劉詠梅　丁悅　張柯

關(guān)鍵詞：黃原膠;野油菜黃單胞菌;蔗糖;低色素

黃原膠（xanthan gum）是以碳水化合物為生產(chǎn)原料，由黃單胞菌發(fā)酵形成的一種生物高分子多糖[1]。黃原膠常被制成懸浮劑、乳化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑，擁有良好的市場(chǎng)前景，在醫(yī)藥、食品工業(yè)、石油開采等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用[2-3]。

黃原膠無味、無毒，是安全的固體粉末，不溶于乙醇或者丙酮，有較好的水溶性，溶解于水中呈現(xiàn)為透明狀的膠體[4]。黃原膠分子的結(jié)構(gòu)D-甘露糖上有乙酸和丙酮酸結(jié)構(gòu)，三糖側(cè)鏈連在每一個(gè)葡萄糖上，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)特殊，所以擁有諸多良好的性質(zhì)，如高黏性，對(duì)酸、堿、酶的穩(wěn)定性以及耐高溫穩(wěn)定性[5-6]。

本實(shí)驗(yàn)通過連續(xù)培養(yǎng)的方式獲得一株細(xì)胞壁缺陷型野油菜黃單胞菌突變株。黃原膠發(fā)酵常受到色素含量高、純化成本高的制約[7-9]。該菌具有發(fā)酵產(chǎn)黃原膠過程中色素含量低的優(yōu)點(diǎn)，本研究采用該菌株為出發(fā)菌株，考察最優(yōu)發(fā)酵條件。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌種

野油菜黃單胞菌（xanthomonas campestris）1.1781購于中國(guó)普通微生物保藏管理中心。野油菜黃單胞菌（xanthomonas campestris）1.1781細(xì)胞壁缺陷型突變株，由本研究室馴化并保存。

1.2 試劑

蔗糖、碳酸鈣（國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭鞍纂?，高核酸酵母，牛肉浸膏，瓊脂?/p>

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：牛肉浸膏2.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，蔗糖10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH為7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖70.0 g/L，碳酸鈣0.5 g/L，高核酸酵母1.0 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，pH為7.0。

1.4 儀器與設(shè)備

烘箱、電子天平（RP5002K）、凈化工作臺(tái)（SW-CJ-1D）、離心機(jī)（H1850）、搖瓶柜（HYL-A）、手提式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-SG46-2805A）、生化培養(yǎng)箱（SPX-100B-Z）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)方法

將菌種接入斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h備用。在無菌條件下，取一環(huán)菌體，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h。

2.2 菌體濕重

取20 mL發(fā)酵液，添加無菌水至50 mL，搖勻后離心（6 000 r/min，10 min）。棄上清液，收集菌體，將離心管在紙巾上倒置10 min，稱取濕重。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 不同碳源

黃原膠的產(chǎn)量和質(zhì)量與碳源的種類﹑加入量有直接的關(guān)系[8-9]?？疾觳煌荚丛邳S原膠發(fā)酵過程中對(duì)產(chǎn)膠量的影響，采用（NH₄）₂HPO₄作為氮源，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入蔗糖、果糖、葡萄糖、甘油、甘露醇作為碳源，裝液量50 mL，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h后測(cè)定產(chǎn)量。

2.3.2 不同氮源

采用蔗糖為碳源，分別考察不同氮源[牛肉浸膏、酵母粉、（NH₄）₂HPO₄、蛋白胨、高核酸酵母]對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。培養(yǎng)條件同2.3.1。

2.3.3 初始pH

配制20 mmol/L的Na₂HPO₄·12H₂O和NaH₂PO₄·2H₂O緩沖溶液，分別配制pH為6.6、6.8、7.0、7.2、7.4的緩沖液直接用于發(fā)酵培養(yǎng)基配制?？疾觳捎?0 mmol/L不同pH磷酸緩沖液配制培養(yǎng)基對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響。

3 結(jié)果與討論

3.1 菌體生長(zhǎng)曲線

在30 ℃、200 r/min條件下測(cè)定菌體生長(zhǎng)曲線。每10 h取樣一次，觀察測(cè)定菌體質(zhì)量濃度，收集數(shù)據(jù)并繪制菌體生長(zhǎng)曲線（見圖1）。由圖1可知，30 h之前生長(zhǎng)迅速，之后菌體生長(zhǎng)變慢，進(jìn)入穩(wěn)定期。后續(xù)采用培養(yǎng)時(shí)間為20 h左右、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)膠實(shí)驗(yàn)。

3.2 碳源對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

野油菜黃單胞菌（xanthomonas campestris）1.1781細(xì)胞壁缺陷型突變株可利用多種碳源發(fā)酵產(chǎn)黃原膠。該菌對(duì)低分子質(zhì)量糖類碳源的利用效果較好、產(chǎn)量較高，轉(zhuǎn)化率較高的是蔗糖與葡萄糖（見表1）。

3.3 氮源對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

采用蔗糖為碳源，分別考察不同氮源[牛肉浸膏、酵母粉、（NH₄）₂HPO₄、蛋白胨、高核酸酵母]對(duì)黃原膠發(fā)酵的影響。黃原膠發(fā)酵分為兩個(gè)階段，第一階段為菌體生長(zhǎng)階段，當(dāng)培養(yǎng)基中的氮源耗盡后，進(jìn)入發(fā)酵產(chǎn)膠階段。合適的氮源除了利于菌體的生長(zhǎng)，還有利于合成黃原膠代謝過程所需酶類或者富含代謝途徑中酶催化反應(yīng)前體物質(zhì)。

氮源采用高核酸酵母時(shí)，產(chǎn)量最高，其次為（NH₄）₂HPO₄（見圖2）。高核酸酵母含有較多核酸類物質(zhì)，有利于產(chǎn)物的合成。采用（NH₄）₂HPO₄為氮源時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)pH為5.8，較其他幾種氮源高。pH下降幅度較低，有利于代謝途徑中酶類保持活性。

3.4 初始pH對(duì)黃原膠產(chǎn)量的影響

丙酮酸的合成和CO₂氣體的放出會(huì)影響黃原膠的產(chǎn)量與糖基的活性，有數(shù)據(jù)表明，黃原膠更適合在中性培養(yǎng)環(huán)境下發(fā)酵生長(zhǎng)[10]。采用磷酸鹽配制不同pH的緩沖液用于黃原膠發(fā)酵，當(dāng)pH為7.2時(shí)，黃原膠的產(chǎn)量最高（見圖3）。