蔣彰，周志磊，姬中偉，韓吉臣，毛健,3*，周哲敏

1(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)3(國家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興，312000)4(山東即墨黃酒廠有限公司，山東 青島，266200)

黃酒是我國獨(dú)有的酒種，是世界三大古酒之一，具有悠久的歷史和獨(dú)特的釀造工藝。其中，即墨黃酒由于其“微苦焦香”的風(fēng)味深受廣大消費(fèi)者的喜愛，享有“黃酒北宗”的美稱，是中國北方黃酒的代表。即墨黃酒采用獨(dú)特的古遺六法釀造工藝：“黍米必齊，曲蘗必時，水泉必香，陶器必良，湛熾必潔，火齊必得”，其中“火齊必得”所對應(yīng)的工藝階段是“煮糜”?！爸竺印笔侵笇⒔缀蟮拇簏S米倒入鍋中生火加溫，待米煮透后，邊加溫邊用鍋鏟攪拌，使糜焦而不糊,這一步是古法工藝的關(guān)鍵步驟，更是即墨黃酒產(chǎn)生焦香的重要途徑[1]。

國內(nèi)對于黃酒的風(fēng)味研究已經(jīng)非常廣泛，但大多還集中于一維氣相色譜技術(shù)[2-4]。黃酒的香氣成分組成復(fù)雜，同時存在大量的色譜峰共流出的問題，一維氣相色譜靈敏度低，通常只能鑒定幾十個物質(zhì)，越來越不能滿足復(fù)雜樣品基質(zhì)的分析要求。全二維飛行時間質(zhì)譜(comprehensive two dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry，GC×GC-TOFMS)將全二維氣相色譜優(yōu)異的分離能力、高峰容量和飛行時間質(zhì)譜的高采集頻率、高靈敏度結(jié)合，解決了復(fù)雜組分難以分離鑒定的問題[5]。近年來GC×GC-TOFMS已經(jīng)應(yīng)用于黃酒香氣的研究中，ZHOU等[6]采用液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)和頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)的前處理方法共定性出267種揮發(fā)性成分；WANG等[7]采用溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)(solvent-assisted flavor evaporation，SAFE)、固相萃取(solid phase-extraction，SPE)和HS-SPME的前處理方法共定性出106種物質(zhì)，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對其中47種物質(zhì)進(jìn)行定量。

目前，國內(nèi)對即墨黃酒的煮糜香氣研究較少，僅有少量文獻(xiàn)對即墨黃酒的香氣成分進(jìn)行了報(bào)道[8-9]。本研究首次采用HS-SPME-ARROW和SAFE結(jié)合GC×GC-TOFMS技術(shù)解析即墨黃酒煮糜前后揮發(fā)性成分，這不僅探究了工藝對香氣成分的影響，也對即墨黃酒的品質(zhì)提升提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煮糜前后樣品(各取5個平行樣)，山東即墨黃酒廠有限公司；C5～C30正構(gòu)烷烴、2-辛醇(色譜純)、薄荷醇(色譜純)，Sigma-Aldrich(中國上海)；NaCl、無水硫酸鈉、二氯甲烷(色譜純)，中國國藥上海化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pegasus GC-HRT 4D+ 全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜，美國LECO公司；PAL RTC 自動進(jìn)樣系統(tǒng)及孵化爐和加熱攪拌模塊，瑞士CTC analytics AG 公司；120 μm DVB/CAR /PDMS固相萃取頭(PAL SPME ARROW)，瑞士CTC analytics AG 公司；SAFE裝置，德國Glasblaserei Bahr公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DF-101KS集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州恒巖儀器有限公司；氮吹儀，上海安譜公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HS-SPME法萃取揮發(fā)香氣成分

取粉碎后的樣品25 g于燒杯中，加入50 mL超純水，20 ℃條件下于超聲波清洗器中振蕩30 min[10]；取6 mL萃取液于20 mL頂空瓶中，加入3 g NaCl及10 μL 102.5 mg/L 2-辛醇溶液(內(nèi)標(biāo)物)，由PAL RTC系統(tǒng)自動進(jìn)樣。萃取溫度50 ℃，樣品平衡15 min，吸附30 min，解析時間5 min，不分流進(jìn)樣。

1.3.2 SAFE法萃取揮發(fā)香氣成分

取粉碎后的樣品80 g于錐形瓶中，加入160 mL二氯甲烷后用封口膜封口，于20 ℃搖床中以140 r/min振蕩6 h[11]。加入200 μL 100 mg/L薄荷醇溶液(內(nèi)標(biāo)物)與濾液定容至100 mL容量瓶中。將1 000 mL圓底燒瓶作為蒸餾瓶置于40 ℃恒溫水浴鍋中，1 000 mL圓底燒瓶作為收集瓶置于液氮中。保持SAFE的夾層為40 ℃，系統(tǒng)壓力在5×10-3Pa左右時開始滴加樣品。待收集瓶內(nèi)的二氯甲烷融化后使用無水硫酸鈉干燥、過濾，氮吹至1 mL備用。

1.3.3 GC×GC-TOFMS儀器條件

GC×GC條件：色譜柱：一維色譜柱TR-FFAP(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，二維色譜柱Rxi-17 sil MS(1 m×0.25 mm，0.25 μm)。色譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣；一維柱箱升溫程序：起始溫度40 ℃保持2 min，以5 ℃/min的速率升溫至230 ℃保持7 min。調(diào)制器調(diào)制時間：4 s，熱脈沖時間1.2 s。二維柱溫箱的溫度全程比一維柱溫箱高5 ℃。以高純氦氣作為載氣，流量為1 mL/min。

TOFMS條件：EI離子源，離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度240 ℃，電離能量70 eV。檢測器電壓為1 400 eV。采集質(zhì)量數(shù)范圍33～400 amu，采集頻率為100 spectrum/s。

此外，采用SAFE前處理方法，調(diào)制器調(diào)制時間為5 s，分流比為1∶10，進(jìn)樣量為0.2 μL。樣品皆為2組平行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采集由Pegasus 4D工作站采集，通過Chorm-aTOF軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，自動識別信噪比(S/N)>50的色譜峰后進(jìn)行自動積分解卷積和譜庫比對。篩選相似度≥700的化合物后通過保留指數(shù)(由相同條件下C5～C30計(jì)算得出)定性[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 煮糜后樣品揮發(fā)性化合物色譜結(jié)果分析

由圖1可知，大量化合物在一維色譜圖共流出，無法進(jìn)行有效的分離，導(dǎo)致關(guān)鍵香氣組分無法鑒定。

a-SPME提取后一維總離子流色譜圖；b-SAFE提取后一維總離子流色譜圖；c-SPME提取后二維總離子流色譜圖；d-SAFE提取后二維總離子流色譜圖圖1 煮糜后樣品經(jīng)SPME和SAFE提取后一維總離子流色譜圖及二維總離子流色譜圖Fig.1 GC×GC-TOFMS total 1D and 2D ion chromatogram of volatile compounds of millet boiling sample by SPME and SAFE

使用二維色譜分離后，在一維時間上同時出峰的化合物可以在二維色譜上得到分離，從而對復(fù)雜組分進(jìn)行定性分析[13]。2種前處理方法對黃酒中揮發(fā)性物質(zhì)的選擇性存在差異，HS-SPME-ARROW前處理所得的色譜峰主要集中在1 750 s之前，而SAFE前處理譜圖的色譜峰則在集中在1 000 s之后。說明HS-SPME-ARROW方法利于吸附易揮發(fā)化合物，而SAFE方法則對較高沸點(diǎn)的化合物有良好的提取能力。

2.2 即墨黃酒煮糜前后揮發(fā)性化合物特性分析

使用2種前處理方法結(jié)合GC×GC-TOFMS，分別對煮糜前后樣品的揮發(fā)性組分進(jìn)行檢測。通過Pegasus 4D色譜分析工作站對質(zhì)譜庫檢索，選擇S/N>50的色譜峰，相似度 ≥700的化合物作為初步鑒定的結(jié)果，進(jìn)一步去除含硅的柱流出物、烷烴類等不呈風(fēng)味的化合物，最后通過對比保留指數(shù)分別定性出86和403種化合物(表1)。其中煮糜前樣品的揮發(fā)性組分以醇類、醛類、酮類、酯類物質(zhì)為主，而煮糜后樣品的揮發(fā)性組分則主要以含氮化合物、醛類、酮類、呋喃類、吡喃類物質(zhì)為主。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，僅有35種物質(zhì)在2種樣品中同時檢出，說明煮糜工藝產(chǎn)生大量揮發(fā)性組分。

表1 煮糜前后樣品通過GC×GC-TOFMS鑒定出的揮發(fā)性化合物Table 1 Volatile compounds identified in sample before and after millet boiling by GC×GC-TOFMS

醇類化合物在黃酒中是重要的呈香物質(zhì)，在煮糜前樣品中檢測到20種，占總量的23.26%。其中1-己醇在所有的化合物中峰面積占比最大，具有植物生青的香氣特征，同時也是白酒釀造谷物中重要的香氣物質(zhì)之一[14]。1-己醇在煮糜后樣品的峰面積僅次于β-苯乙醇，而β-苯乙醇與峰面積占比第3的2-乙基己醇共同賦予了煮糜后樣品花香的香氣特征。

醛、酮類化合物在煮糜前、煮糜后的樣品中分別檢測到37種83種，分別占總量的43.02%和20.60%。其中苯甲醛、苯乙醛同時在2種樣品的中峰面積分別占比第1、第2，呈現(xiàn)的苦杏仁香氣可賦予即墨黃酒獨(dú)特的堅(jiān)果風(fēng)味。而具有獨(dú)特焦糖風(fēng)味的甲基環(huán)戊烯醇酮[15]僅在煮糜后樣品中檢出，即墨黃酒獨(dú)特的煮糜工藝不僅使醛、酮類物質(zhì)的數(shù)量增加，還增強(qiáng)了黃酒焦香的風(fēng)味[16]。

酯類化合物在黃酒中是含量較為豐富的一類化合物，但在原料樣品中檢測到的物質(zhì)并不多，大部分是在微生物發(fā)酵階段產(chǎn)生[17]。同時在2種樣品中檢出的己酸乙酯、苯乙酸乙酯、丁二酸二乙酯具有的水果香、蜂蜜香，使得原料的香氣更加協(xié)調(diào)。

呋喃、吡喃類化合物也是黃酒中關(guān)鍵的一類香氣化合物?？啡Ⅺ溠糠?、乙基糠基醚同時在2種樣品中檢出，其具有特殊的杏仁、烤甜香。在煮糜后樣品中還檢出了菠蘿酮、2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、異麥芽醇、3,5-二羥基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮，這些焦糖香味化合物的結(jié)構(gòu)特征是環(huán)酮分子中含有烯醇化的結(jié)構(gòu)單元，此類化合物可能是引起煮糜后樣品焦糖香氣濃郁的主要原因[18]。

含氮化合物包括惡唑、吡咯、吡啶、吡嗪等，在煮糜后樣品中共定性到77種含氮化合物，占總量的19.11%(表2)。惡唑類物質(zhì)在醋中常被檢出，2,4,5-三甲基惡唑有較強(qiáng)的苦杏仁香氣，被認(rèn)為是鎮(zhèn)江香醋中重要的香氣化合物[19]；吡咯類物質(zhì)在焦香麥芽中被檢出[20]，1-糠基吡咯、2-乙?；量?、2-吡咯甲醛為煮糜樣品帶來了烘烤、咖啡香氣；而在2種樣品中同時檢出的吲哚，在白酒的窖泥中也有檢出，其在不同的濃度下有不同的香氣特征[21]；吡啶類物質(zhì)中的2-乙?；拎ぁ?-乙?；拎び袩煔?、爆米花香。吡嗪類物質(zhì)是黃酒香氣的重要來源，本次在煮糜樣品中共檢測出37種吡嗪類物質(zhì)，其中2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、2-乙?；拎?、2-甲基-5-異丙基吡嗪具有可可、咖啡、烘焙、堅(jiān)果的香氣，而2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪還具有抗氧化的功能性[22]。煮糜工藝中長時間高溫反應(yīng)發(fā)生的美拉德反應(yīng)可能是導(dǎo)致吡嗪類化合物大量增加的主要原因[23-24]。

表2 煮糜后樣品中鑒定的含氮化合物Table 2 Nitrogen-containing compounds identified in millet boiling sample

續(xù)表2

3 結(jié)論

本研究采用HS-SPME-ARROW和SAFE的前處理結(jié)合GC×GC-TOFMS方法解析即墨黃酒煮糜前后樣品，通過譜庫檢索和保留指數(shù)比對分別鑒定出86和403種揮發(fā)性化合物，說明經(jīng)過煮糜工藝產(chǎn)生了大量揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。其中具有焦糖香、烘烤香、堅(jiān)果香的醛類、酮類、含氮化合物、呋喃類、吡喃類物質(zhì)的數(shù)量增加，對煮糜樣品的焦香風(fēng)味均有所貢獻(xiàn)。此外萜烯類、酚類、內(nèi)酯類、含硫化合物的數(shù)量也有增加，這些化合物共同形成了煮糜的風(fēng)格特征。但本研究只是對煮糜前后的樣品進(jìn)行了分析，煮糜工藝對即墨黃酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)值得進(jìn)一步探究。