武露明，張虹，沈豪飛，王奕翔，賈天玉，張學(xué)紅，王一青*

(1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 甘肅省生殖醫(yī)學(xué)與胚胎重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000；3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院病理科，蘭州 730000)

隨著醫(yī)療水平的快速發(fā)展，輔助生殖技術(shù)可以滿足大部分不孕不育患者的生育要求，但仍有40%的患者不能受孕，其中包括反復(fù)移植失敗(recurrent implantation failure，RIF)[1]。RIF一直是困擾臨床醫(yī)生和胚胎學(xué)家的難題，多個(gè)周期的移植失敗會給患者帶來心理壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)等諸多問題。研究發(fā)現(xiàn)慢性子宮內(nèi)膜炎(chronic endometritis，CE)與RIF相關(guān)，CE在RIF人群中發(fā)病率為7.7%～56.1%[2-5]。CE是一種持續(xù)存在于子宮內(nèi)膜局部的慢性炎癥，臨床常表現(xiàn)為無癥狀，少數(shù)表現(xiàn)為異常子宮出血、盆腔疼痛、性交困難和白帶增多等[6]。CE診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為子宮內(nèi)膜間質(zhì)漿細(xì)胞浸潤，CD138是漿細(xì)胞的標(biāo)記物，現(xiàn)在已經(jīng)成為篩查CE的可靠標(biāo)志物[7]，臨床針對可疑CE患者常采用CD138免疫組化檢查。子宮內(nèi)膜類固醇激素水平在胚胎著床中起到關(guān)鍵作用，激素不足將導(dǎo)致胚胎著床失敗。目前研究雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)表達(dá)于宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜的情況較多[8-9]，但有關(guān)CE的研究較少。本研究通過檢測CE患者內(nèi)膜組織中ER與PR的表達(dá)情況并分析其相關(guān)性，以期對臨床治療提供新的參考。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2018年1月至2019年6月就診于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心的RIF患者80例(RIF組)和同期就診、暫未接受胚胎移植助孕治療的80例不孕患者(對照組)的臨床資料。RIF組的納入標(biāo)準(zhǔn)：40歲以下的患者；接受3次及以上胚胎移植周期(包括新鮮及冷凍移植周期)；累積移植至少4枚卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎而未能獲得臨床妊娠。對照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：40歲以下從未接受過胚胎移植周期的不孕患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：絕經(jīng)及圍絕經(jīng)期女性；凝血功能障礙；認(rèn)知功能障礙；子宮或附件切除女性。

RIF組中接受ER和PR受體檢測的患者共34例，根據(jù)是否患有子宮內(nèi)膜炎(CE)再次分組，分別為CE組(n=14)與非CE組(n=20)。CE的診斷參考其宮腔鏡下特點(diǎn)：(1)子宮內(nèi)膜局灶或彌漫性充血(草莓征)；(2)子宮內(nèi)膜間質(zhì)水腫(與月經(jīng)周期不符的內(nèi)膜增厚、發(fā)白、表面不規(guī)則)；(3)子宮內(nèi)膜微小息肉樣改變(息肉直徑小于1 mm)。

二、主要試劑和儀器

CD138鼠抗人單抗(MAB-0200)、PR兔抗人單抗(Kit-0013)、ER兔抗人單抗(Kit-0012)、即用型快捷免疫組化MaxVisionTMHRP試劑盒(抗鼠/兔，Kit-5030)及DAB顯色試劑盒(DAB-0031)均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；組織脫水機(jī)(TP1020，徠卡，德國)，石蠟包埋機(jī)(KEDEE-KD-BMII，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)、石蠟切片機(jī)(RM2245，徠卡，德國)，羅氏全自動免疫組化儀 (BenchMark XT，瑞士)，顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(IX73，OLYMPUS，日本)。

三、研究方法

1.宮腔鏡檢查及子宮內(nèi)膜收集：兩組患者均采用德國史托斯宮腔鏡觀察月經(jīng)干凈后3～7 d內(nèi)的子宮內(nèi)膜情況，并刮取部分子宮內(nèi)膜送檢。本研究中所涉及操作均征得患者同意并簽署知情同意書。

2.免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜組織中CD138、ER和PR的表達(dá)情況：宮腔鏡術(shù)后刮取部分子宮內(nèi)膜標(biāo)本，經(jīng)多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片(4 μm)后，放入羅氏全自動免疫組化儀進(jìn)行免疫組化染色，其中一抗孵育時(shí)間60 min，二抗孵育時(shí)間30 min，所用抗體均為即用型抗體。檢測判斷標(biāo)準(zhǔn)采用Kaku等[7]提出的：10個(gè)非重疊高倍鏡視野中至少檢出3個(gè)漿細(xì)胞定義為陽性；檢出漿細(xì)胞小于3個(gè)則為陰性。CD138陽性率=子宮內(nèi)膜組織CD138陽性患者例數(shù)/該組患者總例數(shù)×100%。

ER或PR染色為棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，常位于細(xì)胞核。每張片子隨機(jī)取5個(gè)視野，放大400倍計(jì)數(shù)每張鏡片陽性細(xì)胞的百分率并進(jìn)行評分，其中陽性細(xì)胞百分率1%～10%為1分；11%～25%為2分；26%～50%為3分；51%～75%為4分；大于75%為5分；每張切片亦根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，分別記為1、2、3、4、5分。每張切片的總評分=染色強(qiáng)度評分+陽性細(xì)胞百分率評分/2。結(jié)果判定均由同一名病理科醫(yī)師進(jìn)行。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者的一般情況比較

兩組患者的年齡、不孕年限、月經(jīng)周期、體重指數(shù)(BMI)、孕次、產(chǎn)次和雙側(cè)基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般情況比較(-±s)

二、免疫組化法檢測兩組患者子宮內(nèi)膜組織中CD138的表達(dá)情況

免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，RIF組患者子宮內(nèi)膜組織中CD138陽性率為17.5%(14/80)，對照組中CD138陽性率2.5%(2/80)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

A：CD138表達(dá)呈陽性子宮內(nèi)膜間質(zhì)(箭頭所示為陽性細(xì)胞)；B：CD138表達(dá)呈陰性的子宮內(nèi)膜間質(zhì)；C：兩組患者子宮內(nèi)膜CD138陽性率比較。與對照組比較，*P<0.05圖1 兩組患者子宮內(nèi)膜組織間質(zhì)中CD138的表達(dá)情況及比較(免疫組化，×400)

三、RIF中CE組與非CE組患者子宮內(nèi)膜中ER和PR的表達(dá)情況

RIF組中接受ER和PR受體檢測的患者共34例，根據(jù)是否患有CE分為CE組(n=14)與非CE組(n=20)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜的間質(zhì)及腺體中均存在ER和PR表達(dá)(圖2)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，CE組與非CE組中ER的表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)；而PR的表達(dá)組間比較無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

A：非CE組ER的表達(dá)情況；B：CE組ER的表達(dá)情況；C：非CE組PR的表達(dá)情況；D：CE組PR的表達(dá)情況圖2 CE組與非CE組患者子宮內(nèi)膜中ER和PR的表達(dá)情況(免疫組化，×400，黑色箭頭表示腺體，紅色箭頭表示間質(zhì))

與非CE組比較，*P<0.05圖3 CE組與非CE組患者ER和PR表達(dá)的評分比較

討 論

子宮內(nèi)膜受到雌孕激素的調(diào)控，其中雌激素對內(nèi)膜上皮細(xì)胞的增殖、形態(tài)變化、細(xì)胞分化和分泌起到重要作用。ER的表達(dá)在子宮內(nèi)膜增生早期達(dá)到高峰，在子宮內(nèi)膜增生晚期和分泌早期略有下降。ER是雌激素影響子宮血管重建和內(nèi)膜再生的橋梁。有研究發(fā)現(xiàn)在不明原因的不孕患者中子宮內(nèi)膜ER和PR的陽性表達(dá)顯著減少(P<0.05)，認(rèn)為ER和PR表達(dá)下降會導(dǎo)致子宮內(nèi)膜成熟障礙及內(nèi)膜對胚胎植入的容受性改變[10]。Guleria等[11]在一項(xiàng)前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，放置宮內(nèi)節(jié)育器患者的子宮內(nèi)膜ER和Ki-67蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，但血清雌二醇和孕酮水平無顯著變化(P>0.05)，提示血清性激素水平不一定能準(zhǔn)確反映子宮內(nèi)膜激素受體狀態(tài)。

有研究表明，子宮內(nèi)膜微生態(tài)失調(diào)是IVF、RIF及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要原因之一[12]。子宮內(nèi)膜微環(huán)境影響子宮內(nèi)膜激素受體狀態(tài)，在正常月經(jīng)周期中腺體和基質(zhì)對類固醇調(diào)節(jié)的敏感性是不同的。有研究認(rèn)為20%的CE患者子宮內(nèi)膜腺腔和間質(zhì)中有中性粒細(xì)胞聚集，彌漫性炎癥的存在可能干擾子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)細(xì)胞ER的表達(dá)[13]。此外，越來越多的證據(jù)表明，生殖道炎性反應(yīng)在宮腔粘連的發(fā)病中亦扮演了重要角色。早在19世紀(jì)80年代，就有學(xué)者提出慢性或亞急性子宮內(nèi)膜炎是宮腔粘連形成的危險(xiǎn)因素[14]。Czernobilsky[15]認(rèn)為，宮腔粘連是子宮內(nèi)膜在慢性炎癥作用下形成的纖維化型子宮內(nèi)膜炎。而宮腔粘連也是引起RIF的一個(gè)重要原因。近年來有研究亦表明，宮腔粘連合并CE的患者粘連復(fù)發(fā)率顯著高于非CE組(44.8% vs. 20.8%)[16]，提示宮腔粘連患者同樣伴有子宮內(nèi)膜微環(huán)境的改變。國內(nèi)一些學(xué)者的研究也側(cè)面驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)，他們發(fā)現(xiàn)宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜組織中ER表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)，PR在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)與對照組則沒有顯著性差異(P>0.05)，而且ER表達(dá)水平與宮腔粘連術(shù)后雌激素治療的療效呈正相關(guān)[9，17]。

本研究基于Liu等[18]的研究結(jié)果，依據(jù)CD138免疫組化染色結(jié)果將RIF組患者根據(jù)是否患有CE進(jìn)一步分為CE組與非CE組，并對子宮內(nèi)膜分別進(jìn)行ER和PR免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，CE組患者子宮內(nèi)膜中間質(zhì)與腺體中的ER表達(dá)水平顯著高于非CE組(P<0.05)，但兩組患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體中PR的表達(dá)比較并無顯著性差異(P>0.05)。Gibreel等[19]發(fā)現(xiàn)，不孕患者行子宮內(nèi)膜搔刮術(shù)后加用雌孕激素聯(lián)合治療對CE有效，ER高表達(dá)的CE患者對雌激素更加敏感，行子宮內(nèi)膜搔刮術(shù)可以導(dǎo)致內(nèi)膜局部的損傷，聯(lián)合應(yīng)用雌孕激素可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化，從而提高胚胎移植移植率。

綜上所述，RIF與CE具有相關(guān)性，針對有3次及以上胚胎移植周期失敗的患者建議行免疫組化染色，以排除子宮及內(nèi)膜因素對胚胎著床的影響；且ER在CE患者子宮內(nèi)膜間質(zhì)中高表達(dá)，提示對于CE患者同時(shí)檢測ER的表達(dá)情況對于后續(xù)制定個(gè)性化激素治療方案有益。但本研究尚存在一定的局限性，首先本研究未檢測藥物治療后ER和PR的表達(dá)情況；其次樣本量過少。后期尚需要大樣本的多中心研究進(jìn)一步探討ER和PR在CE患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)了解炎性狀態(tài)下內(nèi)膜功能層及基底層ER和PR的表達(dá)情況。