宋婷婷 張會(huì)芳 韓玉貞

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科 山東 濱州 256603

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，非特殊型浸潤性癌是最常見的組織學(xué)類型。對(duì)于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌，盡管其術(shù)后行內(nèi)分泌治療、分子靶向治療和放化療等綜合治療，但有些預(yù)后仍較差。乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenases 1，ALDH1)是乳腺癌干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其高表達(dá)與乳腺癌預(yù)后不良有關(guān)[1-2]。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)中起誘導(dǎo)作用，乳腺癌EMT的發(fā)生使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有乳腺癌干細(xì)胞的特性[3]。TGF-β1的表達(dá)與乳腺癌的惡性進(jìn)展及不良預(yù)后有關(guān)[4]。有關(guān)ALDH1和TGF-β1的研究大多集中于乳腺原發(fā)癌，然而由于腫瘤基因的變異和腫瘤進(jìn)展，乳腺轉(zhuǎn)移癌中ALDH1和TGF-β1的表達(dá)與原發(fā)癌相比，可能存在差異。本研究擬探討ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原發(fā)癌和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)情況及對(duì)判斷預(yù)后的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集我院病理科2011年1月至2016年12月間行乳腺癌改良根治術(shù)的病例，納入隨訪資料完備的197例伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的非特殊型浸潤性乳腺癌患者作為研究對(duì)象。所有患者均為女性，術(shù)前均未接受新輔助治療，入選病例隨訪至2020年6月，中位隨訪期為47個(gè)月。

1.2 抗體與試劑 ALDH1A1兔抗人單克隆抗體(bs-10162R)、TGF-β1兔抗人單克隆抗體(bs-0103R)及SP免疫化學(xué)試劑盒(SP-0023)均購于博奧森公司，DAB顯色試劑盒、免疫組化抗原修復(fù)液均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組化染色 10%中性福爾馬林溶液固定的石蠟標(biāo)本按3 μm連續(xù)切片，將載玻片放置64℃烤箱中烘烤1 h，再進(jìn)行二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，自來水沖洗，PBS緩沖液沖洗，高溫高壓抗原修復(fù)，PBS沖洗，3%H2O2孵育，PBS沖洗，滴加正常山羊血清工作液孵育，加入一抗(ALDH1A1濃度為1∶100、TGF-β1濃度為1∶200)后4℃過夜，放置37℃恒溫箱中復(fù)溫30 min，PBS沖洗，滴加山羊抗兔二抗孵育30 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育30 min，PBS沖洗后DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時(shí)間并及時(shí)終止，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。以PBS緩沖液代替一抗作為空白對(duì)照組，以已知陽性片作為陽性對(duì)照組。

1.4 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果判定參照Kawasaki等[5]報(bào)道的方法，從著色強(qiáng)度和著色范圍兩方面綜合判定。著色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分；淡黃色為1分；黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細(xì)胞比例評(píng)分:<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。兩個(gè)結(jié)果相加計(jì)分，<2分為(-)；2～3分為(+)；4～5分為(++)；6～7分為(+++)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果將0～3分定義為陰性，4～7分定義為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩個(gè)變量之間的相關(guān)性采用Spearman的相關(guān)分析法；應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線并用Log-rank檢驗(yàn)做各組生存率比較；單因素和多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ALDH1A1和TGF-β1的免疫組化結(jié)果 ALDH1A1和TGF-β1均表達(dá)于細(xì)胞漿，常呈現(xiàn)黃色至棕褐色顆粒(圖1)。

A.ALDH1A1在原發(fā)癌中的陽性表達(dá)；B.ALDH1A1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的陽性表達(dá)；C.TGF-β1在原發(fā)癌中的陽性表達(dá)；D.TGF-β1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的陽性表達(dá)。

2.2 ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原發(fā)癌和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的表達(dá) ALDH1A1和TGF-β1在原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌中均陽性和均陰性表達(dá)的一致率分別為87.82%(173/197)、86.80%(171/197)，ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原發(fā)癌和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌之間均呈正相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺原發(fā)癌與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中ALDH1A1與TGF-β1的表達(dá)

2.3 乳腺原發(fā)癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中ALDH1A1、TGF-β1的表達(dá)的生存分析Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中ALDH1A1和TGF-β1陽性組的生存率均明顯低于陰性組，P<0.05`，見圖2。

A-B.ALDH1A1和TGF-β1不同表達(dá)的原發(fā)癌患者生存曲線比較；C-D.ALDH1A1和TGF-β1不同表達(dá)的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌患者生存曲線比較。

2.4 乳腺癌臨床病理特征的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析Cox單因素分析顯示，組織學(xué)分級(jí)(P<0.05)、腫塊大小(P<0.05)、陽性淋巴結(jié)個(gè)數(shù)(P<0.001)、原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌中ALDH1A1的表達(dá)(P<0.001)和TGF-β1的表達(dá)(P<0.01)均是患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。將統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量引入Cox模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示，陽性淋巴結(jié)個(gè)數(shù)(P<0.01)、原發(fā)癌中ALDH1A1的表達(dá)(P<0.01)、轉(zhuǎn)移癌中TGF-β1的表達(dá)(P<0.05)均為患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表2。

表2 197例乳腺癌患者總生存期相關(guān)因素分析

2.5 乳腺原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌中ALDH1A1和TGF-β1的相關(guān)性分析Spearman相關(guān)性分析顯示，在原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中ALDH1A1和TGF-β1表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 乳腺原發(fā)癌及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中ALDH1A1與TGF-β1表達(dá)的相關(guān)性分析

3 討論

2003年，Al-Hajj等[6]首先從乳腺癌細(xì)胞中分離出分子表型為CD44+CD24-的細(xì)胞群，其在免疫缺陷小鼠體內(nèi)具有高致瘤性，首次提出了乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells，BCSCs)的概念。2007年，Ginestier等[7]證實(shí)約500個(gè)ALDH1陽性乳腺癌細(xì)胞即可在小鼠體內(nèi)致瘤，隨后研究發(fā)現(xiàn)在免疫缺陷小鼠體內(nèi)致瘤所需的ALDH1陽性細(xì)胞比CD44+CD24-細(xì)胞所需的數(shù)量少，表明ALDH1能更好地用于乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)記。ALDH1家族有三個(gè)亞型，分別為ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3，其中ALDH1A1活性最強(qiáng)，被研究最為廣泛[8]。ALDH1A1基因敲除后可降低乳腺癌的轉(zhuǎn)移和耐藥[9-10]。乳腺癌中ALDH1的表達(dá)與患者不良預(yù)后有關(guān)[1-2,11]。對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌[12]、肺腺癌[13]和卵巢癌[14]的研究亦顯示ALDH1的表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)。本研究表明在197例乳腺原發(fā)癌中，ALDH1A1陽性表達(dá)與總生存率有關(guān)。原發(fā)癌中ALDH1A1為患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

TGF-β信號(hào)可通過誘導(dǎo)Snail/2、ZEBI/2、ET-1、OCT4和HMGA2等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)從而促進(jìn)EMT的發(fā)生，研究表明，在腫瘤初期，TGF-β作為腫瘤生長抑制因子抑制原位腫瘤分裂和增殖，促使細(xì)胞衰老和凋亡；而在腫瘤晚期，TGF-β則促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移[15]。miR-133b作為腫瘤抑制因子，通過直接靶向抑制轉(zhuǎn)化生長因子受體(TGF-βR1)和抑制TGF-β/SMAD通路來阻斷TGF-β對(duì)EMT的誘導(dǎo)及腫瘤的轉(zhuǎn)移[16]。TGF-β高表達(dá)與乳腺癌不良預(yù)后有關(guān)[4,17]。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，乳腺原發(fā)癌中TGF-β1的高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。

乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是判斷乳腺癌預(yù)后的重要指標(biāo)。在乳腺原發(fā)癌和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中存在蛋白表達(dá)的差異。Zhao等[18]研究表明，乳腺原發(fā)癌中雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)的表達(dá)與相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)有一定差異，但具有一致性。Goicoechea等[19]研究表明，乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1，GIT1)的表達(dá)不一致，存在著異質(zhì)性。Yoshioka等[20]分析發(fā)現(xiàn)ALDH1A1在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中表達(dá)呈顯著正相關(guān)。但有研究表明，乳腺淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中ALDH1的表達(dá)與患者預(yù)后無關(guān)[21]。然而，有關(guān)ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原發(fā)癌和相應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的比較研究，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究表明，ALDH1A1和TGF-β1的表達(dá)在乳腺原發(fā)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中有一定的不一致性，但均具有明顯的相關(guān)性，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中ALDH1A1和TGF-β1的高表達(dá)均與預(yù)后不良有關(guān)。轉(zhuǎn)移癌中TGF-β1為患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

TGF-β1可以通過PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT[22]。EMT是腫瘤獲取干細(xì)胞特性的途徑[3]。TGF-β通路可調(diào)控乳腺腫瘤干細(xì)胞ALDH1亞群的表達(dá)[23]。本研究表明，不論在原發(fā)癌還是在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中ALDH1A1和TGF-β1均呈明顯的正相關(guān)。因此，我們推測TGF-β1的高表達(dá)伴有ALDH1A1的高表達(dá)，可能是TGF-β1通路調(diào)節(jié)乳腺癌EMT的過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)ALDH1陽性乳腺癌干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。