周 順，王 勇，張 峰，游 偉

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽中心，江蘇 南京 210029

肝臟缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷可發(fā)生于部分肝切除術(shù)后、肝移植以及各種原因?qū)е碌男菘?，是術(shù)后器官功能恢復(fù)遲緩甚至出現(xiàn)衰竭的重要原因［1］。肝臟IR 損傷發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的無菌性免疫炎癥反應(yīng)在其中扮演了極其重要的角色［2-3］。大量研究證實(shí)了外周來源的巨噬細(xì)胞（infiltrating macrophage，iM?）在IR后被募集入肝臟介導(dǎo)繼發(fā)性炎性反應(yīng)從而加重肝臟IR 損傷［4-5］。

神經(jīng)損傷誘導(dǎo)蛋白1（nerve injury?induced pro?tein 1，Ninj1）是最初發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)損傷時(shí)施旺細(xì)胞中的一種黏附分子［6］，以后的研究發(fā)現(xiàn)其在單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及多種組織中均有不同程度的表達(dá)［7］。最近研究表明，Ninj1能夠調(diào)控外周單核細(xì)胞向炎癥區(qū)域遷移的能力，參與調(diào)控體內(nèi)多種炎癥反應(yīng)。多發(fā)性硬化癥患者外周單核細(xì)胞中Ninj1的表達(dá)上調(diào)與其越過血腦屏障遷移至中樞神經(jīng)有關(guān)，并且在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimen?tal allergic encephalomyelitis，EAE）的小鼠模型中，抑制Ninj1的表達(dá)能明顯減少腦組織中巨噬細(xì)胞的浸潤，減輕炎癥反應(yīng)，改善組織病理學(xué)指標(biāo)［8］。在小鼠結(jié)腸炎模型中，髓系特異性敲除Ninj1 的小鼠腸道炎癥較野生型小鼠明顯減輕［9］。

目前，Ninj1 在肝臟IR 損傷中肝內(nèi)炎癥反應(yīng)的作用尚未見報(bào)道。本研究收集肝部分切除術(shù)中行肝門阻斷以及未行肝門阻斷的患者術(shù)前及術(shù)后的外周血標(biāo)本，提取外周單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）并分析Ninj1 在兩組患者PBMC中的表達(dá)情況，進(jìn)一步建立小鼠肝臟IR模型，采用小干擾RNA（small interfering，siRNA）特異性敲低巨噬細(xì)胞中Ninj1的表達(dá)，探討Ninj1在肝臟IR后炎癥反應(yīng)中的作用和機(jī)制，為臨床防治肝臟IR損傷提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

冷凍離心機(jī)（Eppendorf 公司，德國）；ABI Prism7900 熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems 公司，美國）；SDS?PAGE 電泳儀、酶標(biāo)儀（Bio?Rad 公司，美國）；顯微鏡（Leica公司，德國）；化學(xué)發(fā)光檢測儀（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；TRIzol（Invi?trogen公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Mas?ter、定量PCR 試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海Beyotime 公司）；胰蛋白酶（Sigma Aldrich 公司，美國）；蛋白裂解液RIPA（Cell Signaling 公司，美國）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（InvivoGen 公司，美國）；TNF?α ELISA 試劑盒、IL?6 ELISA試劑盒、IL?1β ELISA試劑盒（eBioscience公司，美國）；Ninj1?siRNA、Non?specific siRNA、siR?NA 轉(zhuǎn)染試劑盒（Santa Cruz Biotechnology 公司，美國）；兔抗人Ninj1一抗、羊抗兔二抗（Abcam公司，美國），兔抗人GAPDH一抗（Cells Galing公司，美國）。

雄性C57BL/6小鼠60只，6～8周齡（南京江蘇集萃藥康生物科技有限公司），飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。在建立模型之前，小鼠至少在動(dòng)物房飼養(yǎng)1周。飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度20～25 ℃，濕度50%左右，正常晝夜更替，12 h 光照/12 h 無光照交替進(jìn)行的方式模擬，自由飲水進(jìn)食。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范執(zhí)行。

1.2 方法

1.2.1 人PBMC的提取

肝門阻斷組患者6例，年齡（61.3±4.6）歲，5例原發(fā)性肝癌，1例肝臟炎性組織增生，手術(shù)方式均為肝部分切除術(shù)，術(shù)中行第一肝門阻斷；對(duì)照組患者6例，年齡（58.9±6.7）歲，均為原發(fā)性肝癌，5例行肝部分切除術(shù)，1例行腹腔鏡下肝部分切除術(shù)，術(shù)中未行肝門阻斷。分別于術(shù)前、術(shù)后第1、3 天采集患者外周血行天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate amino?transferase，AST）檢測。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者并知情同意。

肝部分切除術(shù)前1 h 和術(shù)后6 h 采集患者外周血標(biāo)本。用PBS 按照1∶2 的比例稀釋外周血，將稀釋好的外周血小心加入到含有5 mL Ficoll淋巴細(xì)胞分離液的15 mL離心管中。室溫下2 000 r/min離心20 min。離心結(jié)束，小心取出離心管，離心管分成3 層，上層為血漿，下層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，中層為淋巴細(xì)胞分離液，上層與中層之間有一白色云霧層，即為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。移液槍插入云霧層，小心吸取。PBS洗滌2次，用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，收集PBMC。

1.2.2 小鼠分組和IR手術(shù)方法

分組：假手術(shù)組（Sham 組）、IR 組、IR+NS（Non?specific）?siRNA組、IR+Ninj1?siRNA組。

IR 模型手術(shù)方法：水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，將小鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，碘伏、酒精消毒2 遍。取腹正中切口，剪開皮膚，經(jīng)腹白線剪開腹膜。小拉鉤充分暴露術(shù)野，生理鹽水浸潤棉簽，充分顯露肝臟左葉、中葉，小心剪開肝胃韌帶，游離第一肝門，用無損傷血管夾夾閉肝左、中葉脈管共干，觀察肝臟缺血情況，計(jì)時(shí)。關(guān)腹縫合，將小鼠置于保溫毯上，維持麻醉狀態(tài)和體溫。缺血90 min 后，再次開腹，小心松開無損傷血管夾，恢復(fù)肝臟血流。關(guān)腹縫合，恢復(fù)血流后6 h 收集下腔靜脈血和缺血的肝臟組織標(biāo)本。假手術(shù)（Sham）組基本操作相同，但只游離第一肝門，并不進(jìn)行夾閉。

1.2.3 小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶檢測

1 mL 注射器采取小鼠下腔靜脈血，轉(zhuǎn)入含有EDTA 抗凝劑的離心管中，室溫下7 000 r/min 離心8 min，收集上層血清樣品。取50 μL血清采用自動(dòng)生化檢測儀檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和AST的水平。剩余血清樣本置入-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 肝臟組織樣本病理學(xué)檢測

HE 染色：剪成小塊型的肝臟組織樣本放入4%多聚甲醛溶液中固定，脫水后石蠟包埋。將石蠟包埋后的組織切成4 μm厚度置于載玻片中，進(jìn)行蘇木精?伊紅（HE）染色，中性樹膠封片固定，顯微鏡下觀察。肝臟損傷程度采用Suzuki’s 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（0～4 分）進(jìn)行分析。判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)有無肝細(xì)胞壞死、肝竇充血、淤血，小葉中心水腫等進(jìn)行評(píng)判。

免疫組化：小鼠肝臟標(biāo)本切片后用二甲苯浸泡2次，每次10 min，利用不同濃度梯度乙醇分別浸泡5 min 進(jìn)行水化。清洗3 次后在抗原修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)。3%雙氧水?甲醇溶液處理切片15 min。CD11b 染色按照試劑盒操作說明進(jìn)行，染色結(jié)果中CD11b+巨噬細(xì)胞被染成黃褐色，200 倍鏡下取6～8個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 骨髓來源巨噬細(xì)胞（bone marrow derived mac?rophages，BMDM）的分離培養(yǎng)和LPS刺激

將6～8 周齡的雄性小鼠腹腔注射120 μL 的5%水合氯醛麻醉后，脫頸處死。置入70%乙醇中浸泡5 min消毒。無菌剪刀剪開雙側(cè)后肢皮膚，將皮膚分離至髖關(guān)節(jié)，小心離斷髖關(guān)節(jié)，取下雙側(cè)后肢。將供體雙側(cè)后肢移至超凈工作臺(tái)，去除肌肉組織，仔細(xì)剝離出脛骨和股骨。用無菌注射器吸取完全培養(yǎng)基插入骨髓腔，反復(fù)沖洗骨髓腔，將骨髓移入離心管，移液槍反復(fù)混勻細(xì)胞。放入離心機(jī)，1 200 r/min離心5 min，取下層細(xì)胞，PBS 重懸，顯微鏡下計(jì)數(shù)。將骨髓細(xì)胞用紅細(xì)胞裂解液處理3 min，再將骨髓細(xì)胞按照2×104個(gè)/皿的密度分入10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入含有20%的L929 上清配制的完全DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d，用含有20%的L929 上清配制的完全DMEM培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。PBS清洗2遍，用0.25%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，重新鋪板，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。LPS 組用含有500 ng/mL LPS 的完全DMEM培養(yǎng)基刺激6 h，對(duì)照組（PBS組）用含同等體積的PBS 完全DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h。PBS 清洗2 遍，用0.25%的胰酶消化貼壁細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 RT?PCR實(shí)驗(yàn)

取適量肝組織或者BMDM，采用TRIzol 兩步法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，定量PCR分析Ninj1和炎性因子的mRNA表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)見表1。

1.2.7 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

人PBMC 或者小鼠BMDM 加入1 mL 預(yù)冷的蛋白裂解液研磨均勻后冰上靜置30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。SDS?PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉，一抗4 ℃搖床孵育過夜，電泳緩沖液洗膜3次，每次10 min，二抗孵育2 h，加入電化學(xué)發(fā)光試劑顯影，檢測Ninj1蛋白表達(dá)水平。

1.2.8 siRNA干擾

體外：將體外誘導(dǎo)成功的小鼠原代BMDM用胰蛋白酶消化，鏡下計(jì)數(shù)，按2×104個(gè)/孔重新鋪至6孔板，用無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。按照siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行體外siRNA轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組為：PBS 組、LPS 組、LPS+NS?siRNA 組、LPS+Ninj1?siRNA組。

體內(nèi)：巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)甘露糖受體，采用甘露糖偶聯(lián)聚合體為載體，將NS?siRNA 和Ninj1?siRNA 與甘露糖偶聯(lián)聚合體混合靜置20 min，在建立缺血再灌注模型4 h之前按照2 mg/kg通過尾靜脈高壓注射入小鼠體內(nèi)，以達(dá)到體內(nèi)特異性干擾巨噬細(xì)胞的目的。

1.2.9 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)ELISA

取細(xì)胞培養(yǎng)上清，上清中細(xì)胞因子IL?6、TNF?α、IL?1β采用美國eBioscience 公司的ELISA 試劑盒檢測，實(shí)驗(yàn)步驟遵照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行比較，組間比較采用LSD?t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝部分切除術(shù)患者術(shù)前、術(shù)后肝功能以及PBMC中Ninj1表達(dá)水平的比較

兩組患者的肝功能如圖1A 所示，與對(duì)照組相比，肝門阻斷組患者術(shù)后第1天AST有增高趨勢，但兩組患者術(shù)前、術(shù)后AST的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

RT?PCR結(jié)果顯示，肝門阻斷組患者術(shù)后PBMC中Ninj1的基因表達(dá)水平較術(shù)前明顯上調(diào)（P＜0.05，圖1B）。免疫印跡實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，肝門阻斷組患者術(shù)后PBMC 中Ninj1 的蛋白表達(dá)水平與術(shù)前相比明顯增高（P＜0.05），而對(duì)照組患者PBMC 中Ninj1 的表達(dá)無明顯變化（圖1C），提示外周單核細(xì)胞中Ninj1參與肝臟IR損傷的過程。

2.2 體外干擾Ninj1 的表達(dá)對(duì)LPS 誘導(dǎo)的小鼠BM?DM炎性反應(yīng)的影響

體外LPS刺激小鼠BMDM后，Ninj1的蛋白表達(dá)水平較PBS 組明顯增高（圖2A）。RT?PCR 和ELISA的結(jié)果均證實(shí)LPS刺激能誘導(dǎo)BMDM分泌大量炎癥因子（IL?6、TNF?α、IL?1β）（圖2B）。而與LPS 組相比，Ninj1?siRNA+LPS 組的BMDM 分泌的炎癥因子明顯減少（P＜0.05）。

2.3 體內(nèi)特異性干擾巨噬細(xì)胞Ninj1的表達(dá)對(duì)肝臟IR損傷的作用

IR 后小鼠血清ALT 和AST 的水平較Sham 組明顯增高（圖3A、B）。HE染色顯示，IR組肝臟組織結(jié)構(gòu)的損傷明顯（圖3C）。與IR組相比，Ninj1?siRNA+IR 組HE 染色和Suzuki’s評(píng)分均提示肝臟組織的損傷明顯減輕（圖3C、D），并且ALT和AST水平顯著降低（P＜0.05，圖3A、B）。

2.4 體內(nèi)特異性干擾巨噬細(xì)胞Ninj1 對(duì)IR 后炎癥反應(yīng)的影響

與Sham 組相比，肝臟IR 后體內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯激活，表現(xiàn)為IR組肝臟內(nèi)CD11b+巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，肝組織中炎性因子的mRNA 水平顯著升高，血清中炎性因子的分泌顯著增多（圖4）。而與IR組相比，Ninj1?siRNA+IR 組中上述炎性指標(biāo)均明顯下降（P＜0.05）。

3 討論

肝臟IR損傷的發(fā)生機(jī)制非常復(fù)雜，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的先天免疫在其中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。在肝臟的缺血期，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞由于缺血缺氧直接受損，釋放出損傷相關(guān)分子模式（damage?associated molecular pattern，DAMP）激活肝枯否細(xì)胞（Kupffer cells，KC）啟動(dòng)肝內(nèi)炎癥反應(yīng)；在肝臟的再灌注期，激活的KC 釋放出大量的炎性因子和趨化因子，趨化外周的單核細(xì)胞遷移入肝，進(jìn)一步加重肝內(nèi)的炎性損傷［10-11］。Ninj1 是一種表達(dá)于外周單核細(xì)胞的黏附分子，在多種炎性疾病的模型中被證實(shí)與外周單核細(xì)胞的遷移和炎性反應(yīng)有關(guān)［12-16］。因此，本研究的著重點(diǎn)在于外周來源的巨噬細(xì)胞中Ninj1在肝臟IR損傷中調(diào)控炎性反應(yīng)的作用。

圖3 各組小鼠血清ALT、AST及肝臟損傷程度的比較。Figure 3 Comparison of levels of ALT and AST and degree of liver IR injury among different groups

首先，分析了肝部分切除術(shù)中肝門阻斷組與對(duì)照組患者術(shù)前及術(shù)后肝功能的變化，結(jié)果顯示術(shù)后第1 天，肝門阻斷組患者的AST 較對(duì)照組有增高的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與病例數(shù)較少有關(guān)。進(jìn)一步分析了兩組患者術(shù)前和術(shù)后PBMC中Ninj1 的表達(dá)情況，結(jié)果與預(yù)想的一致，肝門阻斷后患者PBMC中的Ninj1表達(dá)顯著增高，而對(duì)照組患者中Ninj1 的表達(dá)無明顯變化，提示肝臟IR 能激活外周單核細(xì)胞Ninj1 的表達(dá)，但是其與繼發(fā)的免疫炎癥反應(yīng)有無關(guān)系尚不清楚。

PBMC中含有多種細(xì)胞類型，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）［17］。Choi等［7］的研究顯示，在正常人PBMC 中Ninj1僅少量表達(dá)于B 淋巴細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞，但是在利用抗CD3抗體和IL?2體外激活后的人PBMC中，CD68+巨噬細(xì)胞和CD83+DC 細(xì)胞中Ninj1 的表達(dá)顯著增高，而在淋巴細(xì)胞中的表達(dá)無顯著性差異，提示Ninj1 在炎性反應(yīng)中的作用主要通過單核細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果也表明，在接受第一肝門阻斷的肝部分切除術(shù)患者中，肝臟IR 同樣能夠激活PBMC 中Ninj1 的表達(dá)，提示Ninj1 可能在肝臟IR 后繼發(fā)的炎性損傷中發(fā)揮重要的作用。

以往的研究表明，在體外LPS 刺激人微血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞可明顯上調(diào)2 種細(xì)胞中Ninj1 的表達(dá)，并且抑制Ninj1 的表達(dá)，進(jìn)而通過TLR4 受體信號(hào)通路減輕敗血癥小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和器官損傷［15］。與上述研究結(jié)果相似，本研究在體外利用LPS 刺激小鼠BMDM 發(fā)現(xiàn)Ninj1 的表達(dá)明顯上調(diào)，siRNA 干擾實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ninj1 的表達(dá)增加與巨噬細(xì)胞的促炎性反應(yīng)密切相關(guān)。Ahn等［18］研究表明，Ninj1促進(jìn)BMDM 膜突觸的形成，增強(qiáng)其遷移能力，從而促進(jìn)BMDM 穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入炎癥組織中。事實(shí)上，本研究的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明，敲低巨噬細(xì)胞中Ninj1的表達(dá)能明顯減少IR后肝臟組織中CD11b+巨噬細(xì)胞的數(shù)量，這種現(xiàn)象是否與外周巨噬細(xì)胞的遷移能力減弱有關(guān)有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，肝臟IR能顯著激活人PBMC中Ninj1的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞中Ninj1 的表達(dá)能明顯減輕小鼠肝臟IR 損傷以及肝內(nèi)的炎性反應(yīng)，提示Ninj1可能成為防治肝臟IR損傷新的作用靶點(diǎn)。