王 娟，吳 濤，何 斌，王伯堯，魏新程，范 磊*

1南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院超聲科，2骨科，江蘇 南京 210011

骨肉瘤是原發(fā)性骨腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其惡性程度甚高，預后極差，具有易侵襲轉(zhuǎn)移、易耐藥等生物學特性，即使采用手術(shù)聯(lián)合化療的治療方案，患者5 年生存率也僅為50%～60%，隨著基因治療等生物治療技術(shù)的發(fā)展，骨肉瘤綜合治療有了新進展。而進一步提高骨肉瘤化療的敏感性、探究骨肉瘤的分子調(diào)控機制并制定新的靶向治療策略是骨肉瘤診治的關鍵［1-2］。環(huán)狀RNA（circRNA）最早在RNA病毒中被發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)證實在哺乳動物的細胞質(zhì)中大量存在，具有特異性強、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、表達豐度高等特點，可以參與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因的表達調(diào)控，在多種疾病和病理生理過程中具有重要的調(diào)控作用［3-4］。目前研究表明，circRNA 可作為競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）發(fā)揮基因表達調(diào)控作用，即circRNA擁有miRNA 應答元件（miRNA response element，MRE），可結(jié)合miRNA 阻斷后者對靶RNA 的抑制作用，從而調(diào)控miRNA 靶基因的表達水平，在胞漿內(nèi)發(fā)揮了miRNA“海綿”功能，與很多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療有著密切關系［5-6］。本團隊一直致力于研究circRNA對于骨肉瘤的影響，發(fā)現(xiàn)circ_0001246在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，已通過實驗證實circ_0001246 在骨肉瘤組織和細胞中的表達上調(diào)，起到癌基因的作用［7-8］，然而其對骨肉瘤化療的影響及具體機制還未有相關文獻報道。本研究通過體外實驗探討了circ_0001246調(diào)節(jié)miRNA30a、影響骨肉瘤化療敏感性的相關分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人骨肉瘤細胞株MG63 和U2OS 由華中科技大學同濟醫(yī)院骨科實驗室提供。正常成骨細胞株OB3購于武漢細胞模式培養(yǎng)中心。MG63 和U2OS 細胞系在RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)（南京KeyGEN 公司），并加入10%胎牛血清（Gibco 公司，美國）。在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

TaqMan miRNA 分離試劑盒、TaqMan miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan miRNA 分析試劑盒和TaqMan通用PCR master mix（Applied Biosystems 公司，美國）；miRNA30a模擬物、陰性對照（NC）和FAM標記的NC（上海Gima公司）；circ_0001246 siRNA、siRNA陰性對照（NC）和FAM 標記的siRNA NC（南京Key?GEN 公司）；熒光原位雜交試劑盒（廣州RiboBio 公司）；pMIR?Report載體（Ambion公司，美國）；限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和HindⅢ（大連TaKaRa 公司）。Dual?Glo 熒光素酶檢測試劑盒（Promega 公司，美國）；脂質(zhì)體3000 和TRIzol（Invitrogen 公司，美國）；MTT 試劑盒（Sigma 公司，美國）；Annexin V?FITC/7AAD 凋亡雙染色試劑盒（南京KeyGEN 公司）。依托泊苷（etoposide?VP16）由南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科提供。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)染

細胞轉(zhuǎn)染使用脂質(zhì)體3000，按照試劑盒說明將MG63 和U2OS 細胞隨機分為3 組，分別置于6 孔板中，包括未轉(zhuǎn)染組（空白組）、siRNA陰性對照轉(zhuǎn)染組（NC組）和siRNA轉(zhuǎn)染組（circ_0001246 siRNA）。轉(zhuǎn)染后通過FAM熒光標記水平評價轉(zhuǎn)染效率。

1.2.2 轉(zhuǎn)染后檢測各組細胞circ_0001246、miR?NA30a的表達

轉(zhuǎn)染后48 h 采用實時熒光定量qRT?PCR 檢測3 組細胞circ_0001246、miRNA30a 的表達。按Taq?Man miRNA分離試劑盒說明書提取細胞總RNA，用分光光度計定量檢測。RNA 樣品用逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA 后，用TaqMan miRNA 分析試劑盒檢測RNA 含量。特異性引物序列：circ_0001246 正向引物5′?TCTCATCTCATTCGTCTGATTGGA?3′，反向引物5′?ATCTTCATTCCGTGAGGCAATGTT?3′；miR?NA30a 正向引物5′?TACAGTACTGTGATAACTGAA?3′，反向引物5′?GTGCAGGGTCCGAGGT?3′；內(nèi)參U6正向引物5′?CTCGCTTCGGCAGCACA?3′，反向引物5′?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3′。反應條件為95 ℃10 min預變性；95 ℃15 s，60 ℃60 s，70 ℃1 s，40個循環(huán)。反應結(jié)束后得到各個標本和內(nèi)參U6的基本循環(huán)數(shù)（CT值），根據(jù)公式計算目的基因相對含量。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后檢測各組細胞對依托泊苷的敏感性

轉(zhuǎn)染后將骨肉瘤細胞MG63 加到24 孔板上，分為3 組，加入100 μmol/L 的依托泊苷，用流式細胞AnnexinV/7AAD 雙染法檢測不同時間（6、12、24 h）腫瘤細胞凋亡情況。

1.2.4 熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Ccirc_0001246的作用

構(gòu)建熒光素酶報告基因，將circ_0001246 的線性序列攜帶1 個預測miRNA30a 結(jié)合位點導入psi?CHECK 質(zhì)粒。合成目的序列為5′? TCTTCAAT?GATTTTGTTTACA?3′，用引物進行PCR 擴增，經(jīng)SpeⅠ和HindⅢ酶切后連接到psiCHECK質(zhì)粒。利用兩步PCR法將突變的片段導入預測的miRNA30a結(jié)合位點，通過測序確定克隆產(chǎn)物的DNA 序列。MG63細胞與含有預測片段的psiCHECK 質(zhì)粒和miR?NA30a模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后使用雙Glo熒光素酶測定系統(tǒng)測定熒光素酶活性。至少等待10 min～2 h，然后測量海腎螢光。海腎螢光的平板測量順序應該與螢火蟲螢光相同。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 13.0 進行數(shù)據(jù)分析。所有結(jié)果均以均值±標準差（）表示。采用單因素方差分析（ANOVA）、Dunnett?t檢驗和Student?t檢驗比較各組實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率

倒置熒光顯微鏡下觀察熒光信號，選擇最佳的轉(zhuǎn)染時間和條件，熒光標記對照組轉(zhuǎn)染效率均在60%以上（圖1A）。

2.2 轉(zhuǎn)染后各組細胞circ_0001246和miRNA30a的表達

circ_0001246 siRNA 轉(zhuǎn)染組中circ_0001246 表達明顯低于NC 組和空白組（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染circ_0001246 siRNA組的miRNA30a表達較NC組和空白組明顯上調(diào)（P＜0.05，圖1B）。發(fā)現(xiàn)circ_0001246和miRNA30a的表達呈現(xiàn)負反饋。這一結(jié)果提示circ_0001246 在骨肉瘤細胞中可能對miRNA30a 發(fā)揮了miRNA“吸附”作用。

2.3 轉(zhuǎn)染后各組細胞對化療藥物依托泊苷的敏感性檢測

作用6 h，3 組細胞凋亡率無明顯差異（P＞0.05）；作用12 h，circ_0001246 siRNA 轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率較NC組和空白組明顯升高（P＜0.05）；作用24 h，circ_0001246 siRNA 轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率較NC 組和空白組明顯升高（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染circ_0001246 siRNA后腫瘤細胞對化療藥物依托泊苷的敏感性明顯增高（圖2）。

2.4 熒光素酶報告基因?qū)嶒?/h3>

將psiCHECK 載體和miRNA30a 模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染MG63細胞，miRNA30a過表達細胞與對照組相比，熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05，圖3）。這些數(shù)據(jù)表明，circ_0001246 可以通過直接堿基對吸附miRNA30a。

3 討論

圖1 轉(zhuǎn)染后骨肉瘤細胞（MG63、U2OS）circ_0001246，miRNA30a的表達Figure 1 Expression of circ_0001246 and miRNA30a in osteosarcoma cells（MG63，U2OS）after trans?fection

骨肉瘤起源于骨間葉細胞，多見于長骨，也可見于股骨遠端或脛骨近端，是一種原發(fā)性的惡性骨腫瘤。骨肉瘤惡性程度高，往往在術(shù)前就有了微小轉(zhuǎn)移灶，加上容易局部復發(fā)，患者預后很差［9］。雖然如今化療技術(shù)進步，但即使采用手術(shù)聯(lián)合化療的治療方案，患者5年生存率也不令人滿意［10-11］。骨肉瘤導致患者死亡的原因主要是病變轉(zhuǎn)移迅速和對化療的抵抗，一旦出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，正常情況下輔助化療對其作用不大［12］。隨著基因治療等生物治療技術(shù)的發(fā)展，骨肉瘤的綜合治療有了新的進展，而怎樣通過基因技術(shù)提高骨肉瘤化療的敏感性也成為骨肉瘤治療的關鍵。

圖2 轉(zhuǎn)染circ_0001246 siRNA后12 h、24 h骨肉瘤細胞（MG63）對化療藥物依托泊苷的敏感性明顯增高Figure 2 The sensitivity of osteosarcoma cell（MG63）to the chemotherapy drug etoposide was significantly increased at 12 h and 24 h after transfected with circ_0001246?siRNA

圖3 Circ_0001246可以通過直接堿基配對吸附miRNA30aFigure 3 Circ_0001246 can adsorb miRNA30a by direct base pairing

隨著生物信息學和分子生物學技術(shù)的革新，證實了哺乳動物細胞中廣泛存在著一種具有調(diào)控基因表達作用的內(nèi)源性circRNA［13］。circRNA 主要來源于pre?mRNA 的可變剪切，由套索驅(qū)動的環(huán)化或內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化產(chǎn)生，分為外顯子、內(nèi)含子、外顯子與內(nèi)含子混合等3 類來源，之前被認為是一類錯誤剪接而形成的低豐度RNA 分子，其表達水平和功能在之前受到了忽略。最新的研究表明一些circRNA 可以ceRNA 的角色發(fā)揮基因表達調(diào)控作用，這些circRNA 擁有MRE，可以作為結(jié)合miR?NA 的天然“海綿”來阻斷后者對靶RNA的抑制作用，從而調(diào)控miRNA 靶基因的表達水平，與很多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［14-15］。有相關文獻報道，circRNA還可以調(diào)控選擇性拼接和基因轉(zhuǎn)錄、作為生物標志物發(fā)揮調(diào)控作用［16］。根據(jù)基因預測數(shù)據(jù)庫［17-18］，我們篩選了與骨肉瘤細胞和組織相關的circRNA，發(fā)現(xiàn)在基因ATXN10 轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)過程中產(chǎn)生的hsa_circ_0001246 表達明顯上調(diào)，而在骨肉瘤中miRNA30a 表達下調(diào)。這一發(fā)現(xiàn)證明了circ_0001246 是一種促腫瘤基因，并且我們驗證了circ_0001246 可以促進骨肉瘤的增殖轉(zhuǎn)移，參與了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展［8］。

本研究中，通過siRNA 抑制circ_0001246 在骨肉瘤細胞中的表達，檢測circ_0001246和miRNA30a在骨肉瘤細胞中的表達，發(fā)現(xiàn)miRNA30a 的表達與circ_0001246 呈顯著負相關，這一結(jié)果表明circ_0001246 在骨肉瘤中的作用可能是通過miRNA30a實現(xiàn)的。進一步檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞對化療藥物依托泊苷的敏感性，作用6 h，3 組細胞凋亡率無明顯差異（P＞0.05）；作用12 h，circ_0001246 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率較NC 組和空白組明顯升高（P＜0.05）；作用24 h，circ_0001246 siRNA 轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率較NC 組和空白組明顯升高（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染circ_0001246 siRNA 后腫瘤細胞對化療藥物依托泊苷的敏感性明顯增高。和本課題組之前circ_0001246 可以促進骨肉瘤增殖轉(zhuǎn)移的結(jié)果相吻合。基于以上結(jié)果和相關文獻報道的數(shù)據(jù)可以有把握地預測，circ_0001246可以通過吸附miRNA30a分子從而調(diào)節(jié)骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。為了進一步探討circ_0001246調(diào)節(jié)骨肉瘤細胞生物學行為的分子機制，進行了熒光素酶報告基因?qū)嶒?。將psiCHECK載體和miRNA30a 模擬物或陰性對照共轉(zhuǎn)染后，觀察到miRNA30a 過表達組細胞與對照組相比，熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05）。這些數(shù)據(jù)表明，circ_0001246 可以通過直接堿基對結(jié)合miRNA30a 抑制其功能，這一結(jié)果與之前國外報道的circRNA 的作用機制一致［19-20］。

綜上所述，circ_0001246是骨肉瘤相關癌基因，靶向抑制骨肉瘤中circ_0001246表達可以增強腫瘤細胞對化療藥物依托泊苷的敏感性。其機制之一是通過circ_0001246 的吸附功能負調(diào)控miRNA30a的表達而實現(xiàn)的。在此基礎上，提出circ_0001246可能是一種骨肉瘤基因治療靶點，具有較高的臨床和科研價值。