董旭，韓學(xué)昌，邢群智，任巖巖，張亞杰

（河南科技大學(xué)臨床學(xué)院 河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，河南 洛陽471003）

七氟醚是一種氣味芬芳的新型吸入麻醉劑,對人體氣道造成的刺激較小,具有麻醉誘導(dǎo)和蘇醒迅速、對呼吸系統(tǒng)以及心血管系統(tǒng)影響較小等諸多優(yōu)點,現(xiàn)已在臨床上廣泛應(yīng)用于小兒麻醉[1]。臨床上需要多次手術(shù)的患兒逐漸增加,而七氟醚是目前臨床上應(yīng)用于小兒麻醉的首選藥物之一[2]。有研究報道,七氟醚可導(dǎo)致接受過七氟醚麻醉的兒童出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶的障礙[3]。本文通過研究重復(fù)吸入七氟醚大鼠并于正常大鼠進行比較,探究七氟醚對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響,為臨床上患兒重復(fù)吸入七氟醚進行麻醉的安全性以及可靠性提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 實驗動物與方法

1.1 實驗動物

選取由河南科技大學(xué)提供的新生SD大鼠48只,均為雄性,SPF級(大鼠合格證編號:SYXK(豫)2018-0015),日齡7d,喂養(yǎng)于光照12h、室內(nèi)溫度23℃～25℃、相對濕度45%～60%、自由進食進水的環(huán)境中。

1.2 方法

1.2.1 實驗儀器、藥品 七氟醚購自山東魯南貝特制藥有限公司(批號65130702),Anti-Tau antibody購自英國Abcam公司(批號:ab32057),Anti-Tau(phosphor Ser396)antibody購自英國Abcam公司

(批號:ab109390),病理切片機購自德國Leica公司,顯微鏡購自日本OLYMPUS公司,七氟醚揮發(fā)罐、S/5多功能麻醉氣體監(jiān)測儀購自美國Datex.Ohmeda公司,WMT-100型Morris水迷宮測試儀購自成都泰盟多功科技有限公司,BDNF抗體購自英國Santa公司,PSD95抗體購自英國Bioss公司,Tau抗體購于英國Bioss公司,熒光二抗購自美國Li-COR公司,ApoE ELISA試劑盒購于美國MyBioSource公司。

1.2.2 干預(yù)方法 將實驗組大鼠置于麻醉誘導(dǎo)箱中,通過調(diào)節(jié)七氟醚揮發(fā)罐和S/5多功能麻醉氣體監(jiān)測儀中設(shè)置七氟醚濃度,流量為2L/min,持續(xù)3h,對照組不做任何處理,術(shù)中使用電加熱板維持體溫36.5～37.5℃麻醉過程中觀時刻察大鼠的皮膚顏色,防止出現(xiàn)呼吸抑制。

1.2.3 Morris水迷宮實驗 實驗程序：⑴定位航行實驗一般被用來檢測大鼠的學(xué)習(xí)和記憶的能力。此實驗總共耗時6 d,這6d中總共對小鼠進行5次訓(xùn)練。在實驗進行的過程中一直保持水溫穩(wěn)定在25℃左右,訓(xùn)練時,大鼠分別在四個象限1/2弧度處頭朝池壁入水。由計算機記錄大鼠從入水點入水到到達平臺所消耗的總時間,如果大鼠在60s內(nèi)未能到達平臺,則計算機自動計時60s,再由實驗人員負責(zé)引導(dǎo)大鼠,使其按直線游至平臺,并且訓(xùn)練大鼠在平臺上站立10 s,促進大鼠對平臺的位置進行學(xué)習(xí)和記憶。此外,實驗中還需觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間和距離,即記錄其潛伏期和游泳距離。⑵空間搜索實驗被用來測試大鼠對水池平臺位置記憶的持續(xù)能力。在定位航行實驗訓(xùn)練結(jié)束后,撤去水池中的平臺,將大鼠置于水中,觀察并記錄大鼠第一次到達水池平臺位置的時間以及在原平臺所在象限中停留的時間。數(shù)據(jù)的采集以及處理都是由MWM自帶的圖像系統(tǒng)完成。

1.2.4 Wesern-blot法 采用Wesern-blot法對BDNFβ-actin、PSD-95以及Tau進行測定。在水迷宮實驗結(jié)束后,使大鼠吸入5%七氟醚將其麻醉,再將大鼠處死并取其大腦中的海馬區(qū)組織,再用裂解液提取總蛋白,測定其濃度,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法使目的蛋白分離,之后進行冰浴轉(zhuǎn)膜,再在室溫下用脫脂奶粉封閉1～2。封閉結(jié)束之后,依次加入BDNF抗體,PSD95抗體以及Tau抗體,4℃條件下孵育過夜,次日用二抗孵育1h后TBST洗膜三次,每次10min,最后用紅外成像系統(tǒng)掃膜并采用Odessay軟件測定灰度值,GAPDH為內(nèi)參,用目的條帶的灰度值與GAPDH條帶的灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.2.5 ELISA法 采集腦脊液后將其置于-80℃冰箱中冷凍保存。采用ELISA法檢測ApoE濃度。選取生物素化的抗大鼠ApoE抗體為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)抗體為二抗。操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。最后采用酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測光密度值(OD值),根據(jù)OD值繪制ApoE的質(zhì)量濃度曲線,根據(jù)ApoE的質(zhì)量濃度曲線計算ApoE濃度。

2 結(jié)果

2.1 實驗組大鼠和對照組大鼠的Morris迷宮實驗指標(biāo)對比 在出生后37d測定,實驗組和對照組大鼠的Morris水迷宮實驗中游泳路程、原平臺象限游泳距離差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）,實驗組大鼠的Morris水迷宮實驗中逃避潛伏期、原平臺象限滯留時間均較對照組長（P<0.05）；見表1。

2.2 實驗組大鼠和對照組大鼠的海馬組織中BD-NF、PSD-95、Tau蛋白表達情況比較 在出生后37d測定,實驗組大鼠的海馬組織中BDNF、PSD-95蛋白表達低于對照組（P<0.05）,Tau蛋白表達強度高于對照組（P<0.05）；見表2、圖1。

表1 實驗組大鼠和對照組大鼠的Morris迷宮實驗指標(biāo)對比（±s）

表1 實驗組大鼠和對照組大鼠的Morris迷宮實驗指標(biāo)對比（±s）

組別n 游泳路程（mm）逃避潛伏期(s)實驗組對照組t值P值24 24 9876.9±2201.3 10092.7±2568.4-0.315 0.754原平臺象限滯留時間(s)31.05±3.26 29.11±3.31 2.066 0.044 27.84±4.49 25.20±5.13 2.022 0.049原平臺象限游泳距離（mm）7430.2±1982.3 7550.7±1846.5-0.220 0.827

表2 實驗組大鼠和對照組大鼠的海馬組織中BDNF、PSD-95、Tau蛋白表達情況比較（±s,相對表達強度）

表2 實驗組大鼠和對照組大鼠的海馬組織中BDNF、PSD-95、Tau蛋白表達情況比較（±s,相對表達強度）

組別 n實驗組對照組t值P值24 24 BDNFβ-actin PSD-95 0.961±0.271 1.309±0.332-4.010 0.000 0.733±0.154 0.941±0.187-4.240 0.000 Tau蛋白1.410±0.081 0.587±0.074 3.296 0.002

圖1 海馬組織中BDNF、PSD-95、Tau蛋白電泳圖

2.3 實驗組大鼠和對照組大鼠的腦脊液中ApoE水平比較 在出生后37d測定,實驗組大鼠腦脊液中ApoE水平高于對照組（P<0.05）；見表3、圖2。

表3 實驗組大鼠和對照組大鼠的腦脊液中ApoE水平比較（±s）

表3 實驗組大鼠和對照組大鼠的腦脊液中ApoE水平比較（±s）

組別 n實驗組對照組P值24 24 ApoE（ng/ml） t值35.82±4.16 33.09±3.73 2.394 0.021

圖2 實驗組大鼠和對照組大鼠的腦脊液中ApoE水平柱狀圖

3 討論

水迷宮實驗是檢測動物學(xué)習(xí)記憶能力最經(jīng)典的實驗之一,主要由定位巡航實驗以及空間探索實驗兩部分組成[4]。其結(jié)果的重復(fù)性以及穩(wěn)定性良好,逃避潛伏期能反映大鼠的學(xué)習(xí)能力,逃避潛伏期的長短與動物的陳述性記憶能力呈負相關(guān)的關(guān)系,逃避潛伏期越長,則陳述性記憶能力越差,反之,逃避潛伏期越短,則陳述性記憶能力越好,而在原平臺所在象限滯留的時間能則反映大鼠的空間記憶能力[5]。本次的研究結(jié)果表明,大鼠在反復(fù)接受七氟醚的麻醉之后,實驗組的逃避潛伏期以及在原平臺滯留的時間與對照組相比都由明顯的延長且具有統(tǒng)計學(xué)意義,這就表明大鼠在接受七氟醚的麻醉之后記憶能力下降了,提示長時間的七氟醚麻醉可能會導(dǎo)致大鼠的認知能力出現(xiàn)障礙。其他的研究也發(fā)現(xiàn),大鼠的認知能力的障礙與七氟醚麻醉的時間呈正相關(guān)的關(guān)系,麻醉的時間越長,大鼠的認知能力受損也就越嚴(yán)重。

BDNF是成熟的神經(jīng)元維持生存以及正常的生理功能所必需的,在大腦皮層以海馬組織中分布較為集中,有促進神經(jīng)元的發(fā)育、促進受損神經(jīng)元恢復(fù)的功能,參與突觸的可塑性,維持了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的學(xué)習(xí)與記憶能力[6]。PSD-95主要分布在突觸后致密區(qū),能調(diào)節(jié)谷氨酸受體的功能,,影響突觸后可塑性。此次的研究結(jié)果表明,實驗組大鼠的BDNF以及PSD-95的表達強度顯著低于對照組的大鼠且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,大鼠的BDNF以及PSD-95的表達都出現(xiàn)了下調(diào),表明海馬神經(jīng)元突觸傳遞變?nèi)?突觸的可塑性受到抑制,提示七氟醚麻醉大鼠導(dǎo)致大鼠的認知能力受損可能與抑制海馬體組織中神經(jīng)元的突觸可塑性有關(guān)。

Tau蛋白是在神經(jīng)元中與微管有關(guān)的含量最高的蛋白,主要存在于神經(jīng)元的軸突內(nèi),能促進微管的組裝并保持其穩(wěn)定性[7]。大量的實驗研究提示,Tau蛋白的異常磷酸化與記憶認知能力退化有密不可分的關(guān)系。。在正常成熟的腦內(nèi)平均僅僅只有幾個生理性磷酸化位點,但在某些病理狀態(tài)下,Tau蛋白異常的磷酸化位點遠高于正常水平,報道的某些病理性磷酸化位點已經(jīng)達到40個左右[8,9]。此外,Tau通過調(diào)節(jié)脯氨酸依賴性蛋白激酶來調(diào)節(jié)Tau蛋白的磷酸化的水平,這在體內(nèi)實驗中已經(jīng)得到證實[10]。異常的過度磷酸化的Tau蛋白以配對螺旋絲的形式構(gòu)成了神經(jīng)原纖維纏結(jié)并且在神經(jīng)細胞內(nèi)積聚[11]。這些在神經(jīng)細胞內(nèi)積聚的纏結(jié)影響了神經(jīng)元的正常功能,最終會致使神經(jīng)細胞變性甚至是死亡[12]。此次研究中,實驗組大鼠的Tau的表達強度顯著高于對照組且具有統(tǒng)計學(xué)意義,這也提示我們,大鼠在吸入七氟醚麻醉之后,可能會導(dǎo)致Tau的過度表達而導(dǎo)致大鼠的認知能力受損。

ApoE是一種血漿蛋白,其主要的合成器官為肝臟,但是也可在大腦中表達,其主要在星形膠質(zhì)細胞中合成[13]。ApoE與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和受損后的修復(fù)等過程有密切的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn),腦內(nèi)的ApoE過度表達可能與老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)形成有關(guān),一種可能的機制為ApoE加劇了β-淀粉樣肽的沉積,從而引起神經(jīng)元受損和行為異常[14-16]。在此次研究當(dāng)中,實驗組大鼠腦脊液中的ApoE顯著高于對照組大鼠,這也提示我們實驗組大鼠在吸入七氟醚之后可能出現(xiàn)了β-淀粉樣肽的沉積,從而導(dǎo)致大鼠的認知能力受損。

綜上所述,大鼠在吸入七氟醚之后認知能力與正常組大鼠相比出現(xiàn)了一定的障礙,而且Tau與ApoE的表達顯著升高,BDNF與PSD-95的表達顯著降低,表明新生期大鼠吸入七氟烷對其神經(jīng)及認知功能發(fā)育在早期有一定的影響。