GCN5調控sublytic C5b?9誘導大鼠腎小球系膜細胞表達Cyclin D1及致SOX9的乙?；揎?/h1>
2021-03-22 06:03郭苗苗劉龍飛謝夢曉吳志皎彭明玉王迎偉
南京醫(yī)科大學學報（自然科學版） 2021年2期
郭苗苗，劉龍飛，謝夢曉，吳志皎，羅 燦，彭明玉，趙 聃，張 婧，邱 文，王迎偉
南京醫(yī)科大學免疫學系，江蘇 南京 211166
系膜增生性腎炎（mesangial proliferative glomer?ulonephritis，MsPGN）是人類常見的腎小球疾病，其病變特征是腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cell，GMC）的異常增生和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過量堆積，最終可致腎纖維化和硬化［1］。大鼠Thy?1N 是一種普遍用于MsPGN 研究的動物模型［2］。本課題組以往研究已表明，Thy?1N 發(fā)病具有亞溶解C5b?9（sublytic C5b?9）的依賴性。體外用sublytic C5b?9 刺激GMC 后可引起細胞增生和產生促炎因子等［3-4］，但截至目前，有關sublytic C5b?9促進GMC增生的分子機制并不十分清楚。
本課題組前期研究發(fā)現，在Thy?1N大鼠發(fā)病早期的腎組織和受sublytic C5b?9 刺激的GMC 中，具有組蛋白乙?；D移酶（histone acetyltransferase，HAT）活性的GCN5和轉錄因子SOX9以及Cyclin D1的表達均同期上調。已知GCN5既可乙?；揎椊M蛋白和非組蛋白（如轉錄因子），又能作為輔助激活因子促進靶基因的轉錄［5］。再者，SOX9也可促進腫瘤細胞的增殖［6-7］，而Cyclin D1 的表達升高則能誘導細胞從G1期進入S期［8］。提示這3種基因的表達上調均是細胞增殖重要的調控因子。鑒于GCN5和SOX9分別是一種兼有HAT的轉錄輔激活因子和含鋅指結構的轉錄因子，而Cyclin D1又是細胞周期家族的一個成員，故在sublytic C5b?9刺激的GMC中升高的GCN5 對Cyclin D1 基因表達有何影響，以及GCN5可否乙酰化修飾SOX9目前并不知曉，本研究對此進行了探討。
1 材料和方法
1.1 材料
大鼠GMC細胞株（HBZY?1）購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。pIRES2/GCN5（帶Flag標簽）和pcDNA3.1?SOX9（帶HA 標簽）過表達質粒、GCN5酶活性失活突變質粒（570 位谷氨酸突變?yōu)楸彼?，簡稱ΔGCN5）均由本課題組劉龍飛博士構建并惠贈。此外，pGL3?Cyclin D1 啟動子全長（+105～+130 nt）質粒由本課題組謝夢曉博士構建并惠贈。
多克隆兔抗Thy?1 Ab由本實驗室制備保存［3-4］。補體來自健康志愿者新鮮血清（normal human se?rum，NHS）。人補體C6 缺陷血清（C6DS，Comple?ment Technology 公司，美國）。補體熱滅活血清（heat inactive serum，HIS）是指56 ℃30 min 滅活的正常人血清。重組人C6（北京義翹神州生物技術有限公司）。單克隆GCN5 抗體（C26A10）、乙?；贵w（Ac?K?103）（CST公司，美國）。單克隆SOX9抗體（sc?166505，Santa Cruz 公司，美國）。多克隆Cyclin D1抗體（Abcam公司，美國）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠GMC的培養(yǎng)
將大鼠GMC 細胞株接種于含有MEM 完全培養(yǎng)液（10%胎牛血清）中培養(yǎng)48 h。當細胞融合度達到80%～90%時，行細胞傳代并繼續(xù)培養(yǎng)。
1.2.2 Sublytic C5b?9刺激GMC最佳劑量的確定
將GMC 種于MEM 完全培養(yǎng)液中，當融合達60%時，用不同濃度的Thy1Ab 致敏30 min，再用不同濃度的NHS（含補體）進行孵育。然后，采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）法檢查GMC 溶解的百分率。GMC 溶解率小于5%稱為亞溶解（sublytic）劑量［3-4］。本研究最終確定以5%Thy1Ab與3%NHS作為形成sublytic C5b?9的最佳劑量。
1.2.3 GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1表達水平的測定
GMC 分組處理：將GMC 分為6 組（n=3），即①MEM 組：僅用MEM 培養(yǎng)；②Thy?1Ab 組：給Thy?1 Ab（50 μL/mL）致敏30 min，緩沖液洗滌后加MEM培養(yǎng)；③Thy?1 Ab+HIS 組：用同量Thy?1 Ab 致敏30 min，洗滌后加HIS（30 μL/mL）繼續(xù)培養(yǎng)；④Thy?1 Ab+C6DS 組：同量Thy?1 Ab 致敏30 min，洗滌后加C6DS（30 μL/mL）繼續(xù)培養(yǎng)；⑤Thy?1 Ab+C6DS+C6組：同上Thy? Ab 致敏30 min，洗滌后加入C6DS（30 μL/mL）及C6 蛋白（2 mg/L）再培養(yǎng)；⑥Sublytic C5b?9 組：加同量Thy?1 Ab 致敏30 min，洗滌后加NHS（30 μL/ml，提供補體）繼續(xù)培養(yǎng)。
Western blot 實驗：上述分組GMC 在實驗3 h 時提取蛋白，用Western blot 檢測GCN5、SOX9 和Cy?clin D1的表達。將GMC裂解物離心10 min，取20 μg蛋白行SDS?PAGE 膠電泳，先45 V恒壓濃縮再120 V電泳2 h，接著用0.3 A 恒流濕轉120 min，將蛋白轉印到PVDF 膜上。之后分別加入GCN5、SOX9、Cy?clin D1一抗，4 ℃過夜。漂洗后用HRP 標記的二抗孵育1 h，最后用ECL化學發(fā)光試劑檢測［3-4］。
1.2.4 過表達或沉默GCN5對Cyclin D1基因啟動子活性的影響
GMC 分組處理：將GMC 轉染不同質粒進行分組（n=3）：①pIRES2 組；②pIRES2?GCN5 組；③shC?TR 組；④shCTR+sublytic C5b?9 組；⑤shGCN5+sub?lytic C5b?9 組。①、②組用Lipofectamine 2000 將pIRES2 或pIRES2?GCN5 質粒單獨或分別與含有Cyclin D1 啟動子序列的熒光素酶報告基因質粒共轉染GMC后48 h，而③、④、⑤組則同法將shCTR 或shGCN5質粒單獨或分別與含有Cyclin D1啟動子序列的熒光素酶報告基因質粒共轉染GMC 48 h，再行sublytic C5b?9 刺激3 h（過表達和小干擾質粒的轉染效率驗證以檢查GCN5的表達水平確定）。
熒光素酶報告實驗：用1×被動裂解緩沖液（PLB）裂解處理后的GMC，行熒光素酶報告實驗測定Cyclin D1 啟動子活性。步驟：先在檢測管中加入25 μL 熒光素酶檢測試劑Ⅱ，放入熒光發(fā)光儀中，接著轉移2.5 μL PLB 裂解的細胞液到檢測管中，混合后檢測螢火蟲熒光素酶的活性，最后加入25 μL Stop&Glo?Reagent 檢測海腎熒光素酶的活性。螢火蟲熒光值/海腎熒光值的比值即為最終結果［3-4］。
1.2.5 過表達或沉默GCN5對Cyclin D1基因轉錄與表達的檢查
Cyclin D1 mRNA水平的測定：質粒轉染GMC的分組同1.2.4。用Primer Premier 5 軟件設計大鼠Cy?clin D1和β?actin qPCR引物。引物序列如下：Cyclin D1上游5′?AGAGGGAGATTGTGCCATCC?3′，下游5′?ACAAGA?ACCGGTCCAGGTA G?3′；β?actin 上游5′?TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA?3′，下游5′?CATCGGAA?CCGCTCATTGCCGATAG?3′。提取GMC總RNA，取500 ng 總RNA 作模板，行逆轉錄制備cDNA。Real?time PCR反應參數為：95 ℃，10 s預變性；95 ℃，5 s，60 ℃，31 s，共40 個循環(huán)。用β?actin作內參基因，計算公式為：2-ΔΔCT。Cyclin D1 蛋白表達的測定同1.2.3所述。
1.2.6 Sublytic C5?9 刺激的GMC 中SOX9 乙酰化水平的鑒定
GMC分組處理同前1.2.3。SOX9乙酰化水平用免疫共沉淀（Co?IP）和Western blot 實驗檢測。按說明書操作，每6孔板GMC加入200 μL IP 裂解液（含PMSF 和磷酸酶抑制劑），提取蛋白后行Western blot檢測，一抗為乙?；贵w（Ac?K?103），實驗步驟見1.2.3描述。
1.2.7 過表達GCN5和酶活性突變質粒（ΔGCN5）或沉默GCN5基因影響SOX9乙?；臋z查
GMC 分組處理：過表達GCN5 和ΔGCN5 的分組是：①HA?SOX9+pIRES2組，②HA?SOX9+Flag?GCN5組，③HA?SOX9+ΔGCN5組。分別轉染相應質粒于GMC中48 h。另沉默GCN5基因的分組是：①shCTR組；②shCTR+sublytic C5b?9組；③shGCN5+sublytic C5b?9 組。將shCTR 或shGCN5 質粒單獨轉染GMC后48 h，②和③組再行sublytic C5b?9 刺激3 h（所有分組n=3）。SOX9乙?；降臏y定同1.2.6所述。
1.3 統(tǒng)計學方法
所有實驗均獨立重復3 次，所得定量數據以均數±標準誤（）表示，組間比較則采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。應用GraphPad?prism軟件（版本5.01）進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1 Thy?1N 大鼠腎組織中GCN5、SOX9 和Cyclin D1基因的表達
取Thy?1N大鼠發(fā)病3 h和正常兔血清（NRS）對照鼠3 h 的腎組織進行檢查顯示，Thy?1N 組的GCN5、SOX9 和Cyclin D1 表達明顯升高（P＜0.05，圖1）。
圖1 Thy?1N大鼠腎組織中GCN5、SOX9和Cyclin D1蛋白的表達Figure 1 GCN5，SOX9 and Cyclin D1 expression in the renal tissues of Thy?1N rat
2.2 Sublytic C5b?9 刺激的GMC 中GCN5、SOX9 和Cyclin D1蛋白的表達
將GMC 分為MEM、Thy?1 Ab、Thy?1 Ab+HIS、Thy?1 Ab+C6DS、Thy?1 Ab+C6DS+C6和sublytic C5b?9 組。Western blot 檢測發(fā)現，3 h 時，sublytic C5b?9組和Thy?1 Ab+C6DS+C6組的GCN5、SOX9和Cyclin D1表達明顯增加（P＜0.05或P＜0.01，圖2）。
圖2 不同處理3 h的GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1蛋白的表達Figure 2 GCN5，SOX9 and Cyclin D1 protein expression at 3 h in the GMC by different treatment
2.3 過表達或沉默GCN5對Cyclin D1基因啟動、轉錄和表達的影響
將pGL3?Cyclin D1 啟動子質粒分別與pIRES2/GCN5 或shGCN5 共轉染GMC。在轉染后48 h，pIRES2/GCN5 組不予刺激，而轉染shGCN5 質粒的GMC 培養(yǎng)36 h，用無血清饑餓12 h，再給予sublytic C5b?9 刺激3 h。結果顯示，過表達GCN5 基因明顯上調Cyclin D1 的啟動子活性，而沉默GCN5 基因后由sublytic C5b?9 上調的Cyclin D1 啟動子活性顯著下降（P＜0.05或P＜0.01，圖3）。
圖3 過表達或沉默GCN5 對GMC 中Cyclin D1 基因啟動子活性的影響Figure 3 Effects of GCN5 overexpression or knockdown on the activity of Cyclin D1 promoter in GMC
GMC 處理后提取總RNA 和蛋白，real?time PCR和Western blot 檢測顯示，過表達GCN5 可顯著增加Cyclin D1 的mRNA 和蛋白水平，而沉默GCN5 基因則可抑制sublytic C5b?9 誘導的Cyclin D1 表達（P＜0.05或P＜0.01，圖4）。
2.4 Sublytic C5b?9 刺激大鼠GMC 后SOX9 乙?；男揎?/h3>
實驗證實，sublytic C5b?9和Thy?1 Ab+C6DS+C6組，SOX9 的乙?；斤@著增加，且SOX9 的蛋白表達也明顯升高（圖5）。
過表達GCN5基因對SOX9乙酰化修飾的影響：為了證明GCN5 可對SOX9 進行乙?；揎?，將pIRES2、Flag?GCN5 過表達質粒及ΔGCN5 分別與HA?SOX9 過表達質粒共轉染GMC 48 h，行Co?IP/Western blot 檢測證實，過表達GCN5可增強SOX9的乙?；?，而過表達ΔGCN5則對SOX9乙?；綗o明顯影響（圖6）。
沉默GCN5 基因對sublytic C5b?9 誘導SOX9 乙?；揎椀挠绊懀簽榱诉M一步明確GCN5 能乙?；揎桽OX9，將shGCN5及對照質粒分別轉染GMC再行sublytic C5b?9刺激3 h，用Co?IP/Western blot實驗發(fā)現，沉默GCN5基因后確能明顯降低sublytic C5b?9誘導SOX9的乙?；揎棧▓D7）。
圖6 過表達GCN5或ΔGCN5影響SOX9乙酰化修飾的作用Figure 6 Effects of GCN5 or ΔGCN5 overexpression on SOX9 acetylation
3 討論
圖7 沉默GCN5 基因后影響sublytic C5b?9 誘導SOX9 乙?；男揎桭igure 7 Effects of GCN5 gene silencing on SOX9 acetyla?tion induced by sublytic C5b?9
人類MsPGN 發(fā)病率約占臨床腎病綜合征的30%，其組織病變的主要特征是，GMC 的過度增生和ECM 的大量積聚，最終可致腎小球纖維化，引起患者腎功能衰竭而死亡［1］。大鼠Thy?1N 是當今研究MsPGN 公認的動物模型［2］。以往實驗已表明，Thy?1N的發(fā)病具有sublytic C5b?9的依賴性，即當其GMC膜表面形成sublytic C5b?9后，它可作為細胞的刺激原激活某些信號通路及上調多種轉錄因子和轉錄輔激活因子，進而促使相應基因的轉錄與表達，最終引起GMC的凋亡、炎癥或增生反應［3-4，9］。
就Thy?1N大鼠GMC的增生而言，不僅需要sub?lytic C5b?9的插膜刺激，也需要轉錄因子、轉錄輔激活因子和促增生基因的共同參與［10-12］。本課題前期實驗已確證，無論是Thy?1N 大鼠發(fā)病3 h 的腎組織（體內），還是在受sublytic C5b?9 刺激3 h 的GMC 中（體外），GCN5、SOX9 和Cyclin D1 的表達均明顯上調。此外，本課題組還發(fā)現，Cyclin D1 表達的高峰時相稍晚于GCN5和SOX9，且GCN5與SOX9的表達峰值基本同步，加之SOX9 的上調能促進Cyclin D1基因轉錄，故這些結果提示，GCN5、SOX9 和Cyclin D1之間可能存在著密切的關系。
由于本課題組過去的實驗已發(fā)現，SOX9 對Cyclin D1的表達有調控效應（待發(fā)表）。因此，本研究著重探討了在GMC 中過表達或沉默GCN5 對Cyclin D1 基因激活的影響。結果發(fā)現，過表達GCN5 能提高Cyclin D1 的啟動子活性、mRNA 和蛋白水平，而沉默GCN5基因則能降低由sublytic C5b?9 刺激導致的Cyclin D1 基因的啟動與表達。提示，GCN5確能促進Cyclin D1基因的表達。
文獻報道，GCN5 作為一個兼有HAT 活性的轉錄輔激活因子，其表達升高時既能乙?；揎椊M蛋白，又能乙?；揎椃墙M蛋白（如轉錄因子），以增強其自身的活性，最終有利于靶基因的轉錄［5，13-15］。本研究為了觀察受sublytic C5b?9刺激的GMC中SOX9能否與GCN5結合并被GCN5乙?；揎?，在體外進行了Co?IP/Western blot 實驗。結果發(fā)現，用sublytic C5b?9 刺激GMC 后，其SOX9 確可與GCN5 結合，且其乙酰化水平明顯增加。另外，在GMC 中過表達GCN5 能明顯提高SOX9 的乙?；?，而在GMC中轉染酶活性缺失的ΔGCN5 質粒后，SOX9 的乙?；絼t無明顯變化。再者，沉默GCN5 基因也可下調sublytic C5b?9誘導的SOX9乙?；纳?。提示，sublytic C5b?9刺激細胞后，GCN5確能乙?；揎桽OX9，且其作用依賴于GCN5的HAT活性。
綜上所述，本研究在確證了Thy?1N大鼠的腎組織和受sublytic C5b?9 刺激的GMC 中GCN5、SOX9、Cyclin D1蛋白表達均已增加的基礎上，進一步探討了GCN5 對Cyclin D1 表達的影響，以及GCN5 對SOX9的乙酰化修飾作用。研究揭示，GCN5既能促進Cyclin D1 基因的表達，又能乙酰化修飾SOX9。本研究結果為今后深入研究Thy?1N 的發(fā)病機制提供了有用的實驗依據。
猜你喜歡
抑癌蛋白p53乙?；揎椀恼{控網絡中國生物化學與分子生物學報(2022年8期)2022-09-08 農桿菌轉化法中的“Ti質粒轉化載體系統(tǒng)”的簡介
——一道江蘇高考題的奧秘解讀和拓展中學生物學(2022年7期)2022-09-07 全基因組測序后質粒的組裝與鑒定研究進展*成都醫(yī)學院學報(2022年4期)2022-08-19 Aspirin乙?；疕DAC2抑制腫瘤細胞增殖復旦學報（自然科學版）(2021年5期)2021-11-17 NNMT基因啟動子雙熒光素酶報告系統(tǒng)的構建及其與SND1靶向關系的驗證天津醫(yī)科大學學報(2021年4期)2021-08-21 mcr-1陽性類噬菌體質粒與F33∶A-∶B-質粒共整合形成的融合質粒的生物學特性分析江西農業(yè)學報(2021年4期)2021-04-20 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)在家蠶基因啟動子研究中的應用廣東蠶業(yè)(2021年1期)2021-03-18 乙?；揎棇μ烊幻庖哒{節(jié)機制研究取得進展醫(yī)藥前沿(2020年29期)2020-12-04 博來霉素誘導的小鼠肺纖維化組織中組蛋白3和組蛋白4乙?；兓?/a>山西醫(yī)科大學學報(2020年8期)2020-09-16 開發(fā)新方法追蹤植物病害的全球傳播（2020.6.7 iPlants）三農資訊半月報(2020年11期)2020-06-21
郭苗苗，劉龍飛，謝夢曉，吳志皎，羅 燦，彭明玉，趙 聃，張 婧，邱 文，王迎偉
南京醫(yī)科大學免疫學系，江蘇 南京 211166
系膜增生性腎炎（mesangial proliferative glomer?ulonephritis，MsPGN）是人類常見的腎小球疾病，其病變特征是腎小球系膜細胞（glomerular mesangial cell，GMC）的異常增生和細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過量堆積，最終可致腎纖維化和硬化［1］。大鼠Thy?1N 是一種普遍用于MsPGN 研究的動物模型［2］。本課題組以往研究已表明，Thy?1N 發(fā)病具有亞溶解C5b?9（sublytic C5b?9）的依賴性。體外用sublytic C5b?9 刺激GMC 后可引起細胞增生和產生促炎因子等［3-4］，但截至目前，有關sublytic C5b?9促進GMC增生的分子機制并不十分清楚。
本課題組前期研究發(fā)現，在Thy?1N大鼠發(fā)病早期的腎組織和受sublytic C5b?9 刺激的GMC 中，具有組蛋白乙?；D移酶（histone acetyltransferase，HAT）活性的GCN5和轉錄因子SOX9以及Cyclin D1的表達均同期上調。已知GCN5既可乙?；揎椊M蛋白和非組蛋白（如轉錄因子），又能作為輔助激活因子促進靶基因的轉錄［5］。再者，SOX9也可促進腫瘤細胞的增殖［6-7］，而Cyclin D1 的表達升高則能誘導細胞從G1期進入S期［8］。提示這3種基因的表達上調均是細胞增殖重要的調控因子。鑒于GCN5和SOX9分別是一種兼有HAT的轉錄輔激活因子和含鋅指結構的轉錄因子，而Cyclin D1又是細胞周期家族的一個成員，故在sublytic C5b?9刺激的GMC中升高的GCN5 對Cyclin D1 基因表達有何影響，以及GCN5可否乙酰化修飾SOX9目前并不知曉，本研究對此進行了探討。
1 材料和方法
1.1 材料
大鼠GMC細胞株（HBZY?1）購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心。pIRES2/GCN5（帶Flag標簽）和pcDNA3.1?SOX9（帶HA 標簽）過表達質粒、GCN5酶活性失活突變質粒（570 位谷氨酸突變?yōu)楸彼?，簡稱ΔGCN5）均由本課題組劉龍飛博士構建并惠贈。此外，pGL3?Cyclin D1 啟動子全長（+105～+130 nt）質粒由本課題組謝夢曉博士構建并惠贈。
多克隆兔抗Thy?1 Ab由本實驗室制備保存［3-4］。補體來自健康志愿者新鮮血清（normal human se?rum，NHS）。人補體C6 缺陷血清（C6DS，Comple?ment Technology 公司，美國）。補體熱滅活血清（heat inactive serum，HIS）是指56 ℃30 min 滅活的正常人血清。重組人C6（北京義翹神州生物技術有限公司）。單克隆GCN5 抗體（C26A10）、乙?；贵w（Ac?K?103）（CST公司，美國）。單克隆SOX9抗體（sc?166505，Santa Cruz 公司，美國）。多克隆Cyclin D1抗體（Abcam公司，美國）。
1.2 方法
1.2.1 大鼠GMC的培養(yǎng)
將大鼠GMC 細胞株接種于含有MEM 完全培養(yǎng)液（10%胎牛血清）中培養(yǎng)48 h。當細胞融合度達到80%～90%時，行細胞傳代并繼續(xù)培養(yǎng)。
1.2.2 Sublytic C5b?9刺激GMC最佳劑量的確定
將GMC 種于MEM 完全培養(yǎng)液中，當融合達60%時，用不同濃度的Thy1Ab 致敏30 min，再用不同濃度的NHS（含補體）進行孵育。然后，采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）法檢查GMC 溶解的百分率。GMC 溶解率小于5%稱為亞溶解（sublytic）劑量［3-4］。本研究最終確定以5%Thy1Ab與3%NHS作為形成sublytic C5b?9的最佳劑量。
1.2.3 GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1表達水平的測定
GMC 分組處理：將GMC 分為6 組（n=3），即①MEM 組：僅用MEM 培養(yǎng)；②Thy?1Ab 組：給Thy?1 Ab（50 μL/mL）致敏30 min，緩沖液洗滌后加MEM培養(yǎng)；③Thy?1 Ab+HIS 組：用同量Thy?1 Ab 致敏30 min，洗滌后加HIS（30 μL/mL）繼續(xù)培養(yǎng)；④Thy?1 Ab+C6DS 組：同量Thy?1 Ab 致敏30 min，洗滌后加C6DS（30 μL/mL）繼續(xù)培養(yǎng)；⑤Thy?1 Ab+C6DS+C6組：同上Thy? Ab 致敏30 min，洗滌后加入C6DS（30 μL/mL）及C6 蛋白（2 mg/L）再培養(yǎng)；⑥Sublytic C5b?9 組：加同量Thy?1 Ab 致敏30 min，洗滌后加NHS（30 μL/ml，提供補體）繼續(xù)培養(yǎng)。
Western blot 實驗：上述分組GMC 在實驗3 h 時提取蛋白，用Western blot 檢測GCN5、SOX9 和Cy?clin D1的表達。將GMC裂解物離心10 min，取20 μg蛋白行SDS?PAGE 膠電泳，先45 V恒壓濃縮再120 V電泳2 h，接著用0.3 A 恒流濕轉120 min，將蛋白轉印到PVDF 膜上。之后分別加入GCN5、SOX9、Cy?clin D1一抗，4 ℃過夜。漂洗后用HRP 標記的二抗孵育1 h，最后用ECL化學發(fā)光試劑檢測［3-4］。
1.2.4 過表達或沉默GCN5對Cyclin D1基因啟動子活性的影響
GMC 分組處理：將GMC 轉染不同質粒進行分組（n=3）：①pIRES2 組；②pIRES2?GCN5 組；③shC?TR 組；④shCTR+sublytic C5b?9 組；⑤shGCN5+sub?lytic C5b?9 組。①、②組用Lipofectamine 2000 將pIRES2 或pIRES2?GCN5 質粒單獨或分別與含有Cyclin D1 啟動子序列的熒光素酶報告基因質粒共轉染GMC后48 h，而③、④、⑤組則同法將shCTR 或shGCN5質粒單獨或分別與含有Cyclin D1啟動子序列的熒光素酶報告基因質粒共轉染GMC 48 h，再行sublytic C5b?9 刺激3 h（過表達和小干擾質粒的轉染效率驗證以檢查GCN5的表達水平確定）。
熒光素酶報告實驗：用1×被動裂解緩沖液（PLB）裂解處理后的GMC，行熒光素酶報告實驗測定Cyclin D1 啟動子活性。步驟：先在檢測管中加入25 μL 熒光素酶檢測試劑Ⅱ，放入熒光發(fā)光儀中，接著轉移2.5 μL PLB 裂解的細胞液到檢測管中，混合后檢測螢火蟲熒光素酶的活性，最后加入25 μL Stop&Glo?Reagent 檢測海腎熒光素酶的活性。螢火蟲熒光值/海腎熒光值的比值即為最終結果［3-4］。
1.2.5 過表達或沉默GCN5對Cyclin D1基因轉錄與表達的檢查
Cyclin D1 mRNA水平的測定：質粒轉染GMC的分組同1.2.4。用Primer Premier 5 軟件設計大鼠Cy?clin D1和β?actin qPCR引物。引物序列如下：Cyclin D1上游5′?AGAGGGAGATTGTGCCATCC?3′，下游5′?ACAAGA?ACCGGTCCAGGTA G?3′；β?actin 上游5′?TCACCCACACTGTGCCCATCTATGA?3′，下游5′?CATCGGAA?CCGCTCATTGCCGATAG?3′。提取GMC總RNA，取500 ng 總RNA 作模板，行逆轉錄制備cDNA。Real?time PCR反應參數為：95 ℃，10 s預變性；95 ℃，5 s，60 ℃，31 s，共40 個循環(huán)。用β?actin作內參基因，計算公式為：2-ΔΔCT。Cyclin D1 蛋白表達的測定同1.2.3所述。
1.2.6 Sublytic C5?9 刺激的GMC 中SOX9 乙酰化水平的鑒定
GMC分組處理同前1.2.3。SOX9乙酰化水平用免疫共沉淀（Co?IP）和Western blot 實驗檢測。按說明書操作，每6孔板GMC加入200 μL IP 裂解液（含PMSF 和磷酸酶抑制劑），提取蛋白后行Western blot檢測，一抗為乙?；贵w（Ac?K?103），實驗步驟見1.2.3描述。
1.2.7 過表達GCN5和酶活性突變質粒（ΔGCN5）或沉默GCN5基因影響SOX9乙?；臋z查
GMC 分組處理：過表達GCN5 和ΔGCN5 的分組是：①HA?SOX9+pIRES2組，②HA?SOX9+Flag?GCN5組，③HA?SOX9+ΔGCN5組。分別轉染相應質粒于GMC中48 h。另沉默GCN5基因的分組是：①shCTR組；②shCTR+sublytic C5b?9組；③shGCN5+sublytic C5b?9 組。將shCTR 或shGCN5 質粒單獨轉染GMC后48 h，②和③組再行sublytic C5b?9 刺激3 h（所有分組n=3）。SOX9乙?；降臏y定同1.2.6所述。
1.3 統(tǒng)計學方法
所有實驗均獨立重復3 次，所得定量數據以均數±標準誤（）表示，組間比較則采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。應用GraphPad?prism軟件（版本5.01）進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結果
2.1 Thy?1N 大鼠腎組織中GCN5、SOX9 和Cyclin D1基因的表達
取Thy?1N大鼠發(fā)病3 h和正常兔血清（NRS）對照鼠3 h 的腎組織進行檢查顯示，Thy?1N 組的GCN5、SOX9 和Cyclin D1 表達明顯升高（P＜0.05，圖1）。
圖1 Thy?1N大鼠腎組織中GCN5、SOX9和Cyclin D1蛋白的表達Figure 1 GCN5，SOX9 and Cyclin D1 expression in the renal tissues of Thy?1N rat
2.2 Sublytic C5b?9 刺激的GMC 中GCN5、SOX9 和Cyclin D1蛋白的表達
將GMC 分為MEM、Thy?1 Ab、Thy?1 Ab+HIS、Thy?1 Ab+C6DS、Thy?1 Ab+C6DS+C6和sublytic C5b?9 組。Western blot 檢測發(fā)現，3 h 時，sublytic C5b?9組和Thy?1 Ab+C6DS+C6組的GCN5、SOX9和Cyclin D1表達明顯增加（P＜0.05或P＜0.01，圖2）。
圖2 不同處理3 h的GMC中GCN5、SOX9和Cyclin D1蛋白的表達Figure 2 GCN5，SOX9 and Cyclin D1 protein expression at 3 h in the GMC by different treatment
2.3 過表達或沉默GCN5對Cyclin D1基因啟動、轉錄和表達的影響
將pGL3?Cyclin D1 啟動子質粒分別與pIRES2/GCN5 或shGCN5 共轉染GMC。在轉染后48 h，pIRES2/GCN5 組不予刺激，而轉染shGCN5 質粒的GMC 培養(yǎng)36 h，用無血清饑餓12 h，再給予sublytic C5b?9 刺激3 h。結果顯示，過表達GCN5 基因明顯上調Cyclin D1 的啟動子活性，而沉默GCN5 基因后由sublytic C5b?9 上調的Cyclin D1 啟動子活性顯著下降（P＜0.05或P＜0.01，圖3）。
圖3 過表達或沉默GCN5 對GMC 中Cyclin D1 基因啟動子活性的影響Figure 3 Effects of GCN5 overexpression or knockdown on the activity of Cyclin D1 promoter in GMC
GMC 處理后提取總RNA 和蛋白，real?time PCR和Western blot 檢測顯示，過表達GCN5 可顯著增加Cyclin D1 的mRNA 和蛋白水平，而沉默GCN5 基因則可抑制sublytic C5b?9 誘導的Cyclin D1 表達（P＜0.05或P＜0.01，圖4）。
2.4 Sublytic C5b?9 刺激大鼠GMC 后SOX9 乙?；男揎?/h3>
實驗證實，sublytic C5b?9和Thy?1 Ab+C6DS+C6組，SOX9 的乙?；斤@著增加，且SOX9 的蛋白表達也明顯升高（圖5）。
過表達GCN5基因對SOX9乙酰化修飾的影響：為了證明GCN5 可對SOX9 進行乙?；揎?，將pIRES2、Flag?GCN5 過表達質粒及ΔGCN5 分別與HA?SOX9 過表達質粒共轉染GMC 48 h，行Co?IP/Western blot 檢測證實，過表達GCN5可增強SOX9的乙?；?，而過表達ΔGCN5則對SOX9乙?；綗o明顯影響（圖6）。
沉默GCN5 基因對sublytic C5b?9 誘導SOX9 乙?；揎椀挠绊懀簽榱诉M一步明確GCN5 能乙?；揎桽OX9，將shGCN5及對照質粒分別轉染GMC再行sublytic C5b?9刺激3 h，用Co?IP/Western blot實驗發(fā)現，沉默GCN5基因后確能明顯降低sublytic C5b?9誘導SOX9的乙?；揎棧▓D7）。
圖6 過表達GCN5或ΔGCN5影響SOX9乙酰化修飾的作用Figure 6 Effects of GCN5 or ΔGCN5 overexpression on SOX9 acetylation
3 討論
圖7 沉默GCN5 基因后影響sublytic C5b?9 誘導SOX9 乙?；男揎桭igure 7 Effects of GCN5 gene silencing on SOX9 acetyla?tion induced by sublytic C5b?9
人類MsPGN 發(fā)病率約占臨床腎病綜合征的30%，其組織病變的主要特征是，GMC 的過度增生和ECM 的大量積聚，最終可致腎小球纖維化，引起患者腎功能衰竭而死亡［1］。大鼠Thy?1N 是當今研究MsPGN 公認的動物模型［2］。以往實驗已表明，Thy?1N的發(fā)病具有sublytic C5b?9的依賴性，即當其GMC膜表面形成sublytic C5b?9后，它可作為細胞的刺激原激活某些信號通路及上調多種轉錄因子和轉錄輔激活因子，進而促使相應基因的轉錄與表達，最終引起GMC的凋亡、炎癥或增生反應［3-4，9］。
就Thy?1N大鼠GMC的增生而言，不僅需要sub?lytic C5b?9的插膜刺激，也需要轉錄因子、轉錄輔激活因子和促增生基因的共同參與［10-12］。本課題前期實驗已確證，無論是Thy?1N 大鼠發(fā)病3 h 的腎組織（體內），還是在受sublytic C5b?9 刺激3 h 的GMC 中（體外），GCN5、SOX9 和Cyclin D1 的表達均明顯上調。此外，本課題組還發(fā)現，Cyclin D1 表達的高峰時相稍晚于GCN5和SOX9，且GCN5與SOX9的表達峰值基本同步，加之SOX9 的上調能促進Cyclin D1基因轉錄，故這些結果提示，GCN5、SOX9 和Cyclin D1之間可能存在著密切的關系。
由于本課題組過去的實驗已發(fā)現，SOX9 對Cyclin D1的表達有調控效應（待發(fā)表）。因此，本研究著重探討了在GMC 中過表達或沉默GCN5 對Cyclin D1 基因激活的影響。結果發(fā)現，過表達GCN5 能提高Cyclin D1 的啟動子活性、mRNA 和蛋白水平，而沉默GCN5基因則能降低由sublytic C5b?9 刺激導致的Cyclin D1 基因的啟動與表達。提示，GCN5確能促進Cyclin D1基因的表達。
文獻報道，GCN5 作為一個兼有HAT 活性的轉錄輔激活因子，其表達升高時既能乙?；揎椊M蛋白，又能乙?；揎椃墙M蛋白（如轉錄因子），以增強其自身的活性，最終有利于靶基因的轉錄［5，13-15］。本研究為了觀察受sublytic C5b?9刺激的GMC中SOX9能否與GCN5結合并被GCN5乙?；揎?，在體外進行了Co?IP/Western blot 實驗。結果發(fā)現，用sublytic C5b?9 刺激GMC 后，其SOX9 確可與GCN5 結合，且其乙酰化水平明顯增加。另外，在GMC 中過表達GCN5 能明顯提高SOX9 的乙?；?，而在GMC中轉染酶活性缺失的ΔGCN5 質粒后，SOX9 的乙?；絼t無明顯變化。再者，沉默GCN5 基因也可下調sublytic C5b?9誘導的SOX9乙?；纳?。提示，sublytic C5b?9刺激細胞后，GCN5確能乙?；揎桽OX9，且其作用依賴于GCN5的HAT活性。
綜上所述，本研究在確證了Thy?1N大鼠的腎組織和受sublytic C5b?9 刺激的GMC 中GCN5、SOX9、Cyclin D1蛋白表達均已增加的基礎上，進一步探討了GCN5 對Cyclin D1 表達的影響，以及GCN5 對SOX9的乙酰化修飾作用。研究揭示，GCN5既能促進Cyclin D1 基因的表達，又能乙酰化修飾SOX9。本研究結果為今后深入研究Thy?1N 的發(fā)病機制提供了有用的實驗依據。
猜你喜歡
中國生物化學與分子生物學報(2022年8期)2022-09-08
——一道江蘇高考題的奧秘解讀和拓展
中學生物學(2022年7期)2022-09-07
成都醫(yī)學院學報(2022年4期)2022-08-19
復旦學報（自然科學版）(2021年5期)2021-11-17
天津醫(yī)科大學學報(2021年4期)2021-08-21
江西農業(yè)學報(2021年4期)2021-04-20
廣東蠶業(yè)(2021年1期)2021-03-18
醫(yī)藥前沿(2020年29期)2020-12-04
山西醫(yī)科大學學報(2020年8期)2020-09-16
三農資訊半月報(2020年11期)2020-06-21
