張靜，周倩，高玉時(shí)，唐修君，陸俊賢，馬麗娜，陳大偉，唐夢君

（江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州225125）

氟苯尼考（florfenicol,FF）[1]，又名氟甲砜霉素，是動(dòng)物專用氯霉素類廣譜抗菌藥物，因其吸收好、體內(nèi)分布廣、安全高效，并且無再生障礙性貧血的特點(diǎn)，被廣泛用于治療豬、禽、牛以及水產(chǎn)等養(yǎng)殖動(dòng)物的細(xì)菌性疾病[2]。然而，氟苯尼考對哺乳動(dòng)物具有胚胎毒性，人體用藥后會(huì)出現(xiàn)厭食、腹瀉等不良癥狀。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》（GB 31650—2019）中規(guī)定，氟苯尼考的最高殘留限量為肌肉中不得超過100 μg/kg，產(chǎn)蛋期家禽禁用[3]。然而，目前蛋雞生產(chǎn)中違規(guī)使用這些藥物的情況仍時(shí)有發(fā)生。研究蛋雞中氟苯尼考的殘留消除規(guī)律，可為保證蛋雞產(chǎn)品安全與有效檢測監(jiān)督提供技術(shù)依據(jù)。

氟苯尼考的殘留不僅有原形藥物，還有氟苯尼考胺（florfenicol amine,FFA）、氟苯尼考醇和一些尚不清楚的代謝物形式，但主要代謝產(chǎn)物為氟苯尼考胺，氟苯尼考和氟苯尼考胺均作為食品中氟苯尼考的標(biāo)示性殘留物。目前，國內(nèi)外對氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的串聯(lián)質(zhì)譜殘留檢測方法研究較多[4-7]，其殘留規(guī)律研究主要集中在雞和水產(chǎn)上[8-14]，但關(guān)于產(chǎn)蛋期雞蛋中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺殘留消除規(guī)律的研究較少。本試驗(yàn)在國內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)條件下，連續(xù)5 d 內(nèi)按體質(zhì)量以15 和30 mg/kg 劑量預(yù)拌料方式分別給海藍(lán)褐殼蛋雞喂藥，測定給藥期每天和停藥后不同時(shí)間氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺在全蛋、蛋黃和蛋清中的殘留量，以獲得藥物殘留消除規(guī)律，為蛋雞產(chǎn)品安全監(jiān)督提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取90 只42 周齡健康海藍(lán)褐殼蛋雞，體質(zhì)量為1.9～2.0 kg，隨機(jī)分成3組：第1組為空白對照組；第2組為預(yù)防組，飼料中按體質(zhì)量拌入15 mg/kg的氟苯尼考粉；第3 組為治療組，飼料中按體質(zhì)量拌入30 mg/kg 的氟苯尼考粉。每組30 只雞，分為5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6 只雞。飼養(yǎng)試驗(yàn)在國家家禽生產(chǎn)性能測定中心進(jìn)行，試驗(yàn)雞按每個(gè)重復(fù)進(jìn)行籠養(yǎng)，給藥前稱量，試驗(yàn)前預(yù)飼階段正常飼養(yǎng)和飲水，并保證喂藥前不飼喂氟苯尼考。

1.2 主要試劑配制與材料

氟苯尼考（FF）標(biāo)準(zhǔn)品、氟苯尼考胺（FFA）標(biāo)準(zhǔn)品和氘代氯霉素（氯霉素-D5）均購自德國Dr.Eherenstorfer公司；氟苯尼考原粉（生產(chǎn)批號(hào)170103，規(guī)格10%），購自上海同仁藥業(yè)股份有限公司上海獸藥廠；乙腈、丙酮、正己烷、甲醇均購自德國Merck公司；甲酸（＞98%）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氨水（分析純）購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；LC-Si 固相萃取柱，購自美國Supelco公司。

氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品9.998 mg于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即成0.1 mg/L 的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)液，于-20 ℃冰箱中保存。氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品9.996 mg 于100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即成0.1 mg/L的氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)液，于-20 ℃冰箱中保存。

2 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：分別量取2 mL 0.1 mg/L氟苯尼考和氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成2μg/mL的氟苯尼考和氟苯尼考胺混標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20℃冰箱中保存。

氨水-乙腈（體積比1∶19）溶液：按體積比量取氨水和乙腈，混勻備用。丙酮-正己烷（體積比1∶9）和丙酮-正己烷（體積比4∶6）溶液：按體積比量取丙酮和正己烷，混勻備用。甲醇-0.1%甲酸（體積比1∶9）水溶液：按體積比先量取甲酸和氨水配置0.1%甲酸水溶液，再按體積比量取甲醇和0.1%甲酸水溶液，混勻備用。

1.3 主要儀器

TSQ MAX 質(zhì)譜儀、ACCLEA 高效液相色譜儀（美國Thermo公司）；RZ-218A攪拌機(jī)（安徽合肥榮事達(dá)電子科技有限公司）；XS105 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；3-30K 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma 公司）；超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；VTX-3000L 渦旋儀（比利時(shí)LMS 公司）；VX-Ⅲ振蕩器（北京踏錦科技有限公司）；固相萃取裝置（美國Supelco 公司）；N-EVAP 112氮吹儀（美國Organomation公司）。

1.4 給藥劑量、方式及樣品采集

預(yù)防組和治療組蛋雞分別按體質(zhì)量以15 和30 mg/kg 劑量拌料，根據(jù)雞采食習(xí)慣采用拌料方式給藥，試驗(yàn)期間每天一次性給藥；對照組飼喂不含藥的等量飼料。每只雞日采食量150～200 g，連續(xù)飼喂5 d，分別收集給藥期和停藥后第1、2、3、5、7、10、12、15、18天的各組雞蛋，每3枚雞蛋混合成一個(gè)樣品，每組重復(fù)5個(gè)樣品。分別制備全蛋、蛋黃和蛋清樣品，于-20 ℃冰箱中保存。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 色譜條件及參數(shù)

采用美國Waters XSelectR CSHTMC18 色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）。梯度洗脫程序：0～0.5 min，流動(dòng)相A 為90%，B 為10%，保持0.5 min；0.5～4.0 min，流動(dòng)相A由90%降至10%，保持2.2 min；6.20～6.21 min，流動(dòng)相A 由10%增至90%，保持至8.0 min。流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.5.2 樣品提取與凈化

稱取試樣5.00 g（精確至0.01 g），置于50 mL離心管中，加入100 μL 100 ng/mL 氯霉素-D5 工作溶液，并用10 mL 5%氨水-乙腈溶液提取，渦旋混勻后以6 000 r/min離心5 min。將上清液移入另一50 mL離心管中。重復(fù)提取一次，合并上清液。用45 ℃氮?dú)獯蹈?，加? mL 丙酮-正己烷（體積比1∶9）溶解殘?jiān)?/p>

用5 mL 丙酮-正己烷（體積比1∶9）淋洗LC-Si固相萃取柱，棄去淋洗液，將殘?jiān)芙庖恨D(zhuǎn)移到固相萃取小柱上，棄去流出液，抽干，用5 mL丙酮-正己烷（體積比6∶4）洗脫。洗脫液用45 ℃氮?dú)獯蹈珊笾糜? mL 甲醇-0.1%甲酸（體積比1∶9）中溶解，用正己烷去脂，過0.22 μm 濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS）測定，用內(nèi)標(biāo)法定量。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

由于氟苯尼考基質(zhì)效應(yīng)影響大，因此采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行線性關(guān)系確定。參照1.5.2 節(jié)處理空白樣品后，采用甲醇-0.1%甲酸（體積比1∶9）水溶液將2μg/mL氟苯尼考和氟苯尼考胺儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為2、4、10、20、100、160、200 和400 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，采用HPLC-MS/MS分析。每個(gè)質(zhì)量濃度點(diǎn)重復(fù)測定3 次，取平均值繪制質(zhì)量濃度（x）和外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積之比（y）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。按1.5.2節(jié)的方法操作，向空白樣品中添加一定質(zhì)量濃度的氟苯尼考和氟苯尼考胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析，并逐漸降低氟苯尼考和氟苯尼考胺的質(zhì)量濃度，將樣品檢測的信噪比（signal to noise ratio,S/N）為3和10時(shí)的質(zhì)量濃度分別作為藥物在雞蛋中的檢出限和定量限。

1.5.4 樣品回收率和精密度測定

準(zhǔn)確稱取5.00 g（精確至0.01 g）空白試樣勻漿液于50 mL 離心管中，并添加不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使得空白勻漿液中FF和FFA添加量分別為1.0、2.0、5.0 μg/kg。每個(gè)添加量設(shè)6個(gè)平行，經(jīng)1.5.2節(jié)的方法提取和凈化后進(jìn)樣做HPLC-MS/MS 檢測，用內(nèi)標(biāo)法定量，計(jì)算添加回收率。分別在1周內(nèi)不同日相同時(shí)間點(diǎn)，6 次重復(fù)測定1.0、2.0、5.0 μg/kg這3 種添加水平下試樣的回收率，并求日內(nèi)和日間精密度。

1.5.5 全蛋、蛋黃和蛋清中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺殘留量的測定

將全蛋、蛋黃和蛋清中所測得的氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺色譜峰面積分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍、決定系數(shù)、定量限和檢出限

分別以氟苯尼考、氟苯尼考胺的外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積之比（y）對氟苯尼考、氟苯尼考胺的質(zhì)量濃度（x，ng/mL）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。氟苯尼考的回歸方程為y=6 234.61x＋97 068.7，決定系數(shù)R2=0.990 1；氟苯尼考胺的回歸方程為y=110 511x＋108 858，決定系數(shù)R2=0.998 6。氟苯尼考和氟苯尼考胺在2～400 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

應(yīng)用本試驗(yàn)建立的檢測方法，全蛋、蛋黃和蛋清中氟苯尼考和氟苯尼考胺的檢出限均為2 μg/kg，定量限均為5 μg/kg。結(jié)果表明，該方法靈敏度高，完全能滿足氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺在全蛋、蛋黃和蛋清中殘留檢測的需要。

2.2 樣品回收率和精密度

從表1中可知：氟苯尼考和氟苯尼考胺在添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0～5.0 μg/kg 時(shí)，平均回收率為78.9%～105.0%，日內(nèi)精密度（日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）為2.22%～4.22%，日間精密度（日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差）為4.22%～6.54%。準(zhǔn)確度和精密度能滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求[15]。

表1 氟苯尼考和氟苯尼考胺在全蛋、蛋黃和蛋清中的回收率和精密度Table 1 Recovery and precision of florfenicol(FF)and florfenicol amine(FFA)in egg,egg yolk and egg white

2.3 雞蛋中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺殘留量的測定結(jié)果

2.3.1 全蛋、蛋黃和蛋清中氟苯尼考?xì)埩袅?/p>

從表2 可以看出：各試驗(yàn)組蛋雞分別按體質(zhì)量以15和30 mg/kg的劑量預(yù)拌料方式給藥，在用藥期間（每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d），全蛋、蛋黃和蛋清中的氟苯尼考含量總體趨勢隨用藥天數(shù)的增加而增大。停藥后，15 mg/kg劑量組全蛋和蛋清中FF殘留量在停藥第1 天達(dá)到最大值，分別為341.60 和520.70 μg/kg；蛋黃在停藥第2 天達(dá)到最大值，為285.96 μg/kg；蛋清中氟苯尼考?xì)埩袅糠逯蹈哂谌昂偷包S。停藥后，30 mg/kg劑量組全蛋、蛋黃和蛋清中FF 殘留量在停藥第1 天達(dá)到最大值，分別為758.41、442.40 和797.12 μg/kg，蛋清中氟苯尼考?xì)埩袅糠逯蹈哂谌昂偷包S。在停藥期間，全蛋、蛋黃和蛋清中的氟苯尼考含量整體上隨著停藥天數(shù)的延長不斷減少，消除速度與殘留量呈正相關(guān)。不同劑量組均是蛋清中的氟苯尼考消除速度最快，在停藥第10天氟苯尼考含量已低于檢出限；蛋黃中消除速度最慢，30 mg/kg劑量組在停藥第18天氟苯尼考含量才低于檢出限。

2.3.2 全蛋、蛋黃和蛋清中氟苯尼考的代謝物氟苯尼考胺殘留量

從表3可以看出：各試驗(yàn)組蛋雞分別按體質(zhì)量以15和30 mg/kg的劑量預(yù)拌料方式給藥，在用藥期間（每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d），全蛋、蛋黃和蛋清中的氟苯尼考胺含量總體趨勢隨用藥天數(shù)的增加而增大。15 mg/kg劑量組蛋黃和蛋清中FFA殘留量在停藥第1天達(dá)到最大值，分別為218.40和87.36 μg/kg；全蛋在停藥第3天達(dá)到最大值，為78.99 μg/kg；蛋黃中的氟苯尼考胺殘留量峰值高于全蛋和蛋清。30 mg/kg劑量組全蛋和蛋清中FFA殘留量在停藥第1天達(dá)到最大值，分別為285.48、36.89 μg/kg；蛋黃在停藥第3 天達(dá)到最大值，為646.14 μg/kg；蛋黃中的氟苯尼考胺殘留量峰值高于全蛋和蛋清。在停藥期間，全蛋、蛋黃和蛋清中氟苯尼考胺的消除速度與殘留量呈正相關(guān)。不同劑量組均是蛋清的氟苯尼考胺消除速度最快，在停藥第10天氟苯尼考胺含量已低于檢出限；蛋黃中消除速度最慢，在停藥第18天氟苯尼考胺殘留值才低于檢出限。

表2 雞蛋中氟苯尼考?xì)埩袅縏able 2 Residue of FF in eggs μg/kg

2.3.3 全蛋、蛋黃和蛋清中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺總殘留量

從表4 可以看出：各試驗(yàn)組蛋雞分別按體質(zhì)量以15和30 mg/kg的劑量預(yù)拌料方式給藥，在用藥期間（每天給藥1次，連續(xù)給藥5 d），全蛋、蛋黃和蛋清中的氟苯尼考與氟苯尼考胺總殘留量總體趨勢隨用藥天數(shù)的增加而增大。15 mg/kg 組全蛋、蛋黃和蛋清中FF與FFA總殘留量在停藥第1天達(dá)到最大值，分別為391.25、500.29 和608.06 μg/kg，蛋清中的總殘留量峰值高于全蛋和蛋黃；30 mg/kg組全蛋和蛋清中FF與FFA總殘留量在停藥第1天達(dá)到最大值，分別為1 043.89 和834.01 μg/kg，蛋黃在停藥第3 天達(dá)到最大值，為1 073.91 μg/kg，蛋黃中總殘留量峰值高于全蛋和蛋清。在停藥期間，全蛋、蛋黃、蛋清中的氟苯尼考和氟苯尼考胺總殘留量整體上隨著停藥天數(shù)的延長不斷減少，消除速度與殘留量呈正相關(guān)。不同劑量組均是蛋清中氟苯尼考與氟苯尼考胺總殘留消除速度最快，在停藥第10天氟苯尼考和氟苯尼考胺總殘留量已低于檢出限；蛋黃中氟苯尼考與氟苯尼考胺消除速度最慢，在停藥第18天氟苯尼考和氟苯尼考胺總殘留量才低于檢出限。

3 討論

3.1 色譜操作條件的影響

試驗(yàn)中比較了不同流動(dòng)相對分離度、峰形、靈敏度等的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：水相的酸堿度對氟苯尼考和氟苯尼考胺的分離影響不大，對質(zhì)譜響應(yīng)值也無明顯影響，而有機(jī)相用乙腈比用甲醇時(shí)氟苯尼考和氟苯尼考胺峰形更好。利用梯度洗脫的方法，分離效果更好，因此，本試驗(yàn)采用水-乙腈作為流動(dòng)相體系。此外，本試驗(yàn)所使用的Waters XSelectR

CSHTMC18 色譜柱區(qū)別于普通C18 色譜柱，其表面帶電雜化顆粒，能使極性化合物氟苯尼考胺保留較好，出峰時(shí)間穩(wěn)定。由此可見，該色譜操作條件的選擇是較為理想的。

表3 雞蛋中氟苯尼考胺殘留量Table 3 Residue of FFA in eggs μg/kg

表4 雞蛋中氟苯尼考與氟苯尼考胺的總殘留量Table 4 Total residues of FF and FFA in eggs μg/kg

3.2 樣品提取與凈化的影響

常用的氟苯尼考提取劑主要有堿化的乙酸乙酯、乙腈以及一些混合提取劑。本研究分別采用乙腈和堿化的乙酸乙酯作為提取劑，進(jìn)行對比試驗(yàn)。結(jié)果表明：采用堿化的乙酸乙酯作為提取劑時(shí)，會(huì)引入油脂等雜質(zhì)，不利于后續(xù)的凈化，而且回收率偏低；而采用堿化的乙腈作為提取劑時(shí)，提取液較干凈，方便快速，且不用制備提取劑，現(xiàn)買現(xiàn)用。

采用固相萃取法進(jìn)行凈化濃縮試驗(yàn)，并比較LC-Si小柱和C18小柱凈化效果。結(jié)果表明：LC-Si小柱的凈化效果更好，回收率更高。同時(shí)，也比較了經(jīng)提取后直接采取正己烷除脂的方法，發(fā)現(xiàn)樣品不夠清澈，有較多油脂，特別是全蛋樣品，且對儀器損傷很大。

3.3 氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺在雞蛋中的殘留消除規(guī)律

不同劑量組中氟苯尼考?xì)埩舻南?guī)律基本一致，殘留量與喂藥劑量呈正相關(guān)，蛋清中殘留的氟苯尼考消除較快，蛋黃中殘留的氟苯尼考消除時(shí)間較長，這可能與氟苯尼考的親脂性有很大關(guān)系。氟苯尼考胺殘留消除規(guī)律與氟苯尼考?xì)埩粝?guī)律基本一致，即殘留量與喂藥劑量呈正相關(guān)，氟苯尼考胺首先在蛋黃中被檢測到，提示氟苯尼考可能首先在蛋黃中殘留，其中蛋黃中的含量高于全蛋和蛋清，其在蛋黃中的殘留時(shí)間最長，這可能與氟苯尼考胺的親脂結(jié)構(gòu)有關(guān)。

同一劑量組中，蛋黃中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量及殘留消除速率接近，表明蛋黃中氟苯尼考以原型和代謝物2 種形式殘留；而在同一劑量組蛋清中氟苯尼考?xì)埩袅窟h(yuǎn)高于氟苯尼考胺，提示蛋清中氟苯尼考主要以原型代謝。根據(jù)藥物殘留量及消除速率，建議雞蛋中以氟苯尼考和氟苯尼考胺總殘留量為氟苯尼考?xì)埩魳?biāo)志物指示值。

4 結(jié)論

氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量及其總殘留量與喂藥劑量呈正相關(guān)，氟苯尼考在蛋清中殘留消除較快，其殘留量高于蛋黃，而氟苯尼考胺主要存在于蛋黃中。蛋黃中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留時(shí)間長。不同劑量組蛋黃中氟苯尼考?xì)埩魰r(shí)間達(dá)18 d。