明膠與常規(guī)熱水提取的明膠在280 nm 處有微量吸收， 說(shuō)明明膠樣品中只含有少量芳香族氨基酸，可以初步判斷試驗(yàn)提取的雞肺明膠具有較高的純度。 超聲輔助酶提明膠的雜峰較常規(guī)熱水提取的明膠雜峰更明顯。

2.6 粒徑分布

由圖5 可知，超聲輔助胃蛋白酶提取的明膠平均粒徑為396 nm，小于常規(guī)熱水提取。 超聲波處理會(huì)改變明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)，Yu 等[33]的研究表明超聲波處理過(guò)的明膠，其平均粒徑顯著下降。 可能是由于超聲波的物理效應(yīng)對(duì)分子間靜電作用的破壞以及氣穴效應(yīng)產(chǎn)生的強(qiáng)剪切力[34]，使得后續(xù)酶解過(guò)程中膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)解鏈程度較高，分子間的交聯(lián)鍵斷裂更為徹底，大分子蛋白進(jìn)一步降解得到明膠亞基，與SDS-PAGE 分析所得結(jié)果一致。

圖4 雞肺明膠的紫外圖譜Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of gelatin from chicken lung

圖5 雞肺明膠的粒徑分布Fig.5 Particle size distribution of gelatin from chicken lung

2.7 掃描電鏡（SEM）

雞肺明膠的微觀結(jié)構(gòu)利用SEM 觀察，與常規(guī)熱水提取的雞肺明膠（圖6（b））相比，經(jīng)過(guò)超聲輔助酶提取的明膠化膠原（圖6（a）），表面有較大程度的破碎，甚至出現(xiàn)較多的孔洞，這一變化與陳書霖等[35]研究的不同酸預(yù)處理下鰱魚皮明膠的表觀類似。 在酸性條件下膠原分子間的排斥力會(huì)增強(qiáng)，結(jié)果導(dǎo)致膠原在乙酸浸泡過(guò)程中逐漸發(fā)生溶脹，膠原表觀被明顯破壞。 超聲波對(duì)明膠的分子結(jié)構(gòu)起到疏松的效果[36]，雞肺膠原蛋白間原本緊密的交聯(lián)變得松散，有利于后期在酸性條件下進(jìn)行的酶解，使分子間的共價(jià)交聯(lián)和非共價(jià)鍵斷裂，大分子的膠原蛋白絕大多數(shù)被降解為小分子的膠原亞基，可能導(dǎo)致分子間疏水基團(tuán)的暴露，明膠化膠原呈無(wú)規(guī)則卷曲狀。 超聲輔助酶提明膠具有疏松孔洞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在糖果工業(yè)中，可作為攪打劑應(yīng)用于軟糖的生產(chǎn)，起吸水、增大體積、維持形態(tài)的作用。

圖6 雞肺明膠的微觀結(jié)構(gòu)（×200）Fig.6 Microstructure of gelatin from chicken lung（×200）

2.8 乳化性

明膠作為一種親水、親油的表面活性劑，肽鏈的疏水基團(tuán)使其具有一定的乳化性[37]，可以阻止晶體或離子的聚集，穩(wěn)定非均相懸浮液。 高速勻漿機(jī)的分散作用使得明膠分子與油滴界面接觸的數(shù)量增多，溶液中的明膠蛋白覆在油滴表面形成水包油的狀態(tài)。 制備的兩種明膠的乳化活性無(wú)明顯差異，其中超聲輔助酶提明膠的乳化穩(wěn)定性 （（139.92±9.8） min）略低于常規(guī)熱水提取明膠（（148.72±11.3）min），但仍顯著高于鯰魚皮明膠[38]（＜60 min）。 乳液中分子間的吸引力與運(yùn)動(dòng)碰撞形成了較大的液滴，其表面的解吸附作用使得液滴變得不穩(wěn)定，均質(zhì)后的明膠會(huì)出現(xiàn)一些較大的乳液液滴。 明膠分子與油滴界面間的疏水平衡隨著明膠溶解度的降低而被破壞，超聲輔助酶提明膠的乳化穩(wěn)定性由于乳液粒徑的增大而出現(xiàn)下降，可通過(guò)添加表面活性劑或修飾側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)酶提明膠進(jìn)行改性。

3 結(jié) 語(yǔ)

以雞肺為原料提取明膠，通過(guò)分析其結(jié)構(gòu)和乳化性，探究超聲輔助酶法的影響。 研究發(fā)現(xiàn)，在超聲波和胃蛋白酶的作用下，雞肺明膠的相對(duì)分子質(zhì)量降低， 表面微觀結(jié)構(gòu)疏松破碎， 平均粒徑減小13.7%。 試驗(yàn)結(jié)果表明，雞肺明膠具有較高的純度，與常規(guī)熱水法相比，超聲輔助酶提明膠的生產(chǎn)周期顯著縮短，得率顯著提高，具有良好的熱穩(wěn)定性與乳化穩(wěn)定性，二級(jí)結(jié)構(gòu)更為有序，可作為魚源明膠的替代品。