楊小峰 張 靜 張沁榮

（1.忻州師范學(xué)院 山西忻州 034000；2.忻州市環(huán)境保護(hù)研究所 山西忻州 034000；3.南京師范大學(xué) 江蘇南京 210000）

一、研究背景及現(xiàn)狀

我國(guó)淡水資源嚴(yán)重不足，制約著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展，其中水資源時(shí)空分布不均是主要原因，另外水資源綜合利用率低，浪費(fèi)和污染嚴(yán)重，特別是隨著工業(yè)和農(nóng)業(yè)的發(fā)展，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，湖泊外源輸入性營(yíng)養(yǎng)鹽劇增，農(nóng)業(yè)化肥大量使用，城鎮(zhèn)生活污水的直接排放，飼料中營(yíng)養(yǎng)鹽的大量投入，使得水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題日益突出，成為威脅湖泊水體和水庫(kù)水質(zhì)的主要因素。水體富營(yíng)養(yǎng)化的危害是多方面的。水體富營(yíng)養(yǎng)化會(huì)使得水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能?chē)?yán)重受損，藍(lán)、綠藻水華頻發(fā)，破壞水生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)固性，減少水環(huán)境中的生物多樣性，破壞生態(tài)景觀，造成水生動(dòng)物的大量死亡。嚴(yán)重時(shí)，會(huì)成為制約發(fā)展中國(guó)家可持續(xù)發(fā)展的重要因素，進(jìn)而引起一系列巨大的經(jīng)濟(jì)損失，威脅人類(lèi)的生存和發(fā)展。

水體富營(yíng)養(yǎng)化的形成原因是復(fù)雜的。其中水體中營(yíng)養(yǎng)鹽的富集是引起水華爆發(fā)的直接導(dǎo)火索。而氮（N）磷（P）是引起藻類(lèi)生長(zhǎng)的主要生態(tài)因子。在我國(guó)，湖泊分布跨度較大，南北不同湖泊的水體富營(yíng)養(yǎng)化程度不同。在南方地區(qū)的湖泊水體富營(yíng)養(yǎng)化程度高，多發(fā)生由毒性微囊藻，舟形藻等藍(lán)藻造成的水華現(xiàn)象，在我國(guó)北方地區(qū)主要是小球藻、柵藻、席藻等綠藻造成。目前，人們對(duì)于湖泊水體生長(zhǎng)中氮磷元素的影響研究已經(jīng)取得一定進(jìn)展。但是水華現(xiàn)象的研究集中于水華頻發(fā)的南方湖泊，對(duì)北方地區(qū)水華現(xiàn)象的研究甚少。

斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），又稱(chēng)斜生柵列藻，屬于綠藻門(mén)，綠球藻目，柵藻科，柵藻屬，主要分布于我國(guó)北方靜水水體中，是引起綠藻水華的主要無(wú)毒性藻種。斜生柵藻含有蝦青素和細(xì)胞內(nèi)含豐富的蛋白質(zhì)，可作為水生動(dòng)物飼料；對(duì)氮磷有一定的耐受性，可作為評(píng)價(jià)水質(zhì)的指示生物；對(duì)氮磷元素去除率高，對(duì)重金屬有良好的吸附性，因此可用于廢水處理。自身還具有較高的油脂含量，可作為生物柴油。尤其是在夏季，斜生柵藻是湖泊、水庫(kù)、池塘、沼澤等靜水水體中的優(yōu)勢(shì)藻種，其具有易存活、繁殖能力強(qiáng)、環(huán)境耐受性強(qiáng)、氮磷利用率高等特點(diǎn)。綜上所述：本文通過(guò)實(shí)地考察與查找相關(guān)文獻(xiàn)確定將斜生柵藻作為實(shí)驗(yàn)藻種。

二、研究目的和意義

在藻類(lèi)生長(zhǎng)過(guò)程中，氮、磷為其生長(zhǎng)的必要生態(tài)因子。氮為藻類(lèi)蛋白質(zhì)和葉綠素的主要組成成分之一，而磷元素會(huì)直接參與藻類(lèi)光合作用的各個(gè)環(huán)節(jié)，水體中氮磷的含量會(huì)直接影響到藻類(lèi)生長(zhǎng)與葉綠素含量，且葉綠素a可作為藻類(lèi)生物量的表征，藻密度可作評(píng)價(jià)水環(huán)境富營(yíng)養(yǎng)的指標(biāo)。因此，根據(jù)文獻(xiàn)研究成果以及預(yù)實(shí)驗(yàn)的方法，設(shè)置了五個(gè)氮磷比梯度，分別為N:P=4:1、8:1、16:1、20:1、35:1，在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)斜生柵藻進(jìn)行為期兩周培養(yǎng)，同時(shí)每一濃度設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，測(cè)定不同階段藻液細(xì)胞密度，并測(cè)量葉綠素a的含量，分析不同氮磷比對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響，確定斜生柵藻生長(zhǎng)的最適氮磷濃度。為掌握富營(yíng)養(yǎng)化水體藻類(lèi)的生長(zhǎng)規(guī)律，監(jiān)控淡水水華爆發(fā)和指導(dǎo)生態(tài)修復(fù)富營(yíng)養(yǎng)化藻華水體提供數(shù)據(jù)支持。

三、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.實(shí)驗(yàn)藻種

實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)藻種為斜生柵藻。

2.主要儀器

AL204電子天平：梅特勒托利多儀器（上海有限公司）；BXM-30R立體壓力蒸汽滅菌器：

上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RZH-800A智能人工氣候箱：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；DK2000igital數(shù)碼顯微鏡：麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；UV2200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；1850R低速小型臺(tái)式低溫冷凍離心機(jī)：恒力離心機(jī)械設(shè)備有限公司；R300A實(shí)驗(yàn)室真空抽濾裝置：上海領(lǐng)德儀器有限公司。

3.主要試劑

硝酸鈉、焦磷酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、乙二胺四乙酸（EDTANa2）、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、蒸餾水、氯化鈣CaCl2·2H2O、碳酸鈉Na2CO3、硼酸H3BO3、四水氯化錳MnCl·4H2O、硫酸鋅ZnSO4、二水合鉬酸鈉、無(wú)水硫酸銅：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。以上試劑均為分析純。

4.培養(yǎng)基配制

本實(shí)驗(yàn)以未加入氮磷的BG-11培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，配置為不含氮磷的Stock1、Stock3、Stock4、Stock5。再根據(jù)實(shí)驗(yàn)氮磷梯度配置不同濃度的Stock2。其中培養(yǎng)基的主要氮源為硝酸鈉（NaNO3），主要的磷源為焦磷酸鈉（Na4P2O7·10H2O），通過(guò)調(diào)整Stock2中Na4P2O7·10H2O的取量，從而設(shè)置N:P=4:1、8:1、16:1、20:1、35:1五個(gè)氮磷比梯度，分別對(duì)藻類(lèi)進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)每組設(shè)置三個(gè)平行。

配制過(guò)程：

Stock1：稱(chēng)取0.3 g檸檬酸；0.3 g檸檬酸鐵銨；0.05 g EDTANa2溶于蒸餾水中，定容至100 mL。

Stock2：稱(chēng)取3 g NaNO3；0.15 g MgSO4·7H2O；Na4P2O7·10H2O（變量）溶于蒸餾水中，定容至100 mL。

Stock3：稱(chēng)取0.19 g CaCl2·2H2O溶于蒸餾水中，定容至100 mL。

Stock4：稱(chēng)取2 g Na2CO3溶于蒸餾水中，定容至100 mL。

Stock5：稱(chēng)取0.286 g H3BO3；0.181 g MnCl·4H2O；0.0222 g ZnSO4；0.0021 g·NaMoO4·2H2O；0.008 g CuSO4·5H2O溶于蒸餾水中，定容至100 mL。具體操作：量取2 mL的Stock1；20 mL的Stock2；2 mL的Stock3；1 mL的Stock4；1 mL的Stock5混合溶于蒸餾水中，定容到1 000 mL。

表1 培養(yǎng)液中磷濃度梯度

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.藻的培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)藻類(lèi)的培養(yǎng)采取批量培養(yǎng)方法。選用15個(gè)500 mL錐形瓶，進(jìn)行清洗、烘干、高壓滅菌。將不同氮磷比的300 mL培養(yǎng)液倒入錐形瓶中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行組，加入3 mL斜生柵藻液，封口膜封口后放入人工氣候培養(yǎng)箱中。在溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度約為50μmol/（m2·s），光暗比為12:12的條件下培養(yǎng)兩周。每天充分搖瓶3～4次并依次變換位置。所有操作均在無(wú)菌超凈臺(tái)完成。

2.生物量的測(cè)定

從接入藻種的第二天起，每隔一日于當(dāng)天19:00測(cè)定生物量。將藻液搖勻后取少量，用血球計(jì)數(shù)板于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。此過(guò)程連續(xù)重復(fù)七次持續(xù)觀察。

具體操作：

（1）先用自來(lái)水沖洗血球計(jì)數(shù)板，再用95%乙醇棉球輕輕擦洗后用水沖洗，最后用吸水紙吸干。蓋玻片也作同樣的清潔處理。

（2）將藻液搖勻，用滴管吸取少許，從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，讓藻液利用液體的表面張力充滿計(jì)數(shù)區(qū)，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液，然后加蓋蓋玻片。

（3）靜置片刻，待藻液自然沉降與穩(wěn)定后，可在顯微鏡下計(jì)數(shù)。在低倍鏡下尋找計(jì)數(shù)板大方格網(wǎng)，再在大方格網(wǎng)中央尋找計(jì)數(shù)室并將其移至視眼中央，轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察和計(jì)數(shù)。

（4）計(jì)數(shù)區(qū)是由25個(gè)中方格組成，按對(duì)角線方位，數(shù)左上a、左下b、右上c、右下d、中央e，5個(gè)中方格的藻數(shù)。為了保證計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計(jì)數(shù)和漏記，在計(jì)數(shù)時(shí)，對(duì)沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)統(tǒng)一的規(guī)定。菌體位于本格上線和左線上的細(xì)胞計(jì)入本格，本格的下線和右線上的細(xì)胞按規(guī)定計(jì)入相應(yīng)的格中。

（5）每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)2～3次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過(guò)大，否則重新操作），用Excel統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)并按公式計(jì)算出每mL藻懸液所含細(xì)胞數(shù)量。

（6）測(cè)數(shù)完畢，取下蓋玻片，用水將血球計(jì)數(shù)板沖洗干凈，自行晾干后，放入盒內(nèi)保存。

3.葉綠素a 的提取測(cè)定

本操作使用丙酮手動(dòng)研磨浸泡法。以90%丙酮為提取液，使用玻璃纖維濾膜抽濾收集斜生柵藻，避光研磨提取藻中葉綠素，在研磨浸泡后，經(jīng)過(guò)冷凍離心機(jī)離心，測(cè)定其750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波長(zhǎng)下的吸光度值，計(jì)算葉綠素a的含量。

三、討論與結(jié)論

（一）討論

潘非斐，吳楠在研究不同氮磷比對(duì)福建沿海米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響中得出：海米氏凱倫藻在N:P=32條件下比生長(zhǎng)率最快；雷鵬，孫成渤對(duì)水華微囊藻進(jìn)行19天的批量培養(yǎng)得出：微囊藻在N/P=16條件下，生長(zhǎng)繁殖情況最好。孫軍，劉東艷在研究不同氮磷比率對(duì)青島大扁藻、新月柱鞘藻和米氏凱倫藻生長(zhǎng)影響時(shí)得出：新月柱鞘藻在N:P=160時(shí)細(xì)胞比生長(zhǎng)速率最快，而青島大扁藻和米氏凱倫藻分別在4:1和80:1的條件下比生長(zhǎng)速率最快[26]。薄香蘭，劉興，竇勇等人在研究不同氮磷比對(duì)小球藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)及生長(zhǎng)的影響時(shí)得出：小球藻在N:P為17.30:1生長(zhǎng)最好。

本實(shí)驗(yàn)在使用B G-1 1 培養(yǎng)基模擬自然水體培養(yǎng)斜生柵藻時(shí)得出:斜生柵藻在批量連續(xù)培養(yǎng)14天，在N:P=16的情況下藻類(lèi)細(xì)胞密度最大，為17.53×104個(gè)/mL，生物量為40.11 mg/m3。在N:P=32的情況下藻類(lèi)細(xì)胞密度最小。

因此可以通過(guò)調(diào)節(jié)水體中氮磷比來(lái)預(yù)防或治理斜生柵藻引起的水華。在N:P=4的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)10天后，葉綠素a出現(xiàn)急速下降，可能是由于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件使其在達(dá)到最大值后，種間競(jìng)爭(zhēng)激烈出現(xiàn)大量死亡而造成的。其具體原因還有待進(jìn)一步研究。

（二）結(jié)論

氮磷元素為藻類(lèi)生長(zhǎng)的必要元素，氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽在水體中的比例也成為水華爆發(fā)的關(guān)鍵。在主要由斜生柵藻引發(fā)的水體富營(yíng)養(yǎng)化中，不同氮磷比對(duì)藻類(lèi)生長(zhǎng)影響的探究就尤為重要。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)測(cè)定，可以得出：

1.斜生柵藻的生長(zhǎng)情況與培養(yǎng)基初始氮磷比有顯著的相關(guān)性。不同氮磷比下斜生柵藻的生長(zhǎng)情況不同。

2.斜生柵藻最適生長(zhǎng)N：P為16:1，即當(dāng)磷含量為505.8 mg氮含量為3 000 mg，在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)12天時(shí)，細(xì)胞密度可達(dá)到最大，為17.53×104個(gè)/mL，生物量為40.11 mg/m3。其后依次為N:P=4:1，N:P=8:1，N:P=20:1，N:P=35:1。