賀倩倩 苗 雙 黃瑩潔 李 敏 滿玉清 宮凱凱

1 濱州醫(yī)學院藥學院 山東 煙臺 264003；2 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤研究實驗室 山東 濱州 256603；3 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥學部 山東 濱州 256603；4 濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院疼痛科 山東 濱州 256603

海洋來源的次級代謝產(chǎn)物多具有多樣性的化學結構和顯著的生物活性，是藥物開發(fā)的重要源泉。截止到2018年，大約有28 600個新化合物從海洋中分離得到，其中海綿來源的大約占30%[1-2]。海綿來源的先導化合物多具有很好的成藥前景，目前在被FDA批準的12個海洋藥物中，海綿占據(jù)了3個，分別為治療白血病的阿糖胞苷[3]、抗病毒的阿糖腺苷和抗腫瘤的甲磺酸艾日布林[4]。除此之外，海綿來源的衍生物Gemcitabine[5]、Discodermolide[6]、Hemiasterlin7[7]、PM0601848[8]也已進入臨床研究。Aaptos屬海綿屬于尋常海綿綱(Demospongiae)，韌海綿目(Hadromerida)，皮海綿科(Suberitidae)，已鑒定大約20種[9]。1982年Nakamura等[10]首次對該屬進行化學成分的研究，到目前，從該屬中共分離得到62個化合物，其中Aaptamine類化合物47個，為該屬海綿的特征性成分[11]。Aaptamine類化合物不僅具有多樣性的結構，還具有良好的生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗附著、酶抑制等活性[11]。劉彩霞等[12]從海綿Aaptossuberitoides中分離得到一系列具有顯著抗腫瘤活性的Aaptamine二聚體類新骨架化合物。本研究對采自中國南海西沙群島的海綿Aaptossuberitoides進行了初步的化學成分研究。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑 Q-Tof-Ultima-Global型質譜儀(美國waters 公司)；DRX-500型核磁共振儀(美國Bruker公司)；Agilent高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)；旋轉蒸發(fā)儀(日本東京理化公司)；ZF-7型暗箱三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；BSZ-100自動餾分收集器(上海青浦滬西電子廠)；薄層硅膠GF254和柱層析硅膠(青島海洋化工廠)；柱層析用ODS(北京金歐亞科技發(fā)展有限公司)；SephadexLH-20(GE Healthcare，GE公司)；常用有機試劑(甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯等)均為國產(chǎn)分析純；半制備HPLC用色譜純甲醇或色譜純乙腈。

1.2 生物材料 海綿Aaptossuberitoides于2012年10月采自于中國西沙群島海域，其種名由荷蘭自然生物多樣性中心Leenvan Ofwegen 教授鑒定。樣品標本(乙醇浸泡)保存在中國海洋大學醫(yī)藥學院天然藥物化學一室，樣品編號XS-2012-30。

1.3 提取分離 將-20℃冷凍保存的海綿樣品(濕重5.75 Kg)用粉碎機粉碎后，室溫下用甲醇動態(tài)冷浸提取5次，每次浸泡5 d；合并5次提取液，40℃下減壓濃縮，然后用無水甲醇溶解脫鹽3次，得總浸膏346 g。浸膏經(jīng)減壓硅膠柱層析(拌樣硅膠100～200目，柱子填料硅膠300～400目)，石油醚/乙酸乙酯(100∶1～1∶4)、二氯甲烷/甲醇(20∶1～0∶1)梯度洗脫，分為7個粗組分(Fr.1～Fr.7)。

組分Fr.6(二氯甲烷/甲醇 10∶1)經(jīng)硅膠柱不同比例二氯甲烷/甲醇(40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1)、純甲醇洗脫得到7個組分(Fr.6-1～Fr.6-7)。組分Fr.6-1(二氯甲烷/甲醇 40∶1)經(jīng)ODS柱甲醇(40%～100%)梯度洗脫得到5個組分(Fr.6-1-1～Fr.6-1-5)，組分Fr.6-1-4(甲醇/水 40∶60)通過液相制備(乙腈/水 20∶80 v/v，流速為1.0 mL/min，C18柱)可得化合物1(6.05 mg，t=9.8 min)；組分Fr.6-4(二氯甲烷/甲醇 40∶1，20∶1)經(jīng)ODS柱甲醇(10%～100%)梯度洗脫得到5個組分(Fr.6-4-1～6-4-6)，組分Fr.6-4-3(甲醇/水10∶90)通過液相制備(乙腈/水 15∶85v/v，流速為1.0 mL/min，C18柱)制備可得化合物2(18.59 mg，t=5.3 min)。組分Fr.5(二氯甲烷/甲醇 20∶1)經(jīng)ODS柱甲醇(20%～60%)梯度洗脫得到6個組分(Fr.5-1～ Fr.5-6)：組分Fr.5-1(甲醇/水 20∶80)通過液相制備(甲醇/水 10∶90v/v，流速為1.5 mL/min，C18柱)制備可得化合物3(12.41 mg，t=11.3 min)，4(14.64 mg，t=18.5 min)，5(16.68 mg，t=16.6 min)，6(11.40 mg，t=24.2 min)，7(33.59 mg，t=35.9 min)。

2 結構鑒定

本研究從其甲醇提取物中共分離了7個單體化合物，應用各種波譜技術結合文獻數(shù)據(jù)對比，鑒定為3-(methylamino)demethyl(oxy)aaptamnie(化合物1)、aaptamine(化合物2)、尿嘧啶(化合物3)、胸腺嘧啶(化合物4)、cyclo(Pro-Ser)(化合物5)、cyclo(Pro-Thr)(化合物6)、胸腺嘧啶脫氧核苷(化合物7)?；衔颽aptamine、環(huán)(脯-絲)二肽[cyclo(Pro-Ser)]、環(huán)(脯-蘇)二肽[cyclo(Pro-Thr)]為首次從本屬海綿中分離得到。7個化合物的結構式見圖1。

圖1 化合物1～7的結構式

化合物1分子式為C13H11N3O2，桔黃色粉末，10%H2SO4/EtOH顯粉色；ESI/MS：242[M+H]+；1H NMR(500MHz, DMSO, TMS,δ),δH: 8.87(1H, d,J=4.4 Hz, H-5), 8.46(1H, q,J=5.0 Hz, NH-1′), 8.32(1H, s, H-2), 7.77(1H, d,J=4.5 Hz, H-6), 7.04(1H, s, H-7), 3.87(3H, s, OMe-8), 3.11(3H, d, J=5.2 Hz, NMe-2′);13C NMR(600MHz, DMSO, TMS, δ), δC: 174.4(C-9), 157.3(C-8), 150.6(C-5), 145.0(C-3), 135.5(C-6a), 135.3(C-3a), 133.0(C-9a), 129.6(C-2), 122.2(C-6), 117.4(C-9b), 106.8(C-7), 55.8(OMe-8), 29.2(NCH3-2′)。以上核磁氫譜和碳譜數(shù)據(jù)均與文獻[13]報道一致，鑒定為3-(methylamino)demethyl(oxy)aaptamine。

化合物2分子式為C13H12N2O2，黃色膠狀，10%H2SO4/EtOH顯黃色;ESI/MS：229[M+H]+；1H NMR(500MHz, DMSO, TMS,δ),δH: 12.7((1H, s, NH-1), 7.83(d,J=7.1 Hz, 1H, H-2), 7.37(d,J=7.1 Hz, 1H，H-5), 7.09(1H, s, H-7), 6.85(d,J=7.2 Hz, 1H, H-6), 6.50(d,J=7.0 Hz, 1H, H-3), 3.97(3H, s, OMe-8), 3.80(3H, s, OMe-9);δC: 156.8(C-8), 149.7(C-3a), 141.8(C-2), 133.7(C-9a), 132.6(C-6a), 131.3(C-9), 129.9(C-5), 116.3(C-9b), 112.5(C-6), 100.7(C-7), 98.1(C-3), 60.4(OMe-9), 56.4(OMe-8)。以上核磁氫譜和碳譜數(shù)據(jù)均與文獻[10]報道一致，鑒定為aaptamine。

化合物3分子式為C4H4N2O2,淡黃色固體，10%H2SO4/EtOH顯灰色；ESI/MS：113[M+H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO, TMS,δ),δH: 10.45(1H, s, H-1), 10.45(1H, s, H-3), 7.38(1H, d,J=7.4 Hz, H-6), 5.43(1H, d,J=7.4 Hz, H-5);δC: 164.4(C-4), 151.6(C-2), 142.3(C-6), 100.2(C-5)。以上核磁氫譜和碳譜數(shù)據(jù)均與文獻[14]報道一致，鑒定為尿嘧啶。

化合物4分子式為C5H6N2O2,無色油狀物，10%H2SO4/EtOH顯灰色；ESI/MS：127[M+H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO, TMS,δ),δH: 10.88(1H, s, H-1), 10.88(1H, s, H-3), 7.25(1H, s, H-6), 1.72(1H, s, CH3-5);δC: 164.9(C-4), 151.5(C-2), 137.8(C-6), 107.6(C-5), 11.8(CH3-5)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻[15]報道一致，鑒定為胸腺嘧啶。

化合物5分子式為C8H12N2O3,黃色油狀物，10%H2SO4/EtOH顯灰色；ESI/MS：185[M+H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δH 7.88(1H, s, H-4), 4.86(1H, m, OH), 4.11-4.15(1H, m, H-3), 4.00-4.03(1H, m, H-10a), 3.66-3.74(2H, m, H-6, 10b), 3.40-3.46(m, 1H, H-9a), 3.32(overlapped, 1H, H-9b),2.11-2.17(1H, m, H-7b), 1.76-1.88(3H, m, H-7a, 8), 1.21(3H, d,J=6.5 Hz, H-11);δC: 169.1(C-2), 164.9(C-5), 59.9(C-10), 58.4(C-3), 56.8(C-6), 44.6(C-9), 27.9(C-7), 21.9(C-8)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻[16]報道一致，鑒定為環(huán)(脯-絲)二肽[cyclo(Pro-Ser)]。

化合物6分子式為C9H14N2O3,黃色油狀物，ESI/MS：199[M+H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δH 7.64(1H, s, H-4), 4.81(1H, m, H-10), 4.03-4.21(2H, m, H-3, 6), 3.84(1H, m, H-9b), 3.40-3.51(m, 1H, H-9a), 2.03-2.24(1H, m, H-7b), 1.59-1.99(3H, m, H-7a, 8), 1.21(3H, d,J=6.5 Hz, H-11);δC 169.1(C-2), 164.9(C-5), 64.6(C-10), 59.6(C-6), 58.3(C-3), 44.6(C-9), 27.9(C-7), 21.9(C-8), 20.2(C-11)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻[17-18]報道一致，鑒定為環(huán)(脯-蘇)二肽[cyclo(Pro-Thr)]。

化合物7分子式為C10H14N2O5,白色晶體，10%H2SO4/EtOH顯灰色；ESI/MS：243[M+H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO, TMS,δ),δH: 7.70(1H, s, H-6), 6.16(1H, dd,J=7.6, 6.2 Hz, H-1′), 4.23(1H, m, H-3′), 3.75(1H, d,J=3.2 Hz, H-4′), 3.55(2H, dd,J=11.8, 24.7 Hz, H-5′), 2.05(2H, m, H-2′), 1.77(3H, s, CH3-5);δC: 163.8(C-4), 150.5(C-2), 136.2(C-6), 109.4(C-5), 87.3(C-4′), 83.8(C-1′), 70.4(C-3’), 61.3(C-5′), 39.3(C-2′), 12.3(CH3-5)。上述氫譜數(shù)據(jù)與文獻[19]報道一致，確定為脫氧胸腺嘧啶核苷。

3 討論

本研究對海綿Aaptossuberitoides進行了初步的化學成分研究，從中分離得到7個單體化合物，其中aaptamine生物堿類化合物2個，嘧啶類化合物2個，環(huán)二肽類化合物2個，腺苷類化合物1個。Aaptamine類化合物是具有苯并1,6-萘啶骨架的一類海洋海綿特征性生物堿。結構上具有多樣性取代、二聚、重排、以及擴環(huán)等主要特征[20]。其具有良好的抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等活性[21]，這表明Aaptos屬海綿作為生物活性物質的來源，具有進一步研究和開發(fā)的價值。典型的環(huán)二肽類化合物種類繁多且來源廣泛，大約90%來自于革蘭氏陰性菌，但在真菌、植物和動物中都有分布。環(huán)二肽通過兩個氨基酸酰胺內環(huán)化而成，母體為2,5-二酮哌嗪或2,5-二氧哌嗪，是已知最小的結構最簡單的肽類衍生物[22]。該類化合物具有多種多樣的生物活性如抗腫瘤、抗毒素、鎮(zhèn)痛、抑菌等[23]，但至今未開發(fā)成為藥物。核苷是由糖基和堿基通過共價鍵連接組成的化合物，堿基包括嘌呤、嘧啶和修飾堿基(大部分是嘌呤和嘧啶的甲基化產(chǎn)物)。核苷類化合物具有抗腫瘤、抗病毒、基因治療等多種生物活性，目前臨床上使用的抗腫瘤藥物阿糖胞苷和近50%的抗病毒藥物屬于核苷類化合物[24]。

綜上所述，本研究分離得到的7個化合物含有aaptamine類、嘧啶類、核苷類、環(huán)二肽類四種結構類型，初步揭示了海綿Aaptossuberitoides化學多樣性，化合物aaptamine、環(huán)(脯-絲)二肽[cyclo(Pro-Ser)]、環(huán)(脯-蘇)二肽[cyclo(Pro-Thr)]首次從Aaptos屬海綿中分離得到，豐富了該屬海綿的化學結構類型。