許世艷，涂文嬌，朱科衡，劉瑜

(深圳市人民醫(yī)院 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院計(jì)劃生育科，深圳 518020)

在常規(guī)體外受精(IVF)助孕過程中受精失敗及低受精率是不可避免的，其中完全受精失敗率約為5%～10%，低受精率占IVF周期的5%～20%[1-2]。造成常規(guī)IVF低受精和完全不受精的原因尚未明確。低受精導(dǎo)致卵母細(xì)胞的利用率降低，而完全受精失敗導(dǎo)致患者的助孕過程提前終止，這些都將影響助孕效果并造成患者精神及經(jīng)濟(jì)的雙重負(fù)擔(dān)。IVF短時(shí)受精后對(duì)第2極體數(shù)量少于30%的患者實(shí)施早補(bǔ)救卵胞漿內(nèi)單精子注射(Early Rescue ICSI，R-ICSI)，R-ICSI在沒有擴(kuò)大ICSI指征的前提下，降低了受精失敗和低受精的發(fā)生率，深受輔助生殖業(yè)界學(xué)者的歡迎。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)短時(shí)受精會(huì)影響受精卵原核發(fā)育并導(dǎo)致多精受精比例增加[3]。觀察短時(shí)受精情況成為預(yù)測(cè)IVF受精失敗與否的主要方式，但短時(shí)受精可能因?yàn)槁涯讣?xì)胞老化錯(cuò)過最佳受精時(shí)機(jī)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育受影響。如果對(duì)每個(gè)IVF周期都行早期去顆粒細(xì)胞勢(shì)必會(huì)加重實(shí)驗(yàn)室人員的工作壓力，所以我們需要探尋預(yù)測(cè)受精失敗的生物標(biāo)志物以指導(dǎo)胚胎實(shí)驗(yàn)室人員為患者選擇最佳助孕方式，防止受精失敗的發(fā)生，同時(shí)又能不過度使用短時(shí)受精。在臨床上雖然精液常規(guī)檢查提供了有價(jià)值的資料，但很難預(yù)測(cè)精子的受精能力，也很難判斷可能存在的受精障礙。僅依據(jù)常規(guī)精液參數(shù)很難選擇最佳助孕方式(IVF或ICSI)，因此尋找可靠的精子功能指標(biāo)是必要的。目前生殖醫(yī)學(xué)界研究較多的有精子形態(tài)學(xué)檢查、頂體酶活性、DNA碎片率等，但精液常規(guī)和精子形態(tài)等傳統(tǒng)分析項(xiàng)目并不能滿足臨床深層次評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的需求。為減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)、增加受孕的成功率，通過探尋新的預(yù)測(cè)受精失敗與否的潛在生物標(biāo)志物來選擇有效助孕方式已成為一種趨勢(shì)。本研究回顧性分析2017年1月至2019年12月于我院生殖中心首次行IVF短時(shí)受精患者的臨床資料，在分析男性精液常規(guī)參數(shù)的基礎(chǔ)上比較精子功能指標(biāo)與受精率之間的關(guān)系，篩選影響IVF受精的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并繪制受試者工作曲線(ROC曲線)，旨在探討這些指標(biāo)單獨(dú)或聯(lián)合評(píng)估男性生育力及IVF受精率的價(jià)值，進(jìn)而為選擇最佳受精方式提供一些實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017年1月至2019年12月于我院生殖中心首次行IVF短時(shí)受精夫婦的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡≤45歲；(2)女方獲卵數(shù)≥4枚；(3)男性患者均有精子功能指標(biāo)的數(shù)據(jù)結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除卵母細(xì)胞未成熟或異常導(dǎo)致的受精失敗。

本研究共納入429個(gè)周期，根據(jù)受精結(jié)局不同分為2組：受精失敗或受精率<30%的為R-ICSI組(n=98)，受精率≥30%的為短時(shí)IVF組(n=331)。

二、主要試劑及儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(AMP-30D，Astec，日本)，SCA5計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀 (Computer-Aided Semen Analysis，CASA，西班牙)，相差熒光顯微鏡(OLYMPUS BX51，Olympus，日本)，輝光型化學(xué)發(fā)光照度計(jì)(FB12，Berthold，德國(guó))；精子頂體酶活性測(cè)定試劑盒、誘發(fā)精子頂體反應(yīng)(Acrosome Reaction After Ionophore challenge，ARIC)檢測(cè)試劑盒、精子酪氨酸磷酸化(TP)檢測(cè)試劑盒、精子染色試劑盒(Diff-Quik)、精子-透明質(zhì)酸結(jié)合試驗(yàn)(HBA)試劑盒等均購(gòu)自深圳市博銳德生物科技有限公司；IVF輸卵管緩沖液(ART-1023，Sage，美國(guó))，IVF授精液(ART-1020，Sage，美國(guó))。

三、研究方法

1.精液常規(guī)及形態(tài)學(xué)分析：男方檢測(cè)前均須禁欲2～7 d，通過手淫法對(duì)精液標(biāo)本進(jìn)行采集，待標(biāo)本液化后應(yīng)用SCA5計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀實(shí)施精液常規(guī)分析；按照第5版WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)[4]標(biāo)準(zhǔn)，分析精液量、精子濃度、精子活力、精子活動(dòng)率[前向運(yùn)動(dòng)精子(PR)+非前向運(yùn)動(dòng)精子(NP)]及精子形態(tài)；精子形態(tài)學(xué)分析采用Diff-Quik法染色，按照Kruger等[5]的標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行形態(tài)分類計(jì)數(shù)。

2.頂體酶活性定量：采用固相N-α-苯甲酰-DL-精胺酸-ρ-硝酰基苯胺(BAPNA)法檢測(cè)精子頂體酶活性，在錐形離心管中加入2 ml新鮮精液以及精子洗液4 ml，離心后制成0.5 ml精子懸液，收集約7.5×106個(gè)精子后按照精子頂體酶活性測(cè)定試劑盒要求在60 min內(nèi)完成檢測(cè)。

3.HBA：所有步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行檢測(cè)，即在包被有透明質(zhì)酸的載玻片表面的“T”孔(測(cè)定孔)內(nèi)加入液化的精液10 μl，蓋上蓋玻片，精液會(huì)自然擴(kuò)散到“C”孔(對(duì)照孔)內(nèi)，室溫反應(yīng)10 min后，用普通光學(xué)顯微鏡或相差顯微鏡觀察500個(gè)活動(dòng)精子，記錄精子尾部持續(xù)鞭打但頭部被結(jié)合在玻片表面難以自由前行的精子數(shù)量(成熟精子)。

4.精子頂體反應(yīng)(AR)檢測(cè)：依照ARIC檢測(cè)試劑盒的操作要求，將密度梯度法提取后的精子濃度調(diào)整至1×106個(gè)/ml后等分成2管，放置于5%CO2、37℃條件下孵育3 h，以誘導(dǎo)精子獲能；一管加入鈣離子載體A23187誘發(fā)15 min(誘發(fā)管)，另一管不加鈣離子載體但同步孵育15 min(自發(fā)管)，洗滌精子、涂片、自然干燥、固定，以豌豆凝集素?zé)晒鈽?biāo)記(PSA-FITC)4℃過夜檢測(cè)AR狀況，在熒光顯微鏡下分別觀察并計(jì)數(shù)。

5. TP檢測(cè)：將1 ml液化的新鮮精液放入5 ml無(wú)菌試管中，小心加入1.2 ml獲能培養(yǎng)液后，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，獲能2 h，吸取最上層0.8～1.0 ml含有活動(dòng)精子的培養(yǎng)液，洗滌精子后涂片、自然干燥、固定，覆以TP單克隆抗體-FITC結(jié)合物4℃過夜反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

6.觀察指標(biāo)：兩組患者一般資料、男性患者精子PR、精子濃度、精子正常形態(tài)率、頂體酶活性、AR、TP及HBA等。HBA發(fā)生率=(“T”孔被結(jié)合精子數(shù)/“T”孔活動(dòng)精子總數(shù)-“C”孔被結(jié)合精子數(shù)/“C”孔活動(dòng)精子總數(shù))×100%；誘發(fā)頂體反應(yīng)(IAR)發(fā)生率=誘發(fā)管中發(fā)生AR的精子數(shù)量/誘發(fā)管中被觀察的精子總數(shù)×100%；自發(fā)AR發(fā)生率=自發(fā)管中發(fā)生AR反應(yīng)的精子數(shù)量/自發(fā)管中被觀察的精子總數(shù)×100%；TP發(fā)生率=發(fā)生TP的精子數(shù)量/被觀察精子總數(shù)×100%。PR率=前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)/計(jì)數(shù)的精子總數(shù)×100%，正常精子率=正常精子數(shù)/計(jì)數(shù)的精子總數(shù)×100%。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者臨床資料比較

1.兩組中女方一般資料比較：與短時(shí)IVF組相比，R-ICSI組女方的不孕年限顯著增長(zhǎng) (P<0.05)，兩組的年齡、體重指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH、LH、E2、總促性腺激素(Gn)用量、Gn使用天數(shù)、獲卵數(shù)等比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者女方臨床資料比較(-±s)

2.兩組男性患者精液常規(guī)及功能參數(shù)比較：短時(shí)IVF組的331個(gè)周期中有174例精液樣本的精子濃度、PR率和正常形態(tài)率指標(biāo)正常，157例精液樣本的上述三項(xiàng)指標(biāo)中至少有一項(xiàng)不達(dá)標(biāo)；而在R-ICSI組中有40例精液達(dá)標(biāo)，58例精液不達(dá)標(biāo)。兩組男性患者的平均年齡、BMI、頂體酶含量、AR發(fā)生率、TP發(fā)生率和精子正常形態(tài)率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；R-ICSI組患者的PR率、IAR發(fā)生率、HBA發(fā)生率和精子濃度顯著低于短時(shí)IVF組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組男性患者精液常規(guī)及功能參數(shù)比較(-±s)

二、多因素Logistic分析精液參數(shù)對(duì)IVF受精率的影響

以上述差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素包括精子濃度、精子PR率、IAR發(fā)生率和HBA發(fā)生率，將這次因素作為自變量，以受精率為因變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，精子PR率、IAR發(fā)生率和HBA發(fā)生率是導(dǎo)致IVF受精率低的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表3)。

表3 Logistic回歸分析各項(xiàng)精液參數(shù)對(duì)IVF體外受精率的影響

三、ROC曲線

以R-ICSI組為實(shí)驗(yàn)組，短時(shí)IVF組為對(duì)照組，研究HBA、IAR、精子濃度、精子PR、聯(lián)合預(yù)測(cè)新變量Pre-1對(duì)IVF受精率的鑒別診斷效率(圖1和圖2)。經(jīng)過分析，HBA曲線下面積(AUC)為0.64[95%CI(0.58，0.70)]，最佳截?cái)嘀?8%，其靈敏度和特異度分別為71.43%和56.19%；IAR的AUC為0.62[95%CI(0.55，0.68)]，最佳界值為32.5%，其靈敏度和特異度分別為54.08%和65.56%；精子濃度的AUC為0.60[95%CI(0.53，0.66)]，最佳臨界值為30×106/ml，其靈敏度和特異度分別為68.37%和47.73%；精子PR的AUC為0.66[95%CI(0.60，0.72)]，最佳臨界值為33.8%，其靈敏度和特異度分別為57.14%和70.09%。多因素Logistic回歸新變量Pre-1的AUC為0.70[95%CI(0.64，0.76)]，靈敏度和特異度分別為66.33%和66.16%。以上各項(xiàng)精子參數(shù)及指標(biāo)對(duì)IVF受精率的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)受精結(jié)果判斷具有一定的診斷價(jià)值(表4)。

圖1 單個(gè)精液參數(shù)及精子功能指標(biāo)預(yù)測(cè)IVF受精率的ROC曲線

圖2 多因素聯(lián)合變量Pre-1預(yù)測(cè)IVF受精率的ROC曲線

表4 ROC曲線分析篩選指標(biāo)對(duì)IVF受精率的診斷效能

討 論

IVF過程不能完全避免受精失敗的發(fā)生，受精失敗的患者約占5%～10%，受精率低下(<30%)的患者在IVF治療周期中約占5%～20%。對(duì)受精率低的周期進(jìn)行R-ICSI會(huì)增大胚胎學(xué)家的工作量，同時(shí)ICSI的操作過程可能會(huì)損傷卵母細(xì)胞，且ICSI還可能會(huì)將染色體異常的精子注射到卵母細(xì)胞中，遺傳給子代[6]。因此，輔助生殖助孕方式的選擇需慎重。許多生殖中心目前都是在精液常規(guī)檢查的基礎(chǔ)上，根據(jù)精子濃度、精子PR以及精子正常形態(tài)率選擇IVF或ICSI授精方式，然而這種評(píng)估的診斷敏感性很低，并不能滿足臨床深層次評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的需求[7-9]。在男性因素造成的不育病例中，IVF操作前約有15%男性患者的精子常規(guī)檢查結(jié)果正常[7]。本研究中，R-ICSI組有41%(40/98)的患者上述3項(xiàng)精子指標(biāo)正常。因此，我們需要綜合評(píng)估精子功能指標(biāo)，如頂體酶活性、AR、精子PR及HBA等，預(yù)測(cè)它們對(duì)受精率的影響。

目前認(rèn)為精子濃度、精子PR及精子正常形態(tài)率均與IVF受精率有關(guān)，但仍沒有確切的標(biāo)準(zhǔn)來劃分其與受精失敗的關(guān)系。有報(bào)道指出精子正常形態(tài)率≤2%的患者，采用ICSI授精方式能降低受精失敗風(fēng)險(xiǎn)，提高正常受精率[10]。但本研究中尚未發(fā)現(xiàn)精子形態(tài)學(xué)對(duì)受精率有影響，對(duì)標(biāo)本分段統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)精子正常形態(tài)率≤1%會(huì)導(dǎo)致受精率低(數(shù)據(jù)未在本研究中展開)。我們的研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)IVF受精率不僅和精子濃度、精子PR有關(guān)，還與精子功能指標(biāo)中的HBA、IAR密切相關(guān)。透明質(zhì)酸是卵母細(xì)胞和透明帶黏液基質(zhì)的主要成分，對(duì)IVF受精過程中功能性精子的選擇起關(guān)鍵作用。透明質(zhì)酸與精子發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡、DNA碎片化、非整倍體染色體形成以及成熟度等有關(guān)[11]。通過HBA檢測(cè)精子與固相透明質(zhì)酸的結(jié)合能力，對(duì)預(yù)測(cè)精子受精能力有很大的臨床意義，有助于IVF或ICSI治療方式的選擇。HBA可以客觀反映精子的成熟度，包括細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的完整性。只有成熟的精子才能獲得與透明質(zhì)酸結(jié)合的能力。之前有不少學(xué)者通過比較HBA率與受精率之間的相關(guān)性來探討其對(duì)于受精能力的預(yù)測(cè)價(jià)值[11-15]。

AR是受精的必備條件，受精過程中精子必須完成AR才有可能穿入透明帶與卵膜融合從而完成受精；若頂體的結(jié)構(gòu)和功能有損，AR不足會(huì)導(dǎo)致精子失去受精能力，精子AR具有評(píng)價(jià)男性生育力的潛能。使用鈣離子載體A23187體外誘導(dǎo)Ca2+進(jìn)入獲能后，在精子內(nèi)部發(fā)生AR，是WHO推薦的評(píng)估精子受精能力的較好指標(biāo)。Katsuki等[16]認(rèn)為，IAR能為不孕不育患者選擇適當(dāng)?shù)妮o助生殖治療方案提供方向，其預(yù)測(cè)IVF完全不受精的AR率閾值是21%，建議當(dāng)AR率<21%時(shí)，選擇ICSI治療。Xu等[17]的研究團(tuán)隊(duì)利用meta分析對(duì)737例行IVF治療的不育夫婦進(jìn)行回顧性研究發(fā)現(xiàn)，IVF受精率與IAR存在顯著正相關(guān)。我們的研究數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn)R-ICSI組患者的IAR率與IVF組比較具有顯著性差異(P<0.05)。IAR的AUC為0.62，最佳界值為32.5%，其靈敏度和特異度分別為54.08%和65.56%(P<0.001)，提示IAR預(yù)測(cè)IVF受精率的價(jià)值高。同時(shí)我們的數(shù)據(jù)還提示自發(fā)AR、頂體酶活性預(yù)測(cè)IVF受精率的價(jià)值不大，這與之前文獻(xiàn)[18-20]的結(jié)論不太一致，可能是因?yàn)镽-ICSI組的精子樣本總數(shù)少或者精子活力差，尤其是那些精子總數(shù)少同時(shí)又合并精子活力差的患者，精子數(shù)量不夠完成功能指標(biāo)檢測(cè)。本研究還發(fā)現(xiàn)精子濃度、精子PR、HBA以及IAR與精子受精率有關(guān)。多因素Logistic回歸分析提示精子PR率、IAR發(fā)生率和HBA發(fā)生率是IVF受精率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。聯(lián)合變量Pre-1分析預(yù)測(cè)IVF受精失敗的價(jià)值要高于單個(gè)指標(biāo)，其AUC為0.70[95%CI(0.64，0.76)，P=0.000]。

目前尚沒有生殖中心能在取卵當(dāng)天，即在授精前完成精子相關(guān)功能指標(biāo)包括頂體酶活性、AR、TP及HBA的檢測(cè)。精子更新時(shí)間大約為70+d，一般來說在這段時(shí)間內(nèi)精子的各項(xiàng)指標(biāo)波動(dòng)不大。本研究所用精液為取卵前的精液，我們希望能通過周期內(nèi)男方精子功能指標(biāo)的檢測(cè)指導(dǎo)助孕患者選擇最佳助孕方式而不僅僅是為了研究。我們的資料還提示，R-ICSI組女方的不孕年限要顯著高于短時(shí)IVF組，提示不孕年限越高的女性在行輔助生殖助孕過程中越容易出現(xiàn)受精障礙。因此，對(duì)于那些不孕年限較長(zhǎng)的患者在臨床中要予以足夠的重視。

在輔助生殖技術(shù)治療過程中，精子濃度、精子PR和精子正常形態(tài)率均影響IVF的成敗，但對(duì)受精率的預(yù)測(cè)能力有限。在行IVF前有效判斷精子的各項(xiàng)指標(biāo)，可減少選擇受精方式時(shí)的盲目性。精子功能指標(biāo)的檢測(cè)，特別是IAR和HBA可作為新的預(yù)測(cè)受精結(jié)果的潛在生物標(biāo)志物，對(duì)輔助生殖助孕方式的選擇有一定的指導(dǎo)意義。