李燕霞，王 琳，姚弘毅

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院康復(fù)科,湖北 武漢 430000)

關(guān)節(jié)是骨與骨連接的部分，軟骨可以減少骨摩擦，隨著年齡的增加，累積性運動損傷等炎癥反應(yīng)會加重膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)產(chǎn)生[1]。有研究表明，中老年人群均會出現(xiàn)不同程度的骨關(guān)節(jié)疾病，其中OA的發(fā)生率約為4%，與老齡化程度呈正相關(guān)[2]。OA患者關(guān)節(jié)疼痛及腫脹等與關(guān)節(jié)周邊肌肉控制能力不足、柔韌功能減退等有關(guān)。目前，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，探討OA的發(fā)病機(jī)制及防治方案已經(jīng)成為學(xué)術(shù)界研究的熱點。

羥基紅花黃色素A(hydroxy safflower yellow A，HSYA)是從紅花中提取的活性制劑，具備紅花的藥理活性。以往研究表明，HSYA同時對心肌缺血和缺血腦組織等有保護(hù)作用[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是由鈣離子及鋅離子組成的大家族，以降解細(xì)胞外間質(zhì)而被熟知，在OA等多種病理生理中發(fā)揮作用，其中MMP-3是該家族的重要成員。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)屬于多功能蛋白質(zhì)，對細(xì)胞生物活性及機(jī)體免疫具有調(diào)節(jié)作用[4]。Notch信號廣泛存在于成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中，間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程主要受Notch1信號通路的影響，因此，Notch1信號在骨生長中起重要作用。目前，有研究證實HSYA能一定程度上促進(jìn)OA修復(fù)，但其作用機(jī)制尚不明確，因此，為了探究HSYA對OA大鼠血清中炎性因子的影響及其作用機(jī)制，本研究通過建立OA大鼠模型，以分析HSYA對大鼠膝關(guān)節(jié)及MMP-3、TGF-β1、Notch1水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

25只SPF級SD大鼠(中國上?；鶢栴D生物)，MMP-3抗體(USA,Abcam)，TGF-β1抗體(中國上海滬崢生物)，Notch1抗體(中國上海士峰生物)，生化實驗電泳蛋白儀(中國上海知信)，蘇木精—伊紅試劑盒(中國上海江萊)。

1.2 HSYA溶液配制

HSYA(中國上海源葉生物科技，批號：Z01010BA13，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)配制成100 mg/mL，用無血清DMEM/F12 (25 mL)培養(yǎng)液溶解，儲存濃度為1.28 mM，0.22 μm濾膜過濾除菌后于4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ煤?0% FBS的DMEM/F12倍比稀釋成為所需終濃度的培養(yǎng)液。

1.3 分組及OA大鼠建模

將25只大鼠隨機(jī)分為正常組、OA組、低HSYA組、中HSYA組和高HSYA組，每組5只。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨后OA組、低HSYA組、中HSYA組和高HSYA組大鼠依據(jù)文獻(xiàn)[5]建立OA大鼠模型，即在大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)注射4%木瓜蛋白酶溶液與0.03 mol/L L-半胱氨酸溶液混合液20 μL，7 d后OA模型建立成功。低HSYA組、中HSYA組和高HSYA組大鼠分別在尾部注射濃度為2.5、5.0、10.0 mg/kg的HSYA，HSYA濃度參考文獻(xiàn)[6]，OA組和正常組大鼠分別注射100 mg/kg生理鹽水，每周1次，共5次。

1.4 ELISA檢測血清中IL-1β和TNF-α含量

末次尾部注射后，抽取每組大鼠尾靜脈血，4 000 r/min離心，取上清液置入EP管中，低溫保存?zhèn)溆?。采用ELISA酶法在全自動生化儀器上測定患者IL-1β和TNF-α表達(dá)水平。順序加入HRP標(biāo)記的CEA，結(jié)合成抗體后，多次洗滌，TMB顯色，呈現(xiàn)藍(lán)色，在酸的作用下，最終呈現(xiàn)黃色，于450 nm波長下的酶標(biāo)儀檢測OD值，實驗過程嚴(yán)格按操作說明書實驗步驟進(jìn)行。

1.5 Pelletier評分評估大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷

末次注射及尾部采血結(jié)束后，大鼠行頸部脫臼法安樂死，取右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，觀察股骨髁和脛骨平臺關(guān)節(jié)面平整度，采用Pelletier評分評估膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面軟骨損傷，分?jǐn)?shù)越高表示軟骨損傷越嚴(yán)重[6]。

1.6 大鼠組織病理形態(tài)觀察及Mankin評分

取各組大鼠股骨內(nèi)髁關(guān)節(jié)面，甲醛固定24 h，經(jīng)脫鈣、常規(guī)脫水機(jī)切片處理后進(jìn)行HE染色[7]，200倍倒置顯微鏡下觀察病理情況。采用Mankin評分對每組大鼠軟骨和滑膜組織進(jìn)行評估，分?jǐn)?shù)越高表示損傷越嚴(yán)重。

1.7 免疫組化檢測MMP-3陽性表達(dá)

各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織脫水、包埋后，采用甲醛固定，水化后37.5 ℃靜置0.5 h，加入1%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)液，山羊血清封閉。加入1抗(1∶500)、MMP-3抗體，加入二抗0.5 h后，復(fù)染，封皮。選擇不交叉的10個視野，以淡黃色至棕褐色為陽性，計算陽性率。

1.8 Western blot檢測TGF-β1、Notch1的蛋白水平

各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織加入裂解液，于4 ℃離心0.5 h。用PIERCE檢測總蛋白濃度。SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，隨后加入TGF-β1、Notch1和GAPDH抗體，于4 ℃一抗孵育24 h，PBS洗滌后進(jìn)行辣根過氧化物酶共軛二抗處理1 h，冷卻后計算TGF-β1、Notch1蛋白水平，用Nuance分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，化學(xué)發(fā)光試劑顯影曝光，拍照保存。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平比較

OA組血清中IL-1β、TNF-α水平均高于其余各組(P<0.05)，高HSYA組IL-1β、TNF-α水平低于低HSYA組及中HSYA組(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠血清中相關(guān)因子水平比較

2.2 大鼠Pelletier評分比較

OA組、低HSYA組、中HSYA組、高HSYA組及正常組大鼠Pelletier評分依次降低，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.770，P<0.05)，見圖1。

2.3 大鼠組織病理學(xué)觀察及Mankin評分比較

病理觀察結(jié)果顯示：正常組軟骨結(jié)構(gòu)清晰、完整，組織間隙無水腫及炎癥浸潤；OA組軟骨結(jié)構(gòu)混亂且不完整，組織間隙嚴(yán)重肥大，炎癥浸潤顯著；低HSYA組、中HSYA組、高HSYA組關(guān)節(jié)軟骨排列較整齊，少量炎癥浸潤，與OA組相比均有一定改善，見圖2。OA組軟骨和滑膜組織Mankin評分高于其余各組(P<0.05)，高HSYA組Mankin評分低于低HSYA組和中HSYA組(P<0.05)，見表2。

*：與正常組相比，P<0.05；#：與OA組相比，P<0.05；△：與低HSYA組相比，P<0.05；▲：與中HSYA組相比，P<0.05

圖2 大鼠組織病理學(xué)觀察

表2 大鼠軟骨和滑膜組織Mankin評分比較分)

2.4 大鼠膝關(guān)節(jié)組織MMP-3陽性細(xì)胞率比較

MMP-3在膝關(guān)節(jié)組織陽性表達(dá)呈現(xiàn)棕黃色，OA組MMP-3在細(xì)胞漿中陽性表達(dá)明顯，主要在炎性肉芽腫內(nèi)的組織細(xì)胞及少量的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)(圖3)。低HSYA組、中HSYA組、高HSYA組中MMP-3陽性表達(dá)逐漸減少，炎癥浸潤降低。OA組、低HSYA組、中HSYA組、高HSYA組、正常組大鼠關(guān)節(jié)組織MMP-3陽性細(xì)胞率依次降低，各組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=240.200,P<0.05)，見圖4。

圖3 大鼠膝關(guān)節(jié)組織中MMP-3表達(dá)

*：與正常組相比，P<0.05；#：與OA組相比，P<0.05；△：與低HSYA組相比，P<0.05；▲：與中HSYA組相比，P<0.05

2.5 大鼠TGF-β1、Notch1蛋白水平比較

正常組大鼠膝關(guān)節(jié)組織TGF-β1蛋白水平高于OA組、低HSYA組、中HSYA組、高HSYA組(P<0.05)，低HSYA組、中HSYA組、高HSYA組TGF-β1蛋白水平較OA組高(F=112.400,P<0.05)；正常組大鼠膝關(guān)節(jié)組織Notch1蛋白水平低于OA組、低HSYA組、中HSYA組、高HSYA組(P<0.05)，低HSYA組、中HSYA組、高HSYA組Notch1蛋白水平較OA組低(F=68.680,P<0.05)，見圖5。

*：與正常組比較，P<0.05；#：與OA組比較，P<0.05；Δ：與低HSYA組比較，P<0.05；▲：與中HSYA組相比，P<0.05

3 討論

研究表明，OA患者骨關(guān)節(jié)受到損傷時，會導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)液的吸收和釋放功能紊亂，軟骨組織內(nèi)營養(yǎng)供給不足，軟骨中的有害物質(zhì)不能及時排除，進(jìn)而使軟骨損傷不斷加劇[6]。目前，OA的臨床治療存在多樣性，其中中藥的生物活性在多種疾病中均發(fā)揮重要作用。紅花的藥理活性廣泛，HSYA是從紅花中提取的活性物質(zhì)，具有抗血小板聚集、抗自由基及抗炎等特點。

IL-1β經(jīng)多種細(xì)胞刺激后產(chǎn)生，其表達(dá)水平與OA的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，IL-1β會導(dǎo)致OA患者關(guān)節(jié)軟骨炎癥加重。前列腺素E2屬于疼痛因子，其表達(dá)升高表示機(jī)體疼痛程度增加。TNF-α可促使機(jī)體血清中炎癥介質(zhì)白介素-6水平升高，導(dǎo)致軟骨分泌的前列腺素E2升高，增加軟骨破壞性[8]。HSYA是由多個酚羥基組成的化合物，具有活血、抗炎及止痛作用，能夠有效調(diào)節(jié)炎癥NF-κB信號，降低自由基水平，改善炎癥浸潤[9]。Wang等[10]研究表明，HSYA能夠降低OA患者血清中IL-1β、TNF-α水平，有利于減少關(guān)節(jié)軟骨退變。本研究結(jié)果顯示，HSYA能夠降低OA大鼠血清中IL-1β、TNF-α水平，且呈劑量依賴性，說明高劑量HSYA具有較強(qiáng)的抑制IL-1β和TNF-α因子的能力，這與牛凱等[11]的研究結(jié)果相似。

本研究對OA大鼠注射不同劑量HSYA后發(fā)現(xiàn)，Pelletier評分均降低，且劑量越高評分越低，提示不同劑量的HSYA對OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨及組織病理均有改善作用，且呈濃度依賴性。注射HSYA后能加快骨增生，減少軟骨層缺損。顧超蘭等[12]的研究表明，HSYA能夠降低IL-1β水平，從而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨組織，減少關(guān)節(jié)退變發(fā)生，本研究結(jié)果與之相似。

研究表明，MMP是導(dǎo)致OA發(fā)生病理改變的關(guān)鍵，其作用機(jī)制是加深OA患者膠原網(wǎng)破壞程度，增加軟骨暴露及炎癥因子刺激，促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白降解，從而加重病情[13]。有研究認(rèn)為，HSYA能夠通過提高Ⅱ型膠原蛋白水平，抑制MMP-3表達(dá)，平衡軟骨細(xì)胞代謝，從而減少軟骨降解，保護(hù)骨組織[14]。本研究結(jié)果表明，HSYA能夠降低膝關(guān)節(jié)組織中MMP-3陽性表達(dá)，且呈濃度依賴性，與王君等[15]的研究結(jié)果相似。

Notch是一種進(jìn)化上高度保守的信號通路，能夠通過調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞而影響器官發(fā)育。有研究表示，Notch1在OA大鼠關(guān)節(jié)軟骨中水平較高，可影響軟骨的發(fā)育和生長，導(dǎo)致骨細(xì)胞平衡紊亂[16]。TGF-β1是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的β超家族，其信號傳導(dǎo)作用需要結(jié)合Smad完成。TGF-β1水平升高往往與自身免疫等有關(guān)[17]。TGF-β1在正常人群中表達(dá)相對穩(wěn)定，而在OA患者體內(nèi)表達(dá)異常，這與關(guān)節(jié)損傷后軟骨啟動自我修復(fù)相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，HSYA能夠降低Notch1表達(dá)水平，減少炎癥反應(yīng)，同時，HSYA能通過提高TGF-β1水平從而加快軟骨細(xì)胞分化，提高軟骨修復(fù)能力，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果相似[19-20]，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，OA大鼠尾部注射HSYA能夠降低血清炎性因子IL-1β、TNF-α水平，緩解滑膜組織損傷，且呈濃度依賴性，其作用機(jī)制與抑制MMP-3、Notch1表達(dá)，提高TGF-β1水平相關(guān)。