孫 峰 王海月 燕存子

結(jié)核性胸膜炎(tuberculous pleurisy, TP)是免疫相關(guān)的感染性疾病，是胸腔積液主要病因之一，近年來發(fā)生率呈逐年增加趨勢，嚴(yán)重危害社會健康[1]。多數(shù)研究者認(rèn)為,發(fā)病初期胸腔積液的產(chǎn)生與結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)直接感染胸膜有關(guān)，而后期與Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)有關(guān)[2]。巨噬細(xì)胞是結(jié)核性胸腔積液中主要的細(xì)胞成分之一，成熟的巨噬細(xì)胞在不同刺激誘導(dǎo)下可極化為促炎型M1巨噬細(xì)胞與抑炎型M2巨噬細(xì)胞。介導(dǎo)病原體免疫逃逸，在某種程度上被認(rèn)為導(dǎo)致了MTB的播散。持續(xù)感染MTB后可導(dǎo)致M1/M2的混合表達(dá)[3]。體外試驗發(fā)現(xiàn)，結(jié)核特異性多肽可刺激從結(jié)核性胸腔積液中分離的巨噬細(xì)胞向M1極化，產(chǎn)生高水平的促炎性細(xì)胞因子，這可能促進(jìn)結(jié)核性胸腔積液的產(chǎn)生[4]。抗結(jié)核治療是TP的主要治療措施，殺傷MTB同時可以抑制結(jié)核性胸腔積液的產(chǎn)生，但潛在機制尚不明確。本研究通過比較抗結(jié)核治療前后TP患者胸腔積液中M1型、M2型巨噬細(xì)胞比例及相關(guān)炎性細(xì)胞因子的變化，期望從免疫學(xué)角度闡明抗結(jié)核治療在抑制胸腔積液產(chǎn)生中的作用。

對象與方法

1.研究對象：前瞻性收集2018年10月～2019年9月在筆者醫(yī)院呼吸與呼吸危重癥中心住院治療的TP患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：①胸腔積液中蛋白定量>30g/L；②胸腔積液中白細(xì)胞計數(shù)>500×106/L；③胸腔積液中腺苷脫氨酶(adenosine deaminase, ADA)≥40U/L；④外周血γ干擾素釋放試驗(IGRA)陽性；⑤胸腔積液中MTB培養(yǎng)陽性或抗酸桿菌染色陽性；⑥胸膜活檢見干酪性肉芽腫；⑦除外結(jié)締組織病、肺炎、腫瘤等其他疾病。同時符合①、②、③、④、⑦條或者符合⑤和⑥任意1條標(biāo)準(zhǔn)可入組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他感染者；②入院后未取得胸腔積液者；③不能耐受抗結(jié)核治療者；④拒絕參加本研究的患者。本研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(審批號：20180913-08)，全部受試者均簽署知情同意書。

2.研究方法：所有受試者均在抗結(jié)核治療前行胸膜腔穿刺留取胸腔積液20ml置于枸櫞酸鈉抗凝管中。予以標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核治療方案：利福平0.45g/d，異煙肼0.3g/d，吡嗪酰胺1.5g/d，乙胺丁醇0.75g/d，以上藥物均由沈陽紅球制藥有限公司生產(chǎn)。利福平、異煙肼及乙胺丁醇清晨空腹頓服，吡嗪酰胺分3次于三餐后30min服用。若治療過程中出現(xiàn)不可耐受不良反應(yīng)，需要調(diào)整抗結(jié)核治療方案者，剔除本研究?？菇Y(jié)核治療5 天后再次行胸膜腔穿刺留取胸腔積液20ml。

3.標(biāo)本處理：所有受試者胸腔積液20ml離心(1500r/min，4℃，5min)，取上清液置于-80℃冰箱凍存用于ADA、IL-10與IL-12檢測。下層沉淀中再加入15ml 0.9%NaCl溶液混勻，加入裝有15ml Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液(美國GE healthcare公司)的離心管中離心(2500r/min，25min)。小心抽取中間層的單核細(xì)胞，用0.9%NaCl溶液混勻并洗滌兩遍，即得到胸腔積液單核細(xì)胞(plural effusion mononuclear cell，PEMC)，用于檢測M1、M2型巨噬細(xì)胞比例。

4.胸腔積液中M1與M2型比例的測定：將分離的PEMC用抗人CD14-FITC、CD86-PE/cy7、CD163-PE(美國Biolegend公司)標(biāo)記，用FC500流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)檢測這些分子的表達(dá)，CD14+CD86+為M1型巨噬細(xì)胞，CD14+CD163+為M2型巨噬細(xì)胞，表達(dá)水平用陽性細(xì)胞比例表示。

5.胸腔積液中炎性細(xì)胞因子檢測：將凍存標(biāo)本解凍后，采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定ADA、IL-10、IL-12的含量。試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司，按照操作說明書進(jìn)行檢測。

結(jié) 果

1.一般資料：共納入TP患者132例，抗結(jié)核治療5天后7例患者胸腔積液減少，不能留取胸腔積液，剔除本研究。最終入組TP的患者125例，其中男性67例，女性58例，患者中位年齡為47.0±29.5歲。

2.FCM檢測胸腔積液PFMC中M1、M2型巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況：TP患者治療前PFMC中M1型(CD14+CD86+)巨噬細(xì)胞較M2型(CD14+CD163+)巨噬細(xì)胞表達(dá)更高(P<0.05)?？菇Y(jié)核治療5天后，PFMC中M1、M2型巨噬細(xì)胞均較前增多，M1型巨噬細(xì)胞略有上升(P<0.05)，而M2型巨噬細(xì)胞顯著上升(P=0.000)，M2與M1型巨噬細(xì)胞比值M2/M1在抗結(jié)核治療后明顯上升(P=0.000)，詳見表1、圖1。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測抗結(jié)核治療前后TP患者胸腔積液中M1型(CD14+CD86+)、M2型(CD14+CD163+)巨噬細(xì)胞的比例

表1 TP患者胸腔積液中M1、M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)在抗結(jié)核治療前后的比較

3.抗結(jié)核治療前后TP患者胸腔積液中炎性細(xì)胞因子的比較：ELISA檢測TP患者胸腔積液中IL-10、IL-12、ADA的水平與TP患者治療前比較，胸腔積液中IL-10、IL-12濃度均較前下降(P<0.05)，但ADA較治療前無明顯變化(P>0.05)，詳見表2。

表2 胸腔積液中炎性細(xì)胞因子在抗結(jié)核治療前后的比較

4.M1、M2型巨噬細(xì)胞與炎性細(xì)胞因子相關(guān)性分析：治療前，胸腔積液中M1型巨噬細(xì)胞與IL-12呈正相關(guān)(r=0.463，P=0.000)；治療后M1型巨噬細(xì)胞與IL-12無明顯相關(guān)(P>0.05)。治療前后，M2型巨噬細(xì)胞與IL-10均無明顯相關(guān)(P>0.05)，詳見表3。

表3 胸腔積液中M1、M2型巨噬細(xì)胞與各項檢測指標(biāo)的相關(guān)性

討 論

胸腔積液是TP最主要的臨床表現(xiàn)，中量以上胸腔積液可引起呼吸困難、胸痛等臨床癥狀，若病情遷延惡化，還可引起膿胸、支氣管胸膜瘺、敗血癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，威脅患者生命安全，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及預(yù)后[6]。因此在抗結(jié)核治療中，抑制胸腔積液的產(chǎn)生至關(guān)重要。目前認(rèn)為結(jié)核性胸腔積液并非單純由于胸膜感染結(jié)核桿菌引起，結(jié)核桿菌特異性蛋白誘導(dǎo)的Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)對胸腔積液的產(chǎn)生起了重要作用。抗結(jié)核治療除了殺滅結(jié)核桿菌外，是否能影響TP患者的機體免疫功能，目前尚不明確。

巨噬細(xì)胞是機體重要的免疫細(xì)胞，具有抗原遞呈、吞噬及分泌多種細(xì)胞因子等功能，巨噬細(xì)胞有兩種極化方式，即經(jīng)典活化的M1型和選擇活動的M2型[7]。巨噬細(xì)胞作為結(jié)核感染的第一道防線，結(jié)核分支桿菌可促進(jìn)巨噬細(xì)胞本身抗原遞呈功能的上調(diào)和T細(xì)胞的激活，而激活的T細(xì)胞能夠分泌IFN-γ、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化[8，9]。成熟活化的巨噬細(xì)胞可極化為M1、M2型兩種形式，前者主要促進(jìn)炎性反應(yīng)，分泌多種促炎性細(xì)胞因子，如IL-1、IL-12、TNF-α等，CD86高表達(dá)；而M2型巨噬細(xì)胞主要抑制炎性反應(yīng)，合成及分泌抗炎性細(xì)胞因子IL-10、TNF-β等以促進(jìn)組織修復(fù)與重塑，CD163、CD206高表達(dá)[10]。本研究比較抗結(jié)核治療前后TP患者胸腔積液中M1型(CD14+CD86+)、M2型(CD14+CD163+)巨噬細(xì)胞比例，探討抗結(jié)核治療對TP患者胸腔積液中巨噬細(xì)胞極化方向的影響，闡述抗結(jié)核治療在抑制胸腔積液產(chǎn)生中的免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果顯示抗結(jié)核治療前，胸腔積液中巨噬細(xì)胞M1型(CD14+CD86+)表達(dá)更高，且與IL-12呈正相關(guān)。說明結(jié)核性胸腔積液中巨噬細(xì)胞向M1型極化，分泌更多的IL-12。這與申東梅等[4]研究結(jié)果相似，結(jié)核特異性蛋白在體外可刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)更多的CD86,更傾向于向M1型極化。M1型巨噬細(xì)胞的殺菌系統(tǒng)被激活，可增強殺滅胞內(nèi)寄生的MTB的能力，分泌IL-12、TNF-α等促炎性細(xì)胞因子及趨化因子，從而導(dǎo)致胸腔積液中IL-12濃度增高。IL-12可以促進(jìn)NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞的殺傷作用，可促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞向Th1分化，分泌大量IFN-γ，招募大量T細(xì)胞和單核-吞噬細(xì)胞，形成肉芽腫，局限病灶范圍[11]。IL-12還可以協(xié)同TGF-β1促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化，通過Treg細(xì)胞對T細(xì)胞進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)[12]。另一方面，M1型巨噬細(xì)胞具有更強的抗原遞呈功能，可誘發(fā)胸膜的變態(tài)反應(yīng)，促進(jìn)胸腔積液的形成[13]。

抗結(jié)核治療后，M1、M2型巨噬細(xì)胞比例均增高，且M2型增高更明顯，M2/M1比例較治療前明顯增高。說明抗結(jié)核治療雖然可降低體內(nèi)MTB菌量負(fù)荷，但不會因此而降低機體免疫反應(yīng)。動物研究證實異煙肼可抑制巨噬細(xì)胞釋放TNF-α,這可能是由于抗結(jié)核治療藥物促使巨噬細(xì)胞從M1型向M2型轉(zhuǎn)化，M2型巨噬細(xì)胞可分泌大量抑炎性細(xì)胞因子，使炎性反應(yīng)趨于平衡，有助于組織修復(fù)、重塑[14]。TP后期結(jié)核桿菌特異性蛋白導(dǎo)致胸膜發(fā)生遲發(fā)型超敏反應(yīng)，加速胸腔積液形成，M2型巨噬細(xì)胞的增高可抑制胸膜的免疫反應(yīng)，從而減少胸腔積液的形成?？菇Y(jié)核治療前后巨噬細(xì)胞極化方向的變化，揭示了抗結(jié)核治療有可能通過影響巨噬細(xì)胞的免疫功能抑制胸腔積液的產(chǎn)生。

在MTB感染從急性向慢性轉(zhuǎn)變的過程中，促炎性細(xì)胞因子和抗炎性細(xì)胞因子之間被認(rèn)為存在一個轉(zhuǎn)換的“開關(guān)”。二者之間的平衡作為一種保護(hù)機制可以起到阻止過度炎性反應(yīng)的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，胸腔積液M2細(xì)胞與IL-10無明顯相關(guān)性，提示胸腔積液中的IL-10可能并非來源于M2型巨噬細(xì)胞。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，Treg細(xì)胞也是IL-10的主要來源之一。Treg細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞分化而來，對機體的免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，可與CD86+的巨噬細(xì)胞相互作用，通過分泌IL-10等抑制性細(xì)胞因子來抑制免疫反應(yīng)[16]。結(jié)核性胸腔積液中的IL-10可能與Trag細(xì)胞活性增高有關(guān)，抗結(jié)核治療藥物對Treg細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用[17，18]。

腺苷脫氫酶(ADA)是一種腺苷分解酶，在淋巴細(xì)胞中活性最高，T淋巴細(xì)胞中活性是B淋巴細(xì)胞中的10～20倍。胸腔積液中ADA含量增高可用來診斷TP，反映T淋巴細(xì)胞的活性[19]。本研究結(jié)果顯示治療前后ADA無明顯變化，推測抗結(jié)核治療主要影響巨噬細(xì)胞的功能，而對淋巴細(xì)胞沒有明顯的影響。

綜上所述，在TP中巨噬細(xì)胞向M1型極化，分泌大量IL-12，參與胸腔積液產(chǎn)生，抗結(jié)核治療可使向M2型轉(zhuǎn)化。因此抗結(jié)核治療在清除MTB以外，還發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，有可能通過影響巨噬細(xì)胞的免疫功能抑制胸腔積液的產(chǎn)生。巨噬細(xì)胞極化對直接抑制胸腔積液產(chǎn)生的作用機制還需進(jìn)一步探討。