王紅娟，王 芳，呂小旭，張旭東，馬 偉

(1甘肅醫(yī)學(xué)院·甘肅 平?jīng)?744000；2平?jīng)鲂耜柨萍加邢挢?zé)任公司·甘肅 平?jīng)?744000)

大黃又名川軍、將軍、黃良等，是一種多年生草本植物，2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定大黃為蓼科多年生草本植物掌葉大黃(RheumpalmatumL)、唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex Balf)或藥用大黃(RheumofficinaleBaill)的干燥根和根莖[1]。掌葉大黃和唐古特大黃被稱為“北大黃”，主要產(chǎn)于青海和甘肅等地，藥用大黃稱為“南大黃”，主要產(chǎn)于四川和陜西等地[2]。大黃性寒味苦，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)，具有清熱解毒、攻下、活血等功效。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其所含結(jié)合蒽醌具有致瀉作用，游離蒽醌具有抑菌抗炎等功效；除此之外，還可用于消化系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)，可以調(diào)節(jié)機(jī)體的胃腸道功能，保護(hù)心血管作用，抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能[3]。本文主要選取不同產(chǎn)地的大黃，根據(jù)《中國(guó)藥典》記載的測(cè)定方法，進(jìn)行測(cè)定大黃中游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的含量，為大黃產(chǎn)地的優(yōu)選和質(zhì)量提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 大黃素對(duì)照品：上海如吉生物科技，批號(hào)：180810；青海西寧大黃：西寧市康美中藥城；河北安國(guó)大黃：河北安國(guó)藥材市場(chǎng)；甘肅華亭大黃：華亭市馬峽鄉(xiāng)碾盤子村；甘肅平?jīng)龃簏S：平?jīng)鍪嗅轻忌胶笊剑桓拭C岷縣大黃：甘肅省定西市岷縣麻子川；甘肅宕昌大黃：宕昌縣；甘肅禮縣大黃：甘肅鑫晟源生物科技有限公司，批號(hào)：19081609；甘肅武威大黃：武威市古浪縣大靖鎮(zhèn)；安徽亳州大黃：亳州市佳旭藥業(yè)有限公司，批號(hào)：18041363。

1.2 儀器 SP-1920型雙光束紫外分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；KDM型可調(diào)溫式電熱套：山東鄄城光明儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限公司；RE-S2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；FA2004B型電子分析天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DG160C型一斤裝中藥材粉碎機(jī)：浙江省瑞安市飛達(dá)藥材器械廠；SP-756P紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司制造。

1.3 試劑 甲醇(分析純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；醋酸鎂(分析純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；三氯甲烷(分析純)：天津市耀華化學(xué)試劑有限公司；水為蒸餾水。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的配制 用大黃素作為對(duì)照品，0.5%醋酸鎂甲醇溶液作為顯色劑，精密稱定大黃素對(duì)照品20.00 mg，置25 mL容量瓶中，加0.5%醋酸鎂甲醇溶液至刻度線，然后搖勻，即得0.8 g/L的大黃素對(duì)照品溶液[4]。

2.2 供試品的制備

2.2.1 結(jié)合蒽醌供試液的制備 依據(jù)《中國(guó)藥典》的方法[1]，精密稱定大黃粉末(過四號(hào)篩)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密量取甲醇50 mL，加入到具塞錐形瓶，稱定其總重量，水浴加熱回流1 h，放冷至室溫后，稱定其重量，再用甲醇補(bǔ)足冷凝回流時(shí)被揮發(fā)掉的甲醇，搖勻后用普通濾紙過濾。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中然后揮干甲醇，加8%HCL溶液10 mL，超聲處理3 min，再加三氯甲烷10 mL，冷凝回流1 h，放冷至室溫，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，振蕩搖勻，靜置5 min，分離出三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取4次，每次6 mL，合并三氯甲烷液，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度線，搖勻，精密量取2 mL溶液，置10 mL容量瓶中，揮干三氯甲烷，加0.5%醋酸鎂甲醇溶液至刻度線，搖勻，在紫外下測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的線性方程計(jì)算其含量。

2.2.2 游離蒽醌供試液的制備 依據(jù)《中國(guó)藥典》的方法[1]，精密稱定大黃粉末(過4號(hào)篩)約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密量取甲醇50 mL，加入到具塞錐形瓶，稱定其總重量，水浴加熱回流1 h，放冷至室溫，再稱定其重量，再用甲醇補(bǔ)足冷凝回流時(shí)被揮發(fā)掉的甲醇，搖勻后用普通濾紙過濾，取續(xù)濾液2 mL，置10 mL 容量瓶中，揮干三氯甲烷，加0.5%醋酸鎂甲醇溶液至刻度線，搖勻，在紫外下測(cè)定其吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的線性方程計(jì)算其含量。

2.3 波長(zhǎng)的選擇 精密量取對(duì)照品溶液0.3 mL，置25 mL容量瓶中，加0.5%醋酸鎂甲醇溶液至刻度線，搖勻，以0.5%醋酸鎂甲醇溶液作為空白對(duì)照，依照紫外-可見分光光度法，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果表明蒽醌類成分在514 nm處有最大吸收，所以測(cè)定波長(zhǎng)選擇在514 nm處。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取大黃素對(duì)照品溶液適量，加0.5%醋酸鎂甲醇溶液制成濃度分別為1.92、6.40、9.60、12.80、16.00、19.20、22.40 mg/L的大黃素對(duì)照品溶液。以0.5%醋酸鎂甲醇溶液為空白對(duì)照，測(cè)定各溶液在514 nm波長(zhǎng)處的吸光度，并以濃度C(mg/L)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得回歸方程為：Y=0.0418X-0.0733(R2=0.9964)。結(jié)果顯示配置的大黃素對(duì)照品溶液在濃度為1.92～22.4 mg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液(12.68 mg/L)，在514 nm波長(zhǎng)處，測(cè)定其吸光度，RSD=0.25%(n=6)。說明該儀器精密度較好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱定禮縣大黃(過4號(hào)篩)兩份，每份約0.5 g，按照“2.2”項(xiàng)下方法,制備供試品，以0.5%醋酸鎂甲醇溶液作為空白對(duì)照，分別在0、20、40、60、80、100、120 min測(cè)定514 nm處的吸光度。結(jié)果為游離蒽醌的RSD為1.81%，結(jié)合蒽醌的RSD為1.86%。表明樣液在2 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 將“2.2.1”和“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液各制備6 份，以0.5%醋酸鎂甲醇溶液為空白對(duì)照，在514 nm波長(zhǎng)處平行測(cè)其吸光度，計(jì)算大黃樣品的游離蒽醌和結(jié)合蒽醌的平均含量分別為0.634%和7.28%，其RSD分別為2.90%和1.44%，則該方法重復(fù)性較好。

2.4.5 結(jié)合蒽醌加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定，禮縣大黃粉末(結(jié)合蒽醌的含量為7.28%)3份，每份約0.3 g。另精密稱定，大黃素對(duì)照品10.4、16、20 mg，將此3份對(duì)照品分別加入3份樣品中[5]，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品并測(cè)其吸光度。計(jì)算回收率。平均回收率99.44%(RSD=1.41%)。

3 樣品測(cè)定結(jié)果

取各地區(qū)大黃藥材粉末(過4號(hào)篩)各12份，每份約0.5 g。按照“2.2”項(xiàng)下供試品的制備方法，制備結(jié)合蒽醌供試液和游離蒽醌供試液各6份，分別測(cè)定其吸光度，計(jì)算蒽醌的含量，結(jié)果見表1。從結(jié)果可以看出，游離蒽醌產(chǎn)地最高的是甘肅宕昌大黃，其達(dá)到0.668%。結(jié)合蒽醌產(chǎn)地最高的是甘肅宕昌和甘肅禮縣大黃，均達(dá)到7.30%以上。

表1 不同產(chǎn)地大黃中結(jié)合蒽醌、游離蒽醌含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

本文應(yīng)用紫外-可見分光光度法對(duì)不同地區(qū)的大黃中游離蒽醌和結(jié)合蒽醌進(jìn)行含量測(cè)定。該測(cè)定方法相對(duì)來說比較成熟穩(wěn)定，且簡(jiǎn)單易行，成本低[6]。各地區(qū)大黃蒽醌類成分的含量有所不同，主要與其生長(zhǎng)的海拔、光照、年限等條件引起其蒽醌含量發(fā)生改變[7]。通過對(duì)測(cè)定結(jié)果分析總結(jié)，發(fā)現(xiàn)甘肅宕昌縣和甘肅禮縣的大黃蒽醌類成分的含量比較高，其中游離蒽醌類成分的含量高達(dá)0.668%，結(jié)合蒽醌類成分含量高達(dá)7.38%，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相符[8-9]；可以對(duì)甘肅宕昌縣和甘肅禮縣大黃進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)和利用。