董春燕 盧永超 劉海英 徐子琪 張韶君

1 濱州醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 山東 煙臺(tái) 264003；2 千佛山醫(yī)院口腔科 山東 濟(jì)南 250001

牙周病是口腔常見疾病，在牙周致病菌刺激下，大量炎癥因子激活炎性反應(yīng)的過程打破了骨改建的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，從而造成機(jī)體成骨能力下降和牙周骨組織損傷[1]。目前對(duì)于該疾病的治療和缺損骨組織的修復(fù)仍未解決。近年來，許多學(xué)者將目光投向再生醫(yī)學(xué)方向，希望通過干細(xì)胞的手段進(jìn)行骨缺損的再生。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)免疫原性低，具備再生和修復(fù)功能，是牙周組織再生良好的種子細(xì)胞[2-3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)具有較強(qiáng)自我更新和多向分化潛能[4]，并且其取材方便、來源廣泛，成為骨組織工程較理想的來源細(xì)胞[5]。干細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)控對(duì)于牙周組織的再生非常重要[6-7]，但是在牙周炎患者的牙周支持組織中，炎癥的持續(xù)存在會(huì)影響MSCs的成骨分化，所以很難實(shí)現(xiàn)喪失的骨組織重建[8]。姜黃素為中藥姜黃的主要活性成分，因其安全的藥理活性被應(yīng)用于骨質(zhì)疏松癥的治療[9]。姜黃素對(duì)于炎癥環(huán)境下BMSCs骨向分化能力的影響研究較少，本研究使用腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)建立體外炎癥微環(huán)境，觀察姜黃素對(duì)炎癥環(huán)境下大鼠細(xì)胞的增殖情況的影響，用礦化結(jié)節(jié)染色等方法進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，揭示炎癥微環(huán)境對(duì)BMSCs成骨分化的影響，以便后期進(jìn)一步研究其可能的調(diào)控機(jī)制，為牙周炎的治療和防治提供思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 4周齡wistar雄性大鼠(山東省千佛山醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、雙抗(100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)、α-MEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶(HyClone，美國)；胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS；Gibco，美國)；姜黃素、維生素 C、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、吲哚美辛、胰島素、IBMX、茜素紅染色液、飽和油紅O染液、氯化十六烷吡啶、Trizol試劑(Sigma-Aldrich，美國)；堿性磷酸酶染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(Dojindo公司，日本)；HiScript ?ⅢRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量聚合酶鏈檢測(cè)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Spectro公司，德國)；LightCycler480 PCR儀(Roche，瑞士)。

1.2 BMSCs的培養(yǎng)及多向分化能力檢測(cè) 全骨髓細(xì)胞貼壁法培養(yǎng)獲得Wistar大鼠BMSCs，第三代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞以2.0×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，接種后加入完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24 h后棄去培養(yǎng)基，分別加入成骨誘導(dǎo)液(含有地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、維生素C 50 mg/L的α-MEM完全培養(yǎng)基)和成脂誘導(dǎo)液(含1 μmol/L 地塞米松、200 μmol/L 吲哚美辛、10 mg/L胰島素及500 μmol/L IBMX的α-MEM培養(yǎng)液)，每3 d換液 1 次。成脂誘導(dǎo)2周后，進(jìn)行油紅O染色；成骨誘導(dǎo)3周后，進(jìn)行茜素紅染色。

1.3 細(xì)胞分組 取第三代細(xì)胞，分為正常組、炎癥組和姜黃素+炎癥組。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及前期實(shí)驗(yàn)[10]選用10 ng/mL TNF-α處理BMSCs進(jìn)行炎癥誘導(dǎo)。利用CCK8分別檢測(cè)1、3、5 d 姜黃素(0.01、0.1、1、10 μmol/L)對(duì)細(xì)胞活性的影響進(jìn)行姜黃素濃度的選擇。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板中，加入常規(guī)培養(yǎng)液放入恒溫培養(yǎng)箱。貼壁24 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同處理，每個(gè)樣本設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每2天更換1次培養(yǎng)液，分別于培養(yǎng)的1、3、5 d，吸凈96孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔加入10 μL CCK8溶液和90 μL無血清培養(yǎng)基，將孔板繼續(xù)孵育1 h后，酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。

1.5 ALP染色及茜素紅染色檢測(cè)細(xì)胞骨向分化能力 將細(xì)胞以2.0×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，貼壁24 h后，按實(shí)驗(yàn)分組方案更換成骨誘導(dǎo)液體外培養(yǎng)細(xì)胞，每3 d換液一次。于成骨誘導(dǎo)的第7天行堿性磷酸酶染色；在第14天進(jìn)行茜素紅染色，觀察細(xì)胞礦化情況，并用十六烷基吡啶水溶液溶解成骨染色結(jié)節(jié),將一定量的各組溶解液置于96孔板內(nèi)，在562 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光光度值。

1.6 RT-PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá) 將細(xì)胞以2.0×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，貼壁24 h后按照不同分組方案繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞14 d。應(yīng)用 TRIzol 試劑并參照試劑盒說明書分別提取細(xì)胞總RNA，利用HiScript ?ⅢRT反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。使用SYBR Green熒光定量聚合酶鏈檢測(cè)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，分別檢測(cè)骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的mRNA的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參基因，據(jù)2-△△CT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。引物由鉑尚生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs培養(yǎng) 倒置顯微鏡下見，培養(yǎng)3 d后大部分BMSCs貼壁，呈現(xiàn)多角形、長(zhǎng)梭形；約7 d后，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿約80%(圖1A)。到第3代細(xì)胞形態(tài)較為均一，無自發(fā)性分化現(xiàn)象。對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)后，茜素紅染色可見鈣化現(xiàn)象(圖1B)；成脂誘導(dǎo)后油紅O染色可見脂滴形成(圖1C)。

A.原代BMSCs培養(yǎng)7 d(×40)；B.茜素紅染色(×40)；C.油紅O染色(×100)

2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 0.01、0.1、1 μmol/L 姜黃素對(duì)炎癥狀態(tài)下大鼠BMSCs的增殖無明顯影響，各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在10 μmol/L姜黃素作用下，細(xì)胞增殖能力明顯下降，P<0.01，見圖2。故本研究選擇1 μmol/L姜黃素濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

與炎癥組比較，**P<0.01。

2.3 ALP及茜素紅染色 經(jīng)過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，染色結(jié)果顯示三組細(xì)胞均有成骨分化特性，炎癥組較正常組染色變淺、礦化結(jié)節(jié)減少；姜黃素+炎癥組染色加深、礦化結(jié)節(jié)增多(圖3、4)。

圖3 各組大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞堿性磷酸酶染色

與炎癥組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 qRT-PCR檢測(cè)BSP、Runx2 mRNA表達(dá)情況 成骨誘導(dǎo)后14 d，炎癥組BSP、Runx2的基因表達(dá)水平均低于正常組，P<0.01；姜黃素+炎癥組可促進(jìn)炎癥微環(huán)境下BMSCs細(xì)胞BSP、Runx2 mRNA表達(dá)，P<0.05，見圖5。

與炎癥組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

牙周炎主要是由局部因素引起的牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，其始動(dòng)因子是口腔致病微生物[10]。正常的牙周組織處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)細(xì)菌感染時(shí)，牙周袋內(nèi)細(xì)菌分泌的毒素及代謝產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，若炎癥得不到及時(shí)控制，炎癥可擴(kuò)散到深層牙周膜、牙槽骨和牙骨質(zhì)，破壞平衡狀態(tài)，打破骨改建的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，造成牙槽骨的吸收[11-12]。在這種炎癥持續(xù)存在的情況下，骨質(zhì)的重建非常困難。到目前為止，沒有抑制牙周炎引起牙槽骨喪失的理想藥物。為實(shí)現(xiàn)缺損牙槽骨的再生，需探究新的方法來提高炎癥狀態(tài)下的成骨分化能力。

BMSCs是一種來源于中胚層的具有多向分化潛能和自我更新能力的干細(xì)胞，可促進(jìn)牙槽骨的再生、加速牙周疾病的好轉(zhuǎn)乃至愈合，在組織損傷修復(fù)的治療中有著廣泛的應(yīng)用前景，成為目前進(jìn)行基因治療、干細(xì)胞治療以及骨組織工程的理想種子細(xì)胞[13]。牙周炎患者的牙周炎癥微環(huán)境降低了BMSCs的骨性分化能力，影響牙周組織的再生[14]。因此，提高BMSCs的成骨分化率已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，對(duì)牙周病的防治乃至整個(gè)骨組織工程的研究都具有重要意義。

TNF-α是牙周炎患者牙周組織中存在的一種主要促炎因子，在牙周病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用[15-16]，并且TNF-α 可以激活 NF-κb 通路，使炎癥、增殖和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[17]，所以其可以作為誘導(dǎo)劑誘發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生炎癥。本研究通過在BMSCs中加入10 ng/mL的 TNF-α，誘發(fā)BMSCs炎癥反應(yīng)，模擬牙周炎時(shí)骨質(zhì)所處的炎癥微環(huán)境，建立骨細(xì)胞凋亡模型[18]。

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)等的根莖中提取的有效成分，是一種植物多酚類化合物質(zhì)，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降糖等多種藥理活性[19]。姜黃素在骨代謝過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[20]，不但可以抑制破骨細(xì)胞的形成，減少骨吸收，還可以促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成，增加骨密度，減輕骨質(zhì)疏松癥狀[20]。Bharti等[21]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素抑制破骨細(xì)胞前體中NF-κb配體誘導(dǎo)的NF-κb活化的受體活化劑，并抑制破骨細(xì)胞生成。李廣悅等[22]的研究顯示，姜黃素可減少LPS引發(fā)的成骨細(xì)胞的凋亡，改善骨形成能力。姜黃素作用于細(xì)胞的濃度不同，對(duì)成骨及破骨的研究結(jié)果亦會(huì)產(chǎn)生較大的出入。為探討姜黃素對(duì)炎癥狀態(tài)下大鼠BMSCs的骨向分化作用，本研究首先用不同濃度的姜黃素處理大鼠BMSCs，檢測(cè)細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)1 μmol/L的姜黃素干預(yù)處理，觀察到其對(duì)炎癥狀態(tài)下大鼠BMSCs的增殖無明顯影響。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，通過ALP、茜素紅染色及qRT-PCR檢測(cè)成骨分化水平的變化表明，炎癥微環(huán)境下BMSCs的成骨分化能力降低，而姜黃素則會(huì)在一定程度上改善炎癥狀態(tài)下抑制的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力。

綜上所述，姜黃素在一定程度上可以增強(qiáng)炎癥微環(huán)境下BMSCs的骨向分化能力，姜黃素對(duì)細(xì)胞的炎癥保護(hù)作用及促進(jìn)其在炎癥狀態(tài)下骨向分化的具體機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。