王天玉，林媚，姚周麟，王鵬，平新亮，方華

（1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院浙江省柑橘研究所，浙江 臺州318026；2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州310058）

楊梅是我國著名的特色果樹[1]，栽培面積占全球的99%以上，其果實營養(yǎng)豐富，富含糖、酸和可溶性固形物等，還含有鈣、鉀、鎂、鋅、硼、銅和鐵等多種礦質(zhì)元素，深受消費者青睞。但楊梅在種植過程中會遭受多種病蟲的危害，目前主要依賴化學(xué)農(nóng)藥防治，給楊梅的質(zhì)量安全帶來了隱患[2]。乙基多殺菌素（spinetoram）作為新型的多殺菌素類生物農(nóng)藥，由放線菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）發(fā)酵產(chǎn)生[3]，系天然菌株發(fā)酵后的代謝產(chǎn)物，其原藥的有效成分是乙基多殺菌素-J（XDE-175-J）和乙基多殺菌素-L（XDE-175-L）的混合物（質(zhì)量比為3∶1），二者的生物活性之間并無顯著差異。乙基多殺菌素在我國主要登記用于十字花科蔬菜以及茄、柑橘、棉花等作物上，對鱗翅目幼蟲、薊馬、甜菜夜蛾、潛葉蠅等有較好的防治效果[4-6]；隨著其防治效果的日益顯著，防治作物也越來越廣，尤其對楊梅果蠅防治有一定的特效[7-8]。

乙基多殺菌素屬于易降解農(nóng)藥，如果使用不合理，會有農(nóng)藥殘留超標(biāo)的風(fēng)險，但目前有關(guān)乙基多殺菌素在楊梅及其土壤生態(tài)系統(tǒng)中消解動態(tài)的研究報道較少。國內(nèi)外關(guān)于乙基多殺菌素在環(huán)境中的殘留分析方法和消解殘留的研究已有不少報道[9-13]，其中分析方法有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）[11-12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10,13]，主要集中在水稻[10]以及蔬菜[13]、土壤[14]、果實[15]等環(huán)境中，如：劉賽等[15]研究了乙基多殺菌素在寧夏枸杞中的降解動態(tài)，采用乙腈提取，氯化鈉分層后，液質(zhì)聯(lián)用直接進樣，發(fā)現(xiàn)該藥在鮮枸杞和干果中的半衰期分別為3.65 和4.05 d；MALHAT[11]研究了乙基多殺菌素在番茄中的殘留情況，樣品采用含1%三乙胺的乙腈提取，N-丙基乙二胺（primary secondary amine,PSA）凈化，高效液相色譜法測定，消解動態(tài)表明，該藥的半衰期為2.62 d。

QuEChERS（快速、簡便、便宜、有效、穩(wěn)定、安全）方法是近年來一種用于農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥檢測的快速樣品前處理技術(shù)，由美國農(nóng)業(yè)部ANASTASSIADES教授等于2003 年開發(fā)；與固相萃取類似，該方法是在提取液中加入合適的吸附劑，利用吸附劑與基質(zhì)中雜質(zhì)的相互作用來吸附雜質(zhì)，從而達到除雜凈化的目的，具有成本低、環(huán)保、節(jié)省溶劑的優(yōu)點。本研究采用該方法對樣品進行前處理，選取吸附劑PSA和硫酸鎂進行凈化，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS）測定，建立了楊梅果實和土壤中乙基多殺菌素殘留量分析方法，并參考農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則的要求進行了楊梅果園中乙基多殺菌素的消解動態(tài)和最終殘留試驗，以期為該藥在楊梅或其他水果中的殘留檢測研究及在果園中的安全合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AB 4500 型超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX 公司）；MX-GX1561 勻漿機（日本松下廚房電器有限公司）；AR1502CN 電子天平（美國Ohaus 公司）；MS3 旋渦機（德國IKA 公司）；FA25 高速分散均質(zhì)機（上海弗魯克公司）；SK250KUDOS超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；AnkeTDL-40B 離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國Millipore公司）。

乙基多殺菌素（spinetoram）標(biāo)準(zhǔn)品（95.0%，德國Dr. Ehrensorfer 公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、硫酸鎂（美國Agilent 公司）；乙腈（HPLC 級）、乙酸銨（優(yōu)級純）、氯化鈉（分析純）（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；60 g/L 乙基多殺菌素懸浮劑（美國Dow AgroSciences公司）。

1.2 田間試驗

2017—2018年，分別在浙江省臺州市浙江省柑橘研究所試驗站和福建省福安市昌運種植專業(yè)合作社進行田間試驗，參照農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則方法進行設(shè)計，試驗用藥為60 g/L 乙基多殺菌素懸浮劑。這2片果園在試驗前2年均沒有施用過乙基多殺菌素。每個試驗處理小區(qū)設(shè)3 個重復(fù)，每個小區(qū)4 棵楊梅樹，另設(shè)不噴藥的對照小區(qū)，各個小區(qū)之間間隔1棵樹作為保護行，避免交叉污染。

1.2.1 楊梅果實中乙基多殺菌素的消解動態(tài)試驗

楊梅生長周期從掛果到成熟需要2個月，轉(zhuǎn)色期為20 d左右，時間較短，因此，于果實膨大期結(jié)束后開始噴藥，保證處理小區(qū)內(nèi)楊梅果實都均勻著藥，噴施1次。分別于施藥后2 h及1、2、3、5、7、10、14、21 d隨機采集果樹上、下、內(nèi)、外、向陽和背陰面生長正常且無病蟲害的果實，每個樣品的采集量不少于1 kg，去除果核，將果肉打漿后于-20 ℃冰箱中保存，待測。同時，采集未噴藥楊梅樣品作為空白對照。

1.2.2 果園土壤中乙基多殺菌素的消解動態(tài)試驗

在未使用過乙基多殺菌素的同一塊果園內(nèi)選取30 m2小區(qū)，用乙基多殺菌素噴施地面1 次，噴霧量為3 000 L/hm2。分別于施藥后2 h及1、2、3、5、7、10、14、21 d隨機取樣，設(shè)5～10個采樣點，分別采集0～10 cm 土層土壤，每次采樣量不少于1 kg，土壤鮮樣過1 mm 篩（不能過篩的土壤樣品去掉植物殘枝和石礫后保存），留樣300 g，于-20 ℃冰箱中保存，待測；同時，測試土壤鮮樣水分含量，用于校正干土殘留量，并采集未噴藥土壤樣品作為空白對照。

1.2.3 乙基多殺菌素在楊梅果實和土壤中的最終殘留試驗

設(shè)2 個施藥劑量，分別含有效成分乙基多殺菌素40和60 mg/L，各設(shè)2次和3次施藥，共4個處理，施藥間隔期為7 d，2 次施藥比3 次施藥晚7 d，各處理的最后一次施藥均于果實膨大期結(jié)束后噴施。分別在施藥結(jié)束后7、14 和21 d 采集楊梅果實和土壤樣品。楊梅果實的采集和處理按1.2.1節(jié)進行；土壤樣品采集深度為0～15 cm，其他采集方式和處理按1.2.2節(jié)進行。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理

1.3.1.1 楊梅果實

稱取果肉樣品5.00 g（精確到0.01 g）至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，勻漿1 min，然后超聲處理10 min，接著加入5 g 氯化鈉，渦旋搖勻，以4 000 r/min離心10 min后，取上清液1 mL至離心管中；加入50 mg 吸附劑PSA，渦旋1 min，以4 000 r/min 離心2 min后，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后待測。

1.3.1.2 土壤樣品

稱取土壤樣品5.00 g（精確到0.01 g）至100 mL離心管中，加入5 mL水和10 mL乙腈，渦旋2 min，然后超聲處理10 min，接著加入5 g氯化鈉，渦旋搖勻，以4 000 r/min 離心10 min 后，取上清液1 mL 至離心管中；加入50 mg吸附劑PSA，渦旋1 min，以4 000 r/min離心2 min后，取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后待測。

1.3.2 儀器檢測條件

1.3.2.1 色譜條件

Agilent C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm×1.7 μm）：柱溫30 ℃；流動相A為10 mmol/L乙酸銨，流動相B為乙腈；流速0.3 mL/min；進樣量5 μL。梯度洗脫條件：B 相在0～2.00 min 內(nèi)保持體積分?jǐn)?shù)為5%；2.00～5.00 min 內(nèi)線性增加至95%，保持2.00 min；7.00～7.10 min內(nèi)線性恢復(fù)至5%，保持2.90 min。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源，正離子模式；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式；離子源溫度500 ℃，電噴霧電壓5 500 V；窗簾氣壓275.80 kPa（40 psi）；霧化氣壓344.75 kPa（50 psi）；輔助加熱氣壓344.75 kPa（50 psi）；碰撞氣壓62.055 kPa（9 psi）；碰撞能量、去簇電壓和其他參數(shù)如表1所示。

表1 乙基多殺菌素的UPLC-MS/MS檢測參數(shù)Table 1 UPLC-MS/MS parameters for spinetoram

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用外標(biāo)法定量：稱取適量的乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，配制成10 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，再用乙腈逐級稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、0.1、0.05、0.01、0.001 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.2 節(jié)的條件進行測定，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3 次。以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。乙基多殺菌素有效成分為XDE-175-J 和XDE-175-L 的混合物（質(zhì)量比約為3∶1），峰面積用兩者之和來表示。

1.3.4 添加回收率試驗

分別稱取5.00 g楊梅果肉空白樣品和土壤空白樣品，加入乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，添加水平分別為0.005、0.05、0.5 mg/kg，按1.3.1、1.3.2和1.3.3節(jié)方法進行樣品前處理及測定，每個水平重復(fù)5次。

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS方法的線性范圍

在0.001～0.5 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，乙基多殺菌素的峰面積（y）與質(zhì)量濃度（x）之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=19 910 000x＋62 987，決定系數(shù)R2為0.999 8（R2＞0.999）。本試驗同時采用樣品空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，其與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線的斜率比為0.93，表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯，因此，對檢測樣品的試驗結(jié)果采用標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線進行分析。

2.2 QuEChERS方法的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度

取空白對照的楊梅果實和土壤進行添加回收率試驗。從表2 可知：在0.005、0.05 和0.5 mg/kg 添加水平下，楊梅果實中乙基多殺菌素的平均回收率范圍為89.40%～101.85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation, RSD）為3.63%～7.25%；土壤中乙基多殺菌素的平均回收率范圍為95.09%～102.66%，RSD為3.05%～3.61%，均符合農(nóng)藥殘留分析方法的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)要求[16-17]。乙基多殺菌素的典型圖譜如圖1所示。用本方法確定土壤和果實中乙基多殺菌素的定量限（limit of quantitation,LOQ）均為5.0×10-3mg/kg；按S/N（信噪比）=3 計算得該藥的檢測限（limit of detection, LOD）為5.2×10-5mg/kg（表3）。說明該方法具有較好的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度[10-11,13,15]。

2.3 乙基多殺菌素在楊梅果實和土壤中的消解動態(tài)

乙基多殺菌素懸浮劑按有效成分60 mg/L噴施1次，其在楊梅果實和土壤中的消解動態(tài)分別如圖2和圖3 所示。結(jié)果表明：在施藥當(dāng)天采樣，浙江、福建2 年2 地楊梅中乙基多殺菌素的原始沉積量為0.453～0.568 mg/kg；施藥2 d后，該藥在楊梅果肉中的殘留量為0.123～0.262 mg/kg，消解率超過50%；7 d后，果肉中的農(nóng)藥殘留量為0.079～0.139 mg/kg，消解率為80%左右；14 d 后，果肉中農(nóng)藥的消解率達到90%。浙江、福建2 地土壤中乙基多殺菌素的原始沉積量為0.053～0.086 mg/kg；施藥5 d后，土壤中農(nóng)藥的消解率為85%左右；施藥7 d后，其殘留量均未被檢出。

本試驗結(jié)果（表4）表明：乙基多殺菌素在楊梅和土壤中的消解動態(tài)均符合一級動力學(xué)方程ct=c0e-kt（ct為t時刻農(nóng)藥的濃度；c0為農(nóng)藥的初始濃度；k為降解速率常數(shù)；t為降解時間）。該農(nóng)藥在浙江、福建2 年2 地楊梅中的半衰期為4.4～5.2 d，土壤中的半衰期為1.2～1.9 d；根據(jù)我國農(nóng)藥在環(huán)境中的降解等級標(biāo)準(zhǔn)[16]劃分，乙基多殺菌素屬于易降解農(nóng)藥。

表2 乙基多殺菌素在楊梅果實和土壤中的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of spinetoram in red bayberry and soil

圖1 乙基多殺菌素在多反應(yīng)監(jiān)測模式下的提取離子流圖譜Fig.1 Extracted ion current chromatograms of spinetoram at multiple response monitoring modes

表3 乙基多殺菌素在樣品中的靈敏度對比Table 3 Sensitivity comparisons of spinetoram in samples

圖2 乙基多殺菌素在楊梅果實中的消解動態(tài)Fig.2 Dissipation dynamics of spinetoram in red bayberry

圖3 乙基多殺菌素在土壤中的消解動態(tài)Fig.3 Dissipation dynamics of spinetoram in soil

乙基多殺菌素作為一種具有胃毒和觸殺作用的殺蟲劑，施用后主要附著在植物體表面和土壤中，其降解速率受光照、溫度、雨水等物理化學(xué)因素影響較大[17-19]。對土壤理化指標(biāo)（表5）分析表明：浙江試驗田為黃壤土，pH 6.17，含有機質(zhì)35.1 g/kg、有效磷115 mg/kg 等；福建試驗田為紅壤土，pH 4.80，含有機質(zhì)37.4 g/kg、有效磷75 mg/kg 等。在每年的6月，福建地區(qū)溫度較浙江地區(qū)高，楊梅成熟期會提早10 d左右；同時，在楊梅成熟季節(jié)，2018年溫度較2017年高，2地楊梅都較上一年提早10 d左右成熟。因此，2 地不同的土壤pH、有機質(zhì)含量、溫度、濕度及土壤微生物數(shù)量等因素對乙基多殺菌素的降解均有影響，從而導(dǎo)致相互之間有所差異。

2.4 乙基多殺菌素在楊梅和土壤中的最終殘留量

測定結(jié)果（表6 和表7）表明：乙基多殺菌素分別采用40 和60 mg/L 劑量噴施，距末次施藥7 d 后，楊梅果實中該農(nóng)藥的最終殘留量為0.073～0.353 mg/kg，土壤中該農(nóng)藥的最終殘留量為低于定量限～0.094 mg/kg；14 d后該農(nóng)藥殘留量明顯降低，楊梅果實中的最終殘留量為0.027～0.152 mg/kg，土壤中的最終殘留量為低于定量限～0.033 mg/kg；21 d 后農(nóng)藥降解較多，并逐漸趨于穩(wěn)定的低值，楊梅果實中乙基多殺菌素的最終殘留量為0.012～0.068 mg/kg，2地土壤中該農(nóng)藥殘留均未被檢出。

表4 乙基多殺菌素在楊梅果實和土壤中的消解動態(tài)方程及半衰期Table 4 Dissipation dynamic equations and half lives of spinetoram in red bayberry and soil

表5 浙江和福建2地土壤的理化指標(biāo)Table 5 Physicochemical properties of soil from Zhejiang and Fujian

3 討論

與傳統(tǒng)的凈化檢測方法（如：劉賽等[15]用乙腈超聲提取，UPLC-MS/MS法檢測枸杞中的乙基多殺菌素，儀器的最小檢出量為2.5×10-2mg/kg，定量限為5.0×10-2mg/kg；吳瓊等[20]用乙腈、氯化鈉和氫氧化鉀溶液作為提取劑，固相萃取柱凈化，超高液相色譜法檢測土壤中乙基多殺菌素的含量，檢測限為5.0×10-2mg/kg）相比，本研究建立了乙基多殺菌素在楊梅和土壤中的QuEChERS 殘留分析方法。該方法采用乙腈或水作為提取劑，以PSA作為分散凈化劑，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）進行檢測。結(jié)果表明：在0.005～0.5 mg/kg添加水平下，乙基多殺菌素在楊梅和土壤中的平均回收率為89.40%～102.66%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.05%～7.25%，定 量 限（LOQ）均 為5.0×10-3mg/kg，檢測限（LOD）為5.2×10-5mg/kg。該方法快速、簡便、溶劑使用少、環(huán)境友好，而且靈敏度高，可滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，同時，也能為乙基多殺菌素在其他基質(zhì)中的殘留研究提供依據(jù)。

表6 乙基多殺菌素在楊梅果實中的最終殘留量Table 6 Final residue of spinetoram in red bayberry

表7 乙基多殺菌素在土壤中的最終殘留量Table 7 Final residue of spinetoram in soil

消解動態(tài)試驗結(jié)果表明：乙基多殺菌素在楊梅果實和土壤中的半衰期分別為4.4～5.2 和1.2～1.9 d，且均符合一級動力學(xué)方程，土壤中的農(nóng)藥殘留量在7 d 后均未被檢出，2 年2 地的原始沉積量均小于國標(biāo)規(guī)定的臨時限量值1 mg/kg。最終殘留試驗選用不同施藥劑量、不同施藥次數(shù)（2次和3次）進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：楊梅中乙基多殺菌素的最終殘留量在7 d 后為0.073～0.353 mg/kg，土壤中的最終殘留為低于定量限～0.094 mg/kg，14 d 后土壤中很難檢測到乙基多殺菌素的殘留，表明該藥在土壤中的降解速率遠(yuǎn)比在楊梅果實中快。與夏西亞等[9]報道的乙基多殺菌素在香蕉中的半衰期為5.6 d，花瓣中的半衰期為4.5 d，土壤中的半衰期為6.5 d的研究結(jié)果相比，乙基多殺菌素在楊梅和香蕉中的半衰期比較相近，而在楊梅園土壤中的半衰期較香蕉園土壤中短。這與植物生長的季節(jié)和位置有關(guān)：楊梅主要生長在山坡上，其成熟期剛好為南方的梅雨季節(jié)，雨水沖刷較強，有助于土壤中乙基多殺菌素的降解。與陳國等[10]報道的乙基多殺菌素在水稻田中的消解動態(tài)相比，其在水稻中的半衰期僅為1.1 d，在稻田水中的半衰期為0.35 d，在土壤中的半衰期為6.8 d，說明環(huán)境和作物對乙基多殺菌素的降解影響較大，但總體結(jié)果顯示，乙基多殺菌素消解速率較快，對自然環(huán)境影響較小，屬于易降解農(nóng)藥[21]。

目前，國家針對乙基多殺菌素的最高殘留限量（maximum residue limit, MRL）在各種作物上都是屬于臨時限量值，如：國標(biāo)規(guī)定乙基多殺菌素在楊梅中的MRL 值為1 mg/kg（臨時限量值），在桃中為0.3 mg/kg（臨時限量值），在橙中為0.07 mg/kg（臨時限量值）等[22]；FAO/WHO 規(guī)定其在番茄中的限量值為0.06 mg/kg。按農(nóng)藥資料登記要求，60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑在防治楊梅果蠅時應(yīng)在楊梅采摘前7～10 d施用，每個作物周期的最多使用次數(shù)為2次。本研究按照使用說明進行了最終殘留試驗，結(jié)果顯示，乙基多殺菌素的最終殘留量低于國標(biāo)規(guī)定的在楊梅中的臨時MRL值，表明按照使用說明用該藥防治楊梅樹上的害蟲是安全的?？傊?，該試驗結(jié)果能夠為該藥的相關(guān)登記提供數(shù)據(jù)支持，對有效評價乙基多殺菌素的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)也具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究建立了以乙腈或水作為提取劑，通過QuEChES法凈化，采用液質(zhì)聯(lián)用測定楊梅和土壤中乙基多殺菌素的殘留分析方法。乙基多殺菌素（60 g/L懸浮劑）在浙江和福建2年2地楊梅園的田間試驗結(jié)果顯示：其消解動態(tài)曲線符合一級動力學(xué)方程，該農(nóng)藥在楊梅中的半衰期為4.4～5.2 d，在土壤中的半衰期為1.2～1.9 d，屬于易降解農(nóng)藥；按照乙基多殺菌素農(nóng)藥登記時的使用方法進行田間應(yīng)用，安全間隔期7 d 后采樣，其在楊梅中的殘留量遠(yuǎn)小于MRL值（1 mg/kg臨時限量值）。