劉 慧 閆 冬 徐洋洋 李淑翠 張樹(shù)平

1 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 山東 煙臺(tái) 264003；2 濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部 山東 濱州 256603

氧化應(yīng)激是引起神經(jīng)損傷的原因之一，細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和清除不平衡會(huì)引起ROS的過(guò)度積累，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激會(huì)破壞蛋白質(zhì)、酶、脂質(zhì)等成分，損害神經(jīng)元[1]。SH-SY5Y細(xì)胞源自人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH系，此細(xì)胞能夠表達(dá)神經(jīng)元所特有的酪氨酸羥化酶、多巴胺、多巴胺-β羥化酶和多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體[2]，因此它常作為神經(jīng)元細(xì)胞模型，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病及作用機(jī)制方面的研究[3]。H2O2能夠引起組織細(xì)胞氧化損傷，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致組織細(xì)胞受損[4]。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)是調(diào)節(jié)氧化還原平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2被激活，并由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase，SOD)的活性，從而對(duì)抗氧化應(yīng)激[5]。其下游蛋白血紅素氧化酶1(Heme Oxygenase 1，HO-1)是一種重要的內(nèi)源性抗氧化防御蛋白，可以催化血紅素降解，具有抗氧化、維持細(xì)胞微循環(huán)和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用[6]。

從中藥中提取出的多種活性單體化合物對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮有益的作用。黃杞苷是中藥土茯苓中一種具有生物活性的黃酮類(lèi)化合物。中國(guó)藥典記載，土茯苓性平，除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)。土茯苓中含有的黃酮苷類(lèi)物質(zhì)包括黃杞苷、落新婦苷、白藜蘆醇等[7]。Huang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，黃杞苷通過(guò)調(diào)節(jié)果蠅肌動(dòng)蛋白(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)/Nrf2通路的功能，減輕了Aβ1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。本研究擬建立H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型，觀察黃杞苷的抗氧化損傷作用，探討其分子機(jī)制是否與Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要藥物和試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)，購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。黃杞苷(標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%)購(gòu)自森貝伽生物科技(南京)有限公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司；Nrf2抗體(ab137550)、HO-1抗體(ab13243)、Lamin B1抗體(ab65986)和辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(ab6721)均購(gòu)自Abcam公司(美國(guó))；細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒、4-甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒、DCFH-DA試劑盒、SOD活性檢測(cè)試劑盒和GSH過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司(中國(guó)，上海)。

1.2 儀器 HERAcell 240I CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；LA2-5A1型生物安全柜購(gòu)自新加坡ESCO公司；H1M全功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器有限公司；SYSTEM GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Eppendorf低溫高速離心機(jī)購(gòu)自Eppendorf AG公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇并培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，將其置于培養(yǎng)條件為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，每?jī)商鞊Q一次培養(yǎng)液，每三天傳代一次，細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合時(shí)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4 H2O2損傷模型的建立 將細(xì)胞接種在96孔板中，分為空白對(duì)照組與H2O2損傷組，共6組，每組設(shè)置6個(gè)副孔，每孔含完全DMEM培養(yǎng)基200 μL，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞完全貼壁。小心去除培養(yǎng)基，向每孔中加入H2O2終濃度為(125、200、250、500和800 μmol·L-1)的不完全DMEM培養(yǎng)基溶液200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。棄掉含有H2O2的培養(yǎng)基，向每孔中加入100 μL的MTT工作液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄掉MTT工作液，每孔加120 μL DMSO，490 nm下檢測(cè)吸光度(OD值)，以空白對(duì)照組細(xì)胞的抑制率為0 %，根據(jù)各組細(xì)胞平均OD值計(jì)算各組細(xì)胞平均抑制率，用SPSS軟件計(jì)算得到IC50值，最終確定H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h作為H2O2損傷模型的條件。

1.5 MTT法 SH-SY5Y細(xì)胞以每毫升4×104個(gè)接種于96孔板中，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分為空白對(duì)照組、模型組和給藥組，6個(gè)給藥組分別加入不同濃度黃杞苷(5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)預(yù)處理12 h后，模型組和給藥組給予H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h。采用MTT法檢測(cè)SH-SY5Y細(xì)胞存活率。

1.6 檢測(cè)SOD和GSH水平 SH-SY5Y細(xì)胞以每毫升4×104個(gè)接種于96孔板中，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，分為空白對(duì)照組、模型組和給藥組，3個(gè)給藥組分別加入黃杞苷(5、10和20 μmol·L-1)預(yù)處理12 h后，模型組和給藥組給予H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h。按照試劑盒說(shuō)明的方法準(zhǔn)備測(cè)定所需工作液，并對(duì)各組樣品進(jìn)行處理?？係OD活力以SOD活力單位表示，GSH含量以各組等量樣品勻漿中GSH濃度表示。

其中總SOD活力計(jì)算公式為：

GSH計(jì)算公式為：

1.7 流式細(xì)胞術(shù) 將SH-SY5Y細(xì)胞按每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在6孔板中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞完全貼壁。分為空白對(duì)照組、模型組和給藥組，給藥組分別加入黃杞苷(5、10和20 μmol·L-1)預(yù)處理12 h后給予H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h，模型組和給藥組只給予H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)使用DCFH-DA探針標(biāo)記的SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行ROS水平測(cè)定。用不完全DMEM培養(yǎng)基將10 mmol·L-1的DCFH工作液以1∶1 000比例稀釋為10 μmol·L-1的工作液，每管細(xì)胞中加入100 μL并置于培養(yǎng)箱中孵育20 min，離心棄上清，每管中加入4℃ PBS 100 μL吹打混勻，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)和熒光強(qiáng)度檢測(cè)。

1.8 Western Blot 將SH-SY5Y細(xì)胞按每孔5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在6孔板中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞完全貼壁。一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是分對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，黃杞苷(20 μmol·L-1)預(yù)處理6、12、24 h后，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)的影響。另一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是分對(duì)照組、模型組和給藥組，給藥組分別給予不同黃杞苷(5、10和20 μmol·L-1)預(yù)處理12 h后，模型組和給藥組用H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2的表達(dá)以及細(xì)胞漿內(nèi)HO-1的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

2.1.1 H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷濃度篩選 利用MTT法確定H2O2的損傷條件，計(jì)算各組細(xì)胞活力損失百分比和抑制率。根據(jù)MTT的活力計(jì)算IC50值，以損傷條件接近IC50與試劑配制簡(jiǎn)便為原則，最終確定H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型條件為500 μmol·L-1H2O2損傷12 h。

2.1.2 黃杞苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 先用不同濃度黃杞苷(5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞12 h，再用500 μmol·L-1H2O2孵育12 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H2O2損傷細(xì)胞12 h后，細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01)，而黃杞苷處理過(guò)的細(xì)胞，其活力明顯上升且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性趨勢(shì)，并在20 μmol·L-1處呈現(xiàn)最佳促進(jìn)濃度(P<0.01)，見(jiàn)圖2。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取5、10、20 μmol·L-1的黃杞苷作為預(yù)處理給藥濃度。

和對(duì)照組相比，**P<0.01。

和對(duì)照組相比，##P<0.01；和模型組相比，*P<0.05,**P<0.01。

2.2 黃杞苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷后SOD和GSH含量的影響 模型組H2O2孵育12 h后SH-SY5Y細(xì)胞的SOD和GSH水平顯著降低(P<0.01)，黃杞苷(5，10和20 μmol·L-1)預(yù)處理后的SH-SY5Y細(xì)胞SOD和GSH水平較模型組顯著升高(P<0.05)，如圖3所示。結(jié)果表明，黃杞苷能夠上調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞中SOD和GSH水平，減輕H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷。

A.模型組平均SOD活力為0.53U，空白組為1.31U，低、中、高給藥組活力分別為1.08U、1.09U、0.87U；B.模型組GSH的平均濃度為20.90 μmol·L-1，空白組為60.13 μmol·L-1，低、中、高給藥組濃度分別為30.04、35、34 μmol·L-1。和對(duì)照組相比，##P<0.01；和模型組相比，*P<0.05,**P<0.01。

2.3 黃杞苷抑制H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷后ROS的生成 利用流式細(xì)胞術(shù)和DCFH-DA探針技術(shù)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ROS的生成量進(jìn)行檢測(cè)，其散點(diǎn)圖結(jié)果見(jiàn)圖4A，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4B。結(jié)果表明，空白組細(xì)胞經(jīng)DCFH-DA染色后ROS生成較少(4.07% ± 0.90)，H2O2孵育SH-SY5Y細(xì)胞12 h后，ROS陽(yáng)性率(11.27±0.91)顯著提高，P<0.01。黃杞苷給藥組(5、10和20 μmol·L-1)劑量依賴(lài)性降低了ROS陽(yáng)性率，三個(gè)濃度的陽(yáng)性率分別為10.5±0.6，6.93±0.64，5.83±0.61。和模型組相比，黃杞苷給藥組(10和20 μmol·L-1)ROS陽(yáng)性率顯著降低，P<0.01。結(jié)果表明，黃杞苷能夠濃度依賴(lài)性地抑制H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷后ROS的生成增多。

和對(duì)照組相比，##P<0.01；和模型組相比，**P<0.01。

2.4 黃杞苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷中Nrf2表達(dá)的影響 為了探討黃杞苷抑制H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制，本研究采用Western blot方法分析了Nrf2的表達(dá)及其核轉(zhuǎn)位情況。免疫印記結(jié)果顯示，黃杞苷(20 μmol·L-1)孵育細(xì)胞0、6、12、24 h后，能夠時(shí)間依賴(lài)性地促進(jìn)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)(P<0.05)，且在12 h時(shí)最顯著(圖 5 A、B、C)。此外，黃杞苷(5，10和20 μmol·L-1)預(yù)處理12 h后，細(xì)胞核中的Nrf2表達(dá)量明顯增加(P<0.01)，胞漿內(nèi)Nrf2表達(dá)量減少(P<0.01)，說(shuō)明黃杞苷可以濃度依賴(lài)性地激活Nrf2，并促進(jìn)其向核內(nèi)轉(zhuǎn)位(圖5 D、E、F)。

A.用黃杞苷(20 μmol·L-1)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行不同時(shí)間(0、6、12和24 h)孵育處理，Western Blot檢測(cè)分析核Nrf2與胞漿Nrf2表達(dá)水平，利用Image J軟件對(duì)Western Blot條帶進(jìn)行灰度值分析；B.不同效應(yīng)時(shí)間SH-SY5Y細(xì)胞核Nrf2表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；C.不同效應(yīng)時(shí)間SH-SY5Y細(xì)胞胞漿Nrf2表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；D.用不同濃度黃杞苷(5、10和20μmol·L-1)處理細(xì)胞12 h，Western Blot檢測(cè)分析核Nrf2與胞漿Nrf2表達(dá)水平，利用Image J軟件對(duì)Western Blot條帶進(jìn)行灰度值分析；E.不同濃度黃杞苷處理后SH-SY5Y細(xì)胞核Nrf2表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果；F.不同濃度黃杞苷處理后SH-SY5Y細(xì)胞胞漿Nrf2表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。和對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01；和模型組相比，#P<0.05，##P<0.05。

2.5 黃杞苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷中HO-1表達(dá)的影響 黃杞苷(5、10和20 μmol·L-1)預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞12 h后，H2O2孵育12 h。Western Blot檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖6A，HO-1蛋白統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖6B，與模型組比較，黃杞苷低、中劑量組HO-1水平顯著提高(P<0.01)，而高劑量組HO-1表達(dá)略有升高。這說(shuō)明，黃杞苷在一定程度上能夠促進(jìn)HO-1蛋白的表達(dá)，降低H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷。

A.不同濃度黃杞苷(5、10和20 μmol·L-1)處理細(xì)胞12 h后，Western Blot 法檢測(cè)分析細(xì)胞總蛋白中HO-1的表達(dá)情況；B.不同濃度黃杞苷處理后HO-1蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。和模型組相比，**P<0.01。

3 討論

氧化應(yīng)激是諸多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要病理機(jī)制，主要表現(xiàn)為活性氧的增加和抗氧化能力的下降，過(guò)量的活性氧導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)的降解以及核酸的破壞，嚴(yán)重影響神經(jīng)元突觸功能，甚至導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[9]。因此，氧化應(yīng)激成為預(yù)防和治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要靶標(biāo)。SOD是生物體內(nèi)存在的一種抗氧化金屬酶，可反映機(jī)體對(duì)氧自由基的清除能力，具有高度專(zhuān)一性，SOD活性水平降低與神經(jīng)組織受損直接相關(guān)[10]。GSH-Px是谷胱甘肽系統(tǒng)中一種重要的酶，它能調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡，在降低H2O2或氧化型脂質(zhì)的水平中起到重要作用[11]。本研究表明，H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞12 h后ROS陽(yáng)性率顯著提高、SOD、GSH-Px含量顯著降低。黃杞苷(5、10和20 μmol·L-1)預(yù)處理后，黃杞苷劑量依賴(lài)性地降低H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y損傷后ROS陽(yáng)性率、提高SOD、GSH-Px含量。

Nrf2是存在于細(xì)胞質(zhì)中的重要的氧化應(yīng)激調(diào)控蛋白。正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)存在Nrf2分子合成和酶解的動(dòng)態(tài)平衡，Nrf2分子與Keap1結(jié)合形成異二聚體，并借助Keap1蛋白固定在細(xì)胞骨架上[12]。氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時(shí)，大量ROS可促使Nrf2從Keap1上解離，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，并與核內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)結(jié)合將其激活，從而使機(jī)體上調(diào)下游一些抗氧化因子相關(guān)基因的表達(dá)[13]，HO-1相關(guān)基因就是ARE下游靶基因之一[14]。本次研究中，模型組Nrf2表達(dá)略有上升，可能是氧化應(yīng)激引起機(jī)體自身抗氧化防御系統(tǒng)啟動(dòng)。與模型組相比，黃杞苷顯著促進(jìn)Nrf2從胞漿向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性趨勢(shì)。此外，對(duì)黃杞苷預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果看，Nrf2在12 h時(shí)出現(xiàn)最大轉(zhuǎn)移，表明黃杞苷對(duì)Nrf2的最佳效應(yīng)時(shí)間比較接近12 h。與模型組相比，黃杞苷給藥組HO-1表達(dá)顯著提高，結(jié)合Nrf2結(jié)果可知，黃杞苷可通過(guò)增加Nrf2向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，進(jìn)而激活下游HO-1蛋白，發(fā)揮其保護(hù)作用。

綜上所述，本文首次研究了黃杞苷對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是激活了Nrf2，并促進(jìn)Nrf2向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，進(jìn)而上調(diào)了其下游抗氧化酶HO-1的表達(dá)。但是，黃杞苷對(duì)Nrf2由胞漿向核膜的轉(zhuǎn)移是否同時(shí)激活了Nrf2上游通路蛋白，尚需進(jìn)一步研究。