郭劍波，常旭卉，陳龍，劉小茼，王淑平

（中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049）

畜禽糞便作為有機(jī)肥料施入土壤后，其殘留的重金屬和抗生素不僅影響土壤肥力和作物的產(chǎn)量與品質(zhì)[1-2]，而且最終將通過(guò)食物鏈危害人類(lèi)的健康[3]。土壤中的鎘（Cd）主要分布在地表0～20 cm 處[4]，且土壤中Cd 的環(huán)境容量小、毒性大[5]。2014 年《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示，我國(guó)耕地土壤點(diǎn)位超標(biāo)率為19.4%，主要污染物為鎘、銅、鎳、砷、汞、鉛、滴滴涕和多環(huán)芳烴[6]?？股卦趧?dòng)物體內(nèi)的分解較少，有30%～90%以母體化合物或代謝產(chǎn)物形式隨糞便排出體外[7-8]，使得畜禽糞便成為抗生素污染環(huán)境的主要途徑之一。Morales-Muoz等[9]借助動(dòng)態(tài)微波輔助提取和在線實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法對(duì)西班牙某污染土壤進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在使用糞肥的土壤中環(huán)丙沙星和諾氟沙星的平均濃度分別為4.4 mg·kg-1和8 mg·kg-1。Zhao等[10]對(duì)采自中國(guó)8 個(gè)?。ㄊ?、自治區(qū)）的大型畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)的143 個(gè)畜禽糞便樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示所有樣品中均檢出環(huán)丙沙星，最大濃度為45.59 mg·kg-1。此外，研究表明畜禽糞便中殘留的高濃度抗生素和重金屬會(huì)引起養(yǎng)殖場(chǎng)及周邊土壤抗生素和重金屬的復(fù)合污染[11-13]?？股鼐哂幸粋€(gè)或多個(gè)官能團(tuán)，并且這些官能團(tuán)均可與金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用，重金屬-抗生素的絡(luò)合作用不僅影響各自的環(huán)境行為和生物效應(yīng)，而且在復(fù)合污染體系中對(duì)環(huán)境效應(yīng)起主導(dǎo)作用，其聯(lián)合毒性存在協(xié)同、拮抗，甚至加和等復(fù)雜的毒理效應(yīng)[14-16]。

人體暴露于環(huán)境中Cd的途徑主要包括食用受污染的食物或飲用水、吸入土壤或空氣中含Cd 顆粒物質(zhì)以及接觸Cd煙霧和灰塵[17-18]，其中無(wú)意的口部攝入特別是兒童戶(hù)外活動(dòng)時(shí)經(jīng)手-口攝入被認(rèn)為是土壤重金屬人體暴露的重要途徑之一[19-21]。在人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中，基于生理學(xué)的體外實(shí)驗(yàn)（in vitro）模型是進(jìn)行重金屬生物可給性評(píng)估的有效工具。生物可給性是指在人體胃腸環(huán)境中可溶并可供吸收的重金屬的含量，而生物有效性是指吸收到體內(nèi)重新分布的重金屬含量[22]。由于小腸對(duì)重金屬的不完全吸收，生物可給性一般大于生物有效性，但生物可給性在一定程度上能反映生物有效性。體外實(shí)驗(yàn)具有操作簡(jiǎn)單、快速，費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)，因而受到國(guó)內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注[23-25]。因此，利用體外實(shí)驗(yàn)研究土壤環(huán)境樣品中重金屬Cd 人體生物可給性能夠更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)Cd 對(duì)人體健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)。但目前有關(guān)Cd生物可給性的研究多集中在重金屬單一污染上，對(duì)于復(fù)合污染的研究相對(duì)較少。因此，本研究選取環(huán)丙沙星（Ciprofloxa?cin，CIP）和重金屬Cd 作為土壤污染物質(zhì)，基于PBET（Physiologically based extraction test）+SHIME（Simula?tor of human intestinal microbial ecosystems of infants）模型研究環(huán)丙沙星和Cd 復(fù)合污染土壤中Cd 的生物可給性，為評(píng)價(jià)土壤中抗生素和Cd 復(fù)合污染對(duì)人體健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

本研究所用的無(wú)污染土壤于2017 年采自河北省安新縣王家寨，供試土壤為潮土，按照中國(guó)土壤系統(tǒng)分類(lèi)為干潤(rùn)雛形土（Ustic cambosols）。采集0～20 cm土層土壤，土壤有機(jī)質(zhì)含量為26.3 g·kg-1，土壤pH 值為7.91，堿解氮含量為112 mg·kg-1。供試土壤未檢測(cè)出Cd和環(huán)丙沙星。

1.2 土壤老化試驗(yàn)

采集新鮮土樣過(guò)2 mm篩，充分混勻，放置于人工氣候箱中25 ℃恒溫培養(yǎng)一周，以活化土壤微生物。然后取土裝盆（培養(yǎng)盆規(guī)格：頂部直徑12.0 cm×底部直徑8.5 cm×高10.0 cm），每盆裝232 g 鮮土，培養(yǎng)盆中土壤含水量為田間最大持水量的70%左右，置于人工氣候箱中25 ℃非密閉培養(yǎng)，并模擬實(shí)際光照周期變化（晝夜各12 h），通過(guò)稱(chēng)質(zhì)量法補(bǔ)充培養(yǎng)盆中土壤損失的水分，以保持土壤含水量恒定。

試驗(yàn)共設(shè)置4 個(gè)處理：CK+Cd（外源添加Cd 80 mg·kg-1），CIPⅠ+Cd（外源添加CIP 5 mg·kg-1+Cd 80 mg·kg-1），CIPⅡ+Cd（外源添加CIP 25 mg·kg-1+Cd 80 mg·kg-1），CIPⅢ+Cd（外源添加CIP 50 mg·kg-1+Cd 80 mg·kg-1），3 次重復(fù)。Cd 添加量以目前已知肥料中含量為依據(jù)[26]，抗生素藥物添加量設(shè)定以已知畜禽糞便中CIP 的含量為依據(jù)[10]。試驗(yàn)分別于土壤培養(yǎng)的第1、30、60 d 取樣。培養(yǎng)后的土壤樣品風(fēng)干，一部分保存于4 ℃冰箱，用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定，另一部分保存于-20 ℃冰箱，用于后續(xù)體外培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.3 體外模擬試驗(yàn)

主要采用PBET+SHIME 模型中的方法，具體操作步驟如下：

（1）胃階段：配制模擬胃液（以配制600 mL 胃液為例，分別稱(chēng)取檸檬酸0.3 g、蘋(píng)果酸0.3 g、乳酸252μL、冰乙酸300 μL 置于燒杯中，加水600 mL，用12 mol·L-1濃HCl 調(diào)pH 至1.5，再加胃蛋白酶0.75 g，混勻，添加NaCl 5.265 g），稱(chēng)取土樣0.3 g 于50 mL 的離心管內(nèi)，將30 mL 模擬胃液和土樣混合于離心管內(nèi)，使得固液比為1∶100，每個(gè)樣品3 個(gè)平行，混勻微調(diào)pH（1.5±0.1）后，置于37 ℃、150 r·min-1的恒溫振蕩儀中（0.5 h 時(shí)測(cè)定pH）。在1 h 時(shí)，吸取反應(yīng)液10 mL，以4 000 r·min-1的速度離心10 min，重復(fù)3 次，過(guò)0.45μm濾膜，-20 ℃保存待測(cè)。

（2）小腸階段：用NaHCO3粉末將胃階段反應(yīng)液pH 調(diào)至7.0，加入胰酶0.018 g、膽鹽0.06 g，繼續(xù)置于37 ℃、150 r·min-1的恒溫振蕩儀中，2 h 時(shí)測(cè)定pH，并用1 mol·L-1HCl 或NaHCO3微調(diào)，使pH 維持在7.0±0.1。在4 h時(shí)，吸取反應(yīng)液10 mL，離心，過(guò)0.45μm濾膜，-20 ℃保存待測(cè)。

（3）結(jié)腸階段：將小腸液轉(zhuǎn)移至100 mL 的厭氧血清瓶?jī)?nèi)，并從SHIME模型的降結(jié)腸階段吸取30 mL菌液加入，使土液比為1∶100，迅速通入氮?dú)?0 min 以保證厭氧條件，加蓋密封后繼續(xù)置于37 ℃、150 r·min-1的恒溫振蕩儀中。在48 h 時(shí)，吸取反應(yīng)液10 mL，離心，過(guò)0.45μm濾膜，-80 ℃保存待測(cè)。

1.4 計(jì)算方法

土壤中重金屬Cd在模擬胃階段和腸階段的生物可給性計(jì)算公式如下：

式中：BA 為Cd 的生物可給性，%；CIV是模擬實(shí)驗(yàn)中各階段Cd 的濃度，mg·L-1；VIV為各階段反應(yīng)器中反應(yīng)液的體積，L，本實(shí)驗(yàn)為0.03 L；TS是土壤樣品中Cd 的總量，mg·kg-1；MS為加入反應(yīng)器中的土樣的質(zhì)量，kg，本實(shí)驗(yàn)為0.000 3 kg。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2016整理，使用SPSS 22.0進(jìn)行單因素ANOVA 方差分析，采用Duncan方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，用Origin 2018軟件進(jìn)行作圖。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同老化時(shí)間復(fù)合污染土壤中Cd的生物可給性

2.1.1 第1 d重金屬Cd在胃腸階段的生物可給性

由圖1 可知，D1 復(fù)合污染土壤中不同濃度CIP 對(duì)Cd 在胃腸階段的生物可給性影響不同。胃階段各處理Cd生物可給性無(wú)顯著差異。在小腸階段，隨著CIP濃度的增加，重金屬Cd 的生物可給性呈逐漸降低的趨勢(shì)。在結(jié)腸階段，沒(méi)有檢出溶解態(tài)Cd。

圖1 第1 d不同處理在胃腸階段Cd的生物可給性Figure 1 Effects of CIP on the bioaccessibility of Cd among the gastric and small intestinal phase on Day 1

2.1.2 第30 d重金屬Cd在胃腸階段的生物可給性

由圖2 可知，D30 復(fù)合污染土壤中不同濃度CIP對(duì)Cd 在胃腸階段的生物可給性影響不同。胃階段CIPⅡ+Cd處理Cd生物可給性最大，相較于CK+Cd增加10.36個(gè)百分點(diǎn)，但差異不顯著（P＞0.05）；CIPⅠ+Cd處理和CIPⅢ+Cd處理生物可給性相較于對(duì)照處理分別增加5.82個(gè)百分點(diǎn)和5.33個(gè)百分點(diǎn)，但差異不顯著（P＞0.05）；在小腸階段，隨著CIP濃度的增加，Cd在小腸階段的生物可給性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，但與對(duì)照處理之間差異均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）；在結(jié)腸階段，隨著CIP 濃度的增加，各處理的生物可給性呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，其中CIPⅢ+Cd處理Cd生物可給性最大，相較于對(duì)照處理顯著增加1.73 倍（P＜0.05），CIPⅡ+Cd處理相較于對(duì)照處理顯著增加1.56倍（P＜0.05）。

2.1.3 第60 d重金屬Cd在胃腸階段的生物可給性

圖2 第30 d不同處理在胃腸階段Cd的生物可給性Figure 2 Effects of CIP on the bioaccessibility of Cd among the gastric，small intestinal and colon phase on Day 30

由圖3 可知，D60 復(fù)合污染土壤中不同濃度CIP對(duì)Cd 在胃腸階段的生物可給性影響不同。胃階段CIPⅠ+Cd 處理生物可給性最大，為91.32%，相較于CK+Cd 增加3.82 個(gè)百分點(diǎn)，但差異不顯著（P＞0.05），CIPⅡ+Cd 處理和CIPⅢ+Cd 處理Cd 生物可給性相較于對(duì)照處理均降低，但差異不顯著（P＞0.05），高濃度的CIP 導(dǎo)致Cd 在胃階段的生物可給性降低；在小腸階段，隨著CIP 濃度的增加，Cd 的生物可給性呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，其中CIPⅢ+Cd 處理Cd 生物可給性最大，為31.30%，相較于對(duì)照處理顯著增加2.38 倍（P＜0.05），CIPⅡ+Cd處理Cd生物可給性相對(duì)于對(duì)照處理顯著增加1.60 倍（P＜0.05）；在結(jié)腸階段，隨著CIP 濃度的增加，各處理的生物可給性呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，其中CIPⅢ+Cd處理Cd生物可給性最大，為9.19%，各處理Cd生物可給性相較于對(duì)照處理差異均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。

2.2 復(fù)合污染土壤中胃階段Cd的生物可給性動(dòng)態(tài)變化

表1 為胃階段不同停留時(shí)間Cd 的生物可給性動(dòng)態(tài)變化。通常，在PBET 方法中，土壤在胃階段的停留時(shí)間設(shè)定為1 h，因此，本研究考察了0～60 min胃階段Cd 生物可給性動(dòng)態(tài)變化。由表1 可得，不同處理Cd 在胃階段生物可給性的變化不同，且隨著在胃中停留時(shí)間的增加，Cd 的生物可給性呈增加的趨勢(shì)，但增幅有所不同。胃階段停留20 min時(shí)，各處理土壤中Cd 的生物可給性變幅最大，Cd 生物可給性在停留60 min 時(shí)達(dá)到最大。各處理Cd 生物可給性變化均是先快后慢，在胃階段生物可給性的變化趨勢(shì)相似，而且同一停留時(shí)間不同處理間Cd生物可給性差異均不顯著（P＞0.05）。

圖3 第60 d不同處理在胃腸階段Cd的生物可給性Figure 3 Effects of CIP on the bioaccessibility of Cd among the gastric，small intestinal and colon phase on Day 60

3 討論

不同老化天數(shù)復(fù)合污染土壤中Cd的生物可給性有所差異。隨著土壤老化時(shí)間的延長(zhǎng)，Cd 的生物可給性不斷降低，其潛在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)地下降。研究表明，隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)，土壤中有效態(tài)Cd 含量逐漸下降最后趨于穩(wěn)定[27-30]，而使其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)也相應(yīng)降低。同時(shí)也有研究證明，喹諾酮類(lèi)抗生素可以與很多金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，影響各自的生物效應(yīng)[31-32]。本研究發(fā)現(xiàn)Cd 在小腸階段的生物可給性低于胃階段。可能是因?yàn)閺奈鸽A段到小腸階段in vitropH 升高，以及胰酶和膽鹽的加入，使得土壤對(duì)Cd 離子的吸附力加強(qiáng)，而且Cd 與其他金屬離子形成沉淀的機(jī)會(huì)增大，從而導(dǎo)致腸液中Cd 的濃度降低，這與其他眾多研究結(jié)果相一致[19-20，25]。復(fù)合污染各處理土壤中Cd 生物可給性與CK+Cd 相比有所不同，其原因可能是CIP 有多個(gè)官能團(tuán)，并且這些官能團(tuán)均可與金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用，Cd-CIP 的絡(luò)合作用影響了Cd 的生物效應(yīng)[33-34]。隨著CIP 濃度的增加，D30 胃階段Cd 的生物可給性呈逐漸增大的趨勢(shì)，可能是由于吸收了完整的CIP-Cd 復(fù)合物，該結(jié)果與黃日祥[35]研究四環(huán)素能促進(jìn)金屬礦物溶解的結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素通過(guò)表面結(jié)合吸附到金屬礦物表面，從而促進(jìn)金屬礦物的溶解。D30 小腸階段Cd 的生物可給性呈逐漸降低的趨勢(shì)，可能是因?yàn)镃IP 與Cd 離子的絡(luò)合反應(yīng)，在加入CIP 后引起土壤中游離態(tài)Cd 離子含量減少。小腸階段D60 各處理Cd 生物可給性與D30 各處理Cd 生物可給性變化趨勢(shì)相反，D60 小腸階段的Cd 的生物可給性相較于對(duì)照呈逐漸增加的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)镃K+Cd 處理土壤中Cd 的老化特征表現(xiàn)為有效態(tài)Cd 含量在30～60 d內(nèi)快速降低[29]，而且有研究表明不同濃度組合條件下，CIP 與Cd 反應(yīng)會(huì)生成不同的絡(luò)合物[31，36]。此外，污染物在特定時(shí)間的生物可給性可能無(wú)法全面反映人體胃階段的動(dòng)態(tài)溶解和吸收情況，因此本研究考察不同停留時(shí)間（20、40、60 min）生物可給性動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，各處理復(fù)合污染土壤中Cd 的生物可給性變化速率均呈先快后慢趨勢(shì)，與尹乃毅等[37]的研究結(jié)果基本一致。此外，在胃階段Cd 生物可給性動(dòng)態(tài)變化研究中，由于in vitropH 較低，有利于土壤中Cd 的溶出，故20 min 時(shí)Cd 的生物可給性變幅均很高。不同老化天數(shù)條件下不同停留時(shí)間的生物可給性有所差異，這可能是因?yàn)镃IP-Cd 有機(jī)物絡(luò)合態(tài)的溶解差異，而且土壤中金屬最先溶出的形態(tài)為可交換態(tài)，之后碳酸鹽結(jié)合態(tài)溶解會(huì)釋放出大量的Cd離子，而且各形態(tài)之間可能會(huì)相互轉(zhuǎn)化，進(jìn)而影響金屬的溶出率。

表1 不同處理在胃階段Cd的生物可給性動(dòng)態(tài)變化（%）Table 1 Dynamic dissolution of Cd in gastric phase under different treatments（%）

4 結(jié)論

（1）環(huán)丙沙星和Cd 復(fù)合污染土壤中Cd 的生物可給性在胃階段較高，在小腸和結(jié)腸階段較低。

（2）環(huán)丙沙星的添加對(duì)胃階段Cd 的生物可給性無(wú)顯著影響，而對(duì)小腸和結(jié)腸階段Cd 的生物可給性有一定的影響，與未添加環(huán)丙沙星的對(duì)照處理相比，添加25、50 mg·kg-1環(huán)丙沙星顯著提高了老化30 d 結(jié)腸階段和老化60 d小腸階段Cd的生物可給性。

（3）胃階段不同濃度環(huán)丙沙星與Cd 復(fù)合污染土壤中，Cd 的生物可給性隨停留時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化不同，但均呈先快后慢趨勢(shì)。