汪冬艷，張靜靜

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院普外科，江蘇 南京 210029；2南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇省中西醫(yī)結合醫(yī)院普外科，江蘇 南京 210028

轉錄因子YY1是鋅指蛋白家族中的一員，參與了許多生物學和生理過程，包括胚胎發(fā)生、細胞增殖、DNA復制和分化等［1-3］。本課題組先前研究表明YY1 在胰腺癌中具有抑癌作用［4-5］。染色質免疫共沉淀? 測序（chromatin immunoprecipitation high ?throughput sequencing，ChIP?seq）結果表明YY1可以直接與長鏈非編碼RNA SOX2OT的啟動子區(qū)結合［6］，表明YY1 可能調控SOX2OT 的轉錄，SOX2OT 可能參與胰腺癌的發(fā)生和進展。本研究以人胰腺癌細胞株BXPC?3 和PANC?1 為研究對象，探討YY1/SOX2OT 軸在胰腺癌細胞遷移和侵襲中的作用，為YY1作為胰腺癌早期診斷、預后及治療的靶標提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

人胰腺癌細胞株BXPC?3 和PANC?1 購于上海細胞所；YY1過表達及YY1干擾的穩(wěn)轉細胞株由本實驗室構建及保存［4］；PBS、胰酶、DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（Wisent 公司，加拿大）；雙抗（青、鏈霉素）、RIPA 細胞裂解液、PMSF、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、GAPDH 抗體、二抗（上海碧云天）；TRIzol、Lipofectamine 3000 轉染試劑（Invitrogen 公司，美國）；反轉錄試劑盒、SYBR green master mix、蛋白Marker（Bio?Rad公司，美國）；PVDF膜、ECL試劑盒、Transwell 小室（Millipore 公司，美國）；Matrigel 基質膠（BD公司，美國）；細胞培養(yǎng)耗材（Corning公司，美國）；YY1抗體（Abcam公司，美國）；其他常用試劑均為國產分析純；引物由上海吉瑪設計合成；siRNA片段由廣州銳博設計合成；定量PCR 儀為美國ABI Stepone plus 型號；倒置熒光顯微鏡為美國Nikon Ti?E 型；成像分析系統為美國Protein simple Fluo?rchem 型。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

BXPC?3 和PANC?1 細胞使用含10%胎牛血清、50 U/mL青霉素和50 mg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，待細胞融合率為70%左右時，以0.25%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸消化、傳代。

1.2.2 定量RT?PCR

使用TRIzol試劑抽提細胞總RNA。分光光度法測定濃度后，根據說明，使用1 μg 總RNA 和iscript cDNA 合成試劑盒在20 μL 的最終體積中進行逆轉錄（RT）。采用SYBR green master mix 在定量PCR儀中進行定量PCR。采用2-ΔCt法，即用YY1/SOX2OT（靶基因）的Ct 值減去GAPDH（內參基因）的Ct值，計算相對基因表達量。每一個定量PCR均設置3 個復孔，獨立重復3 次。YY1 上游引物：5′?CTTTTCACTGGACTTCAATTTGCG?3′；下游引物：5′?CACTGGTTGTTTTTGGCCTTAGC?3′；SOX2OT 上游引物：5′?AGACAGCTCTGTTCAGTATT?3′；下游引物：5′?TTACACCAGCCTCCAAGA?3′；GAPDH 上游引物：5′?ACGGGAAGCTTGTCATCAAT?3′；下游引物：5′?TGGACTCCACGACGTACTCA?3′。

1.2.3 Western blot

使用RIPA 細胞裂解液抽提細胞總蛋白，并用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定濃度。蛋白加1 ×SDS 上樣緩沖液后于100 ℃水浴5 min，取20 μg 進行SDS?PAGE 電泳，而后把蛋白質轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000 一抗，4 ℃過夜，TBST 洗滌3 次，加二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，TBST洗3次，然后用ECL化學發(fā)光試劑于暗室自顯影。用成像分析系統拍照記錄并進行灰度分析。

1.2.4 細胞劃痕實驗

先用記號筆在6 孔板背面劃橫線，每隔0.5～1.0 cm一道，橫穿過孔；每孔至少穿過5條線。在孔中加入5×105個細胞。第2 天用槍頭垂至于背后的橫線劃痕。PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0 h、24 h時間點取樣，拍照。

1.2.5 Transwell細胞侵襲實驗

將Matrigel 1∶8稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37 ℃30 min，使Matrigel 聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。細胞撤血清饑餓12 h后，消化細胞，調整細胞密度至5×105個/mL，取細胞懸液100 μL 加入Transwell 小室。24 孔板下室加入600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。隨后取出Transwell 小室，棄去孔中培養(yǎng)液，PBS洗2遍，甲醇固定30 min，將小室適當風干。0.1%結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未侵入細胞，用PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨機5個視野觀察細胞，記數。

1.2.6 SOX2OT過表達慢病毒及穩(wěn)轉細胞株構建

SOX2OT過表達慢病毒及其對照病毒由上海和元公司構建。將全長人SOX2OT 亞克隆入pLenti?CMV?MCS?3FLAG H155載體，測序驗證。YY1過表達BXPC?3細胞（BXPC?3?YY1）感染SOX2OT過表達慢病毒或對照慢病毒。6～8 h 后換液并在熒光顯微鏡下觀察熒光，批量擴增培養(yǎng)后用嘌呤霉素進行細胞篩選，加藥濃度由低到高，直至細胞正常培養(yǎng)狀態(tài)，篩選出穩(wěn)轉細胞株（BXPC?3?YY1?SOX2OT 和BXPC?3?YY1?Vector）。定量RT?PCR 證實SOX2OT表達。

1.2.7 SOX2OT siRNA干擾片段轉染及篩選

轉染前1 d 鋪6 孔板（每孔3×105個細胞），長至50%～70%進行轉染；Lipofectamine 3000 法體系（每孔）如下：分別以裸培125 μL+siRNA 5 μL，裸培125 μL+Lipofectamine 3000 5 μL兩個預混液，各自充分混勻，靜置5 min；將兩者混合后再次靜置15 min，加入換了新鮮完全培養(yǎng)基的6 孔板中；轉染24 h 后換液，2～3 d后提取RNA用定量RT?PCR進行轉染效率驗證。3組SOX2OT干擾片段靶序列如下：siRNA?1 5′?CAAAATAGGTCATAGCAA?3′、siRNA?2 5′?GGA?CAAG?ACAACATTTGGT?3′、siRNA?3 5′?CTCAC?CAATGCTTTAT?TCT?3′。

1.3 統計學方法

采用SPSS15.0進行統計分析。定量數據顯示為平均值±標準差（）。兩組數據比較采用t檢驗。多組數據比較采用ANOVA?SNK檢驗。所有的統計檢驗都是雙尾檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 YY1對胰腺癌細胞中SOX2OT表達的調控

定量PCR及Western blot結果表明：YY1過表達及YY1干擾的穩(wěn)轉細胞株（BXPC?3和PANC?1）構建成功。定量PCR 結果顯示：與對照組相比，YY1 過表達組的BXPC?3和PANC?1細胞中SOX2OT表達水平被顯著抑制（P＜0.05，圖1），相反，YY1 干擾組SOX2OT 表達水平與對照組相比顯著增加（P＜0.05，圖1）。

2.2 YY1對胰腺癌細胞遷移與侵襲能力的影響

細胞劃痕實驗結果表明：與對照組相比，YY1過表達抑制BXPC?3 細胞的遷移，相反YY1 干擾促進細胞的遷移（圖2A）。Transwell 細胞侵襲實驗結果表明：與對照組相比，YY1 過表達組穿過基質膠的細胞數顯著減少（P＜0.05，圖2B），相反YY1干擾組穿過基質膠的細胞數與對照組相比顯著增加（P＜0.05，圖2B）。

2.3 SOX2OT對YY1的功能回復作用

為了證明SOX2OT是否介導了YY1抑制胰腺癌細胞遷移和侵襲的作用，在YY1 過表達的BXPC?3細胞中過表達SOX2OT，或在YY1敲低的BXPC?3細胞中干擾SOX2OT 的表達，觀察其是否具有功能回復作用。定量PCR 結果表明：過表達SOX2OT 穩(wěn)轉細胞株構建成功（圖3A）；3 組SOX2OT 干擾片段中siRNA?1 的干擾效率最高（圖3B），因此后續(xù)功能回復實驗選擇siRNA?1。細胞劃痕實驗結果表明：在YY1過表達的BXPC?3細胞中過表達SOX2OT，可以逆轉過表達YY1 抑制細胞遷移的作用（圖3C）；在YY1敲低的BXPC?3細胞中干擾SOX2OT的表達，可以逆轉YY1 敲低促進細胞遷移的作用（圖3D）。Transwell 細胞侵襲實驗結果表明：在YY1過表達的BXPC?3 細胞中過表達SOX2OT，可以逆轉過表達YY1 抑制細胞侵襲的作用（圖4A）；在YY1 敲低的BXPC?3細胞中干擾SOX2OT的表達，可以逆轉YY1敲低促進細胞侵襲的作用（圖4B）。

圖1 定量PCR及Western blot檢測YY1過表達或干擾后胰腺癌細胞BXPC?3和PANC?1中YY1及SOX2OT mRNAFigure 1 qRT?PCR and Western blot analyzed of YY1 and SOX2OT mRNA and protein expression in BXPC?3 and PANC?1 pancreatic cancer cells with YY1 overexpressing or knockdown

圖2 YY1過表達或干擾對BXPC?3細胞遷移和侵襲能力的影響Figure 2 Effects of YY1 overexpression or interference on migration and invasion of BXPC?3 cells

3 討論

在本研究中發(fā)現YY1過表達抑制，而YY1干擾促進胰腺癌細胞中長鏈非編碼RNA SOX2OT 的表達；YY1 過表達抑制、而YY1 干擾促進胰腺癌細胞的遷移和侵襲。功能回復實驗結果表明：在YY1過表達的胰腺癌細胞中過表達SOX2OT，或者在YY1敲低的細胞中干擾SOX2OT的表達，可以逆轉YY對胰腺癌細胞遷移和侵襲的作用，YY1 通過下調SOX2OT表達抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲。

YY1 對腫瘤的促進或抑制作用與其參與癌基因、抑癌基因、血管生成相關因子和抗細胞凋亡途徑密切相關［7］。一方面，YY1 可以通過上調癌基因（如c?myc和血管內皮生長因子）的表達，下調抑癌基因（如P53 和E?cadherin）的表達發(fā)揮促癌作用［8-11］。另一方面，YY1 可以通過上調抑癌基因（如HLJ1 與BRCA1）發(fā)揮抑癌作用，并通過直接作用抑制癌基因c?myc的功能［12-14］。因此，YY1可以作為一種抑癌基因或癌基因，這取決于組織類型、與其相互作用的蛋白因子及下游靶基因。本課題組先前研究表明YY1 在胰腺癌中具有抑癌作用［4-5］。ChIP?seq 結果表明YY1 可以直接與SOX2OT 的啟動子區(qū)結合，提示YY1 可能調控SOX2OT 的轉錄，SOX2OT 可能參與胰腺癌的癌變和進展。

圖3 細胞劃痕實驗檢測SOX2OT過表達或SOX2OT干擾對YY1的功能恢復的作用Figure 3 Effects of SOX2OT overexpression or interference on YY1 functional recovery by wound healing assay

圖4 Transwell細胞侵襲實驗檢測SOX2OT過表達（A）或SOX2OT干擾（B）對YY1抑制胰腺癌細胞BXPC?3侵襲的影響（×100）Figure 4 Effect of SOX2OT overexpression（A）or interference（B）on cell invasion inhibited by YY1 in BXPC?3 cells by transwell cell invasion assay（×100）

SOX2OT 的內含子區(qū)包含了干細胞調控因子SOX2 基因。SOX2 是SOX 轉錄因子家族中的一個主要成員，表達于胚胎干細胞，在胚胎的各個發(fā)育過程中起重要作用，是誘導人成體細胞為多能干細胞的一個關鍵和必需的因子［15］。干細胞和腫瘤都具有自我更新等共同特性，在干細胞起關鍵作用的基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也起一定作用。SOX2OT基因定位于3號染色體3q26.3［16］，其確切功能還不清楚。然而，最近研究已經證明了它對SOX2 基因的轉錄調控作用［17］。類似于SOX2，SOX2OT 在胚胎干細胞中高表達，在誘導分化過程中表達降低，僅表達于正常成年小鼠和人類的大腦組織［18］。SOX2OT 在胰腺癌中的表達模式和生物學作用尚不清楚。本研究發(fā)現的幾項證據表明SOX2OT 可能是胰腺癌中的一個促癌因子。首先，YY1 在胰腺癌中具有抑癌作用，而YY1 負性調節(jié)SOX2OT 的表達；其次，SOX2OT 的過表達可以逆轉YY1 過表達對胰腺癌細胞遷移和侵襲的作用。

總之，YY1 負調控胰腺癌細胞中SOX2OT 的表達。YY1通過下調SOX2OT的表達抑制胰腺癌細胞的遷移和侵襲。盡管其他尚未發(fā)現的機制可能與YY1 介導的抑癌作用有關，但本研究提示SOX2OT在胰腺癌中起到促癌作用。YY1/SOX2OT軸可能是胰腺癌的一個有價值的診斷和預后指標。