邵淑敏，汪文諍，張玲，2，于江宇

(華中科技大學同濟醫(yī)學院 1.生殖醫(yī)學中心；2.生殖健康研究所，武漢 430030)

卵母細胞玻璃化冷凍在臨床中應用日益增多，如：體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療時，男方由于某種原因取精失敗等不能行體外授精時，可將卵母細胞冷凍保存，待獲取男方精子后，將冷凍卵母細胞解凍后再行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)-ET治療，可提高卵母細胞的利用率，最大程度地降低不孕夫婦的損失；腫瘤患者進行放化療會損傷卵巢功能，將卵母細胞進行冷凍保存，可保存其生殖能力；卵巢反應不良患者多次取卵，冷凍保存來募集卵母細胞數(shù)量；卵母細胞冷凍保存后用于捐贈等[1]。玻璃化冷凍避免了卵母細胞在冷凍-復蘇過程中胞質(zhì)冰晶的形成，使其冷凍復蘇率和胚胎發(fā)育潛能獲得一定的提高，并于1999年獲得首例玻璃化冷凍卵母細胞來源的健康嬰兒[2]。隨著玻璃化冷凍技術(shù)和ICSI技術(shù)的發(fā)展，卵母細胞玻璃化冷凍逐漸成為臨床上重要的一種衍生技術(shù)，至今有將近4 000個來源于玻璃化冷凍卵母細胞的新生兒出生[3]。

雖然卵母細胞玻璃化冷凍技術(shù)已在輔助生殖中心實驗室中普遍應用，但每個生殖中心的玻璃化冷凍操作規(guī)程均不一致，卵母細胞復蘇率和臨床妊娠率差異也較大。本研究回顧性分析本中心因取卵日取精失敗或卵母細胞捐贈行卵母細胞玻璃化冷凍，復蘇后行ICSI治療患者的受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率和種植率等臨床結(jié)局，以及流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、新生兒出生體重等妊娠產(chǎn)科結(jié)局，與同期新鮮卵母細胞ICSI治療結(jié)局相比較，探討卵母細胞玻璃化冷凍技術(shù)在輔助生殖治療中臨床應用的可行性和有效性，并為規(guī)范卵母細胞玻璃化冷凍操作方法提供參考依據(jù)。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2018～2019年在本生殖中心行IVF-ET治療，但因取卵日取精失敗或卵母細胞捐贈行卵母細胞玻璃化冷凍的14例患者(冷凍組)的臨床資料。14例患者共有99枚卵母細胞玻璃化冷凍復蘇后行ICSI治療。

患者納入標準：女方年齡≤35歲，卵巢功能正常；卵母細胞捐贈者年齡≤35歲。排除標準：子宮內(nèi)膜<6 mm或子宮內(nèi)膜曾發(fā)生粘連等損傷；子宮畸形如雙角子宮、子宮縱膈等；子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌癥；輸卵管積水；染色體異常等。

選擇同期在本生殖中心行新鮮卵母細胞ICSI周期的88例患者為新鮮組。統(tǒng)計分析兩組患者ICSI周期的臨床結(jié)局和妊娠產(chǎn)科結(jié)局。

二、研究方法

1.卵母細胞玻璃化冷凍/復蘇：卵母細胞玻璃化冷凍在取卵后2 h左右進行。冷凍前用80 IU透明質(zhì)酸酶(Sigma，美國)將卵母細胞周圍大部分的顆粒細胞脫去，選擇MⅡ成熟卵母細胞進行冷凍。采用玻璃化冷凍試劑盒(KITAZATO，日本)在室溫下進行冷凍，在3002皿蓋(BD，美國)制作ES、VS液滴各兩滴，每滴200 μl，置于室溫下至少30 min預溫。冷凍過程：將卵母細胞置于ES滴，平衡10～15 min，具體時間可根據(jù)卵母細胞皺縮后復原的時間為準。復原后置入VS滴，平衡90 s，放置于載桿上，迅速將載桿一端置入液氮中，并來回水平移動數(shù)次，垂直投入液氮，冷凍保存。

卵母細胞玻璃化復蘇：采用玻璃化解凍試劑盒(KITAZATO，日本)，在3007皿(BD，美國)中制作WS1液滴，在五孔皿(Vitrolife，美國)中制作WS2、WS3、WS4液滴，WS1液滴置于37℃恒溫培養(yǎng)箱(無需CO2)中預熱，其余置于室溫下至少30 min平衡。從液氮中取出載桿，分別進行如下操作：WS1，1 min，37℃熱臺上操作；其余步驟在室溫下操作：WS2，3 min；WS3，5 min；WS4，3 min，然后將卵母細胞放入卵裂期培養(yǎng)液G1 Plus(Vitrolife，美國)培養(yǎng)液中清洗，并放入桌面培養(yǎng)箱(COOK，澳大利亞)中培養(yǎng)。

2.ICSI授精：男方禁欲2～7 d，于卵母細胞復蘇日手淫法取精，待精液完全液化后，根據(jù)精子活力和濃度，應用商品化密度梯度液Spermgrad(Vitrolife，美國)，采用密度梯度離心結(jié)合上游法或直接離心法優(yōu)化處理精液。卵母細胞復蘇后培養(yǎng)2 h，選擇復蘇后存活的MⅡ卵母細胞進行ICSI授精，然后將ICSI后卵母細胞轉(zhuǎn)入卵裂期培養(yǎng)液G1 Plus(Vitrolife，美國)，置入桌面培養(yǎng)箱(COOK，澳大利亞)中培養(yǎng)。

3.胚胎評估：ICSI受精后培養(yǎng)16～18 h觀察原核形成情況，若觀察到出現(xiàn)雙原核和兩個極體，則為正常受精；若觀察到多原核或單原核，則為異常受精。胚胎培養(yǎng)第2天和第3天觀察胚胎細胞卵裂情況并按照編號進行詳細記錄，包括觀察時間、細胞數(shù)、胚胎分級、均勻度、碎片、空泡、多核等，胚胎培養(yǎng)第3天根據(jù)胚胎發(fā)育情況決定移植及冷凍的胚胎；異常受精胚胎在胚胎培養(yǎng)第3天直接廢棄。

根據(jù)胚胎卵裂球大小是否一致、碎片率及細胞質(zhì)顆?，F(xiàn)象，將胚胎分為4級，卵裂期胚胎評分標準[4]：Ⅰ級：胚胎卵裂球等大，形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)均勻清晰，碎片無或少于10%。Ⅱ級：胚胎卵裂球不等，形態(tài)欠規(guī)則，碎片10%～25%。Ⅲ級：胚胎卵裂球大小不均，形態(tài)欠規(guī)則，碎片25%～50%。Ⅳ級：胚胎卵裂球大小嚴重不均，碎片大于50%。

囊胚分級標準：根據(jù)Gardner評分系統(tǒng)[5]，對囊胚進行分級，包括囊胚腔分期、內(nèi)細胞團分級及滋養(yǎng)細胞層分級。其中，囊胚腔分期(1～6期)：1期為囊胚腔<胚胎總體積的1/2；2期為囊胚腔≥胚胎總體積的1/2；3期為囊胚腔充滿整個胚胎；4期為囊胚腔充滿整個胚胎，并且胚胎總體積變大，透明帶變?。?期為囊胚部分從透明帶中逸出；6期為囊胚全部從透明帶中逸出。內(nèi)細胞團分級(A～C級)：A級為細胞數(shù)目多，排列緊密；B級為細胞數(shù)目少，排列松散；C級為細胞數(shù)目極少。滋養(yǎng)層細胞分級(A～C級)：A級為上皮細胞層由較多的細胞組成，結(jié)構(gòu)致密；B級為上皮細胞層由不多的細胞組成，結(jié)構(gòu)松散；C級為上皮細胞層由稀疏的細胞組成。

4.胚胎移植：B超監(jiān)測卵泡發(fā)育和內(nèi)膜情況，排卵日內(nèi)膜厚度>7 mm時，開始肌肉注射黃體酮進行黃體支持，當日玻璃化復蘇卵母細胞并行ICSI授精，胚胎培養(yǎng)第3～5天行胚胎移植。胚胎移植后14 d測定血清中β-HCG值，胚胎移植后35 d進行超聲檢查，宮腔內(nèi)見孕囊或流產(chǎn)物見絨毛確診為臨床妊娠。

三、臨床結(jié)局和妊娠產(chǎn)科結(jié)局指標

臨床結(jié)局觀察指標包括卵母細胞復蘇率(卵母細胞復蘇后存活數(shù)占復蘇卵母細胞總數(shù)的比例)、受精率(包括總受精率：2PN卵母細胞數(shù)、1PN數(shù)和多PN數(shù)占注射MⅡ卵母細胞總數(shù)的比例；正常受精率：受精后第1天(D1)出現(xiàn)2PN卵母細胞數(shù)占注射MⅡ卵母細胞總數(shù)的比例)、卵裂率(正常受精卵裂胚胎數(shù)占受精卵母細胞數(shù)的比例)、優(yōu)質(zhì)胚胎率(來源于正常受精卵，且受精后D3胚胎細胞數(shù)為7～9個，碎片程度小于10%的胚胎比例)、臨床妊娠率(臨床妊娠周期數(shù)占移植周期數(shù)的比例)、種植率(孕囊數(shù)占移植胚胎數(shù)目的比例)。

妊娠產(chǎn)科結(jié)局觀察指標包括異位妊娠率、早期流產(chǎn)率(<12孕周流產(chǎn)者比例)、晚期流產(chǎn)率(12～27+6孕周流產(chǎn)者比例)、活產(chǎn)率、早產(chǎn)率(28～36+6孕周分娩者比例)、巨大兒(出生體重≥4 000 g)、低出生體重兒(出生體重1 500～2 499 g)、新生兒出生缺陷率、圍產(chǎn)兒死亡率(妊娠28足周后的死胎、死產(chǎn)及新生兒出生1周內(nèi)的死亡比例)。

四、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。顯著性檢驗采用卡方檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、兩組患者基礎(chǔ)資料比較

本生殖中心有14例患者進行卵母細胞玻璃化冷凍復蘇，共有99枚卵母細胞復蘇后行ICSI-ET周期(冷凍組)，女方平均年齡(30.86±3.74)歲。新鮮卵母細胞ICSI-ET周期(新鮮組)88例為對照，平均年齡(32.29±1.90)歲。兩組間女方平均年齡、不孕年限和基礎(chǔ)FSH值比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；兩組間男方平均年齡、精子濃度和精子活力比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 冷凍組和新鮮組患者基礎(chǔ)資料比較 (-±s)

二、兩組實驗室指標和臨床結(jié)局分析

1.實驗室指標：99枚卵母細胞行玻璃化冷凍復蘇，存活84枚，卵母細胞復蘇率84.85%；84枚成熟卵母細胞行ICSI授精，受精61枚，總受精率72.62%，其中正常受精卵56枚，正常受精率66.67%；胚胎培養(yǎng)第3天形成胚胎55枚，卵裂率98.21%，其中優(yōu)質(zhì)胚胎24枚，優(yōu)質(zhì)胚胎率43.64%。冷凍組和新鮮組的MⅡ卵率、受精率、卵裂率比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但冷凍組的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著低于新鮮組(P<0.05)(表2)。

表2 冷凍組和新鮮組實驗室指標比較(%)

2.臨床結(jié)局：冷凍組新鮮胚胎移植周期10例，獲得6例臨床妊娠，臨床妊娠率60.00%；移植19枚卵裂期胚胎，其中6枚胚胎著床，胚胎種植率31.58%。冷凍組和新鮮組移植時女方年齡和移植胚胎數(shù)比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；雖然新鮮組的臨床妊娠率和胚胎種植率均略高于冷凍組，但尚無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。進一步分析兩組間卵裂期胚胎和囊胚移植的臨床結(jié)局發(fā)現(xiàn)，兩組間卵裂期胚胎的臨床妊娠率和胚胎種植率比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；由于冷凍組無囊胚移植周期，因此兩組間囊胚移植的臨床結(jié)局未做統(tǒng)計學分析(表3)。

三、妊娠產(chǎn)科結(jié)局分析

子代隨訪結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，冷凍組和新鮮組的異位妊娠率、早期流產(chǎn)率、晚期流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、低出生體重率、巨大兒率、新生兒出生缺陷率、圍產(chǎn)兒死亡率等產(chǎn)科結(jié)局比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。兩組間性別比也無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，男女性別比分別為1∶1和1∶0.84(表4)。

表3 冷凍組和新鮮組臨床結(jié)局比較[(-±s)，%]

表4 冷凍組和新鮮組妊娠產(chǎn)科結(jié)局比較(%)

討 論

卵母細胞體表比例大，胞內(nèi)含有大量水分，胞膜滲透性差，紡錘體對溫度敏感，冷凍-復蘇過程可影響染色體和微觀結(jié)構(gòu)的正常，使冷凍卵母細胞的復蘇存活率、受精率、胚胎發(fā)育能力和臨床妊娠率較低[6]。目前國內(nèi)外很多研究小組通過改進冷凍方法、穩(wěn)定卵母細胞結(jié)構(gòu)、改善代謝水平來提高其冷凍結(jié)局，但研究進展相對緩慢[7-8]。卵母細胞玻璃化冷凍采用開放式的操作方式，利用高濃度的冷凍保護劑，將卵母細胞直接暴露于液氮中，使其超快速冷凍達到玻璃化狀態(tài)，減少冰晶形成，降低冷凍-復蘇過程對卵母細胞的損傷；卵母細胞玻璃化冷凍有利于減數(shù)分裂紡錘體的迅速恢復，可明顯提高卵母細胞的復蘇存活率和臨床妊娠率[9]。

本研究回顧性分析玻璃化冷凍卵母細胞的復蘇存活率以及ICSI治療的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率和胚胎種植率等實驗室和臨床結(jié)局指標，以新鮮卵母細胞ICSI周期為對照組進行比較分析，數(shù)據(jù)表明玻璃化冷凍卵母細胞的復蘇存活率為84.85%，這與其他研究報告的復蘇存活率85.6%[10]相近；冷凍卵母細胞ICSI的優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著低于新鮮卵母細胞(P<0.05)。Braga等[11]報道，與新鮮卵母細胞組胚胎相比，玻璃化冷凍卵母細胞組的胚胎質(zhì)量和囊胚形成率均較低；Coticchio等[12]也發(fā)現(xiàn)卵母細胞玻璃化冷凍復蘇后，其紡錘體和赤道染色體排列正常率為32.6%，遠低于新鮮卵母細胞的59.1%，冷凍組的胚胎質(zhì)量顯著低于新鮮組，可能是因為玻璃化冷凍會對卵母細胞的紡錘體和染色體等造成不同程度的損傷，使胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛力降低。此外，玻璃化冷凍卵母細胞mRNA丟失率高達36.7%，也可能是導致玻璃化冷凍卵母細胞形成的胚胎發(fā)育潛力降低的重要因素[13]。

本研究顯示，冷凍組和新鮮組的受精率、卵裂率、臨床妊娠率和胚胎種植率比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，冷凍組移植優(yōu)質(zhì)胚胎后可獲得與新鮮組相似的臨床結(jié)局。Meta分析也表明玻璃化冷凍卵母細胞和新鮮卵母細胞行IVF/ICSI治療的受精率、卵裂率和臨床妊娠率無統(tǒng)計學差異[14]；美國一項關(guān)于卵母細胞慢速冷凍或玻璃化冷凍的回顧性分析研究顯示，年輕患者(女方年齡<37歲)冷凍卵母細胞的復蘇存活率為89%、受精率為78%、種植率為45%、移植周期活產(chǎn)率為58%，年輕患者冷凍卵母細胞可獲得與新鮮卵母細胞相似的臨床結(jié)局[15]。因此美國生殖醫(yī)學協(xié)會頒布的卵母細胞冷凍保存指南提出卵母細胞冷凍復蘇應該不再被認為是一種實驗技術(shù)，而是可應用于臨床[9]。但這些試驗數(shù)據(jù)大部分來源于年輕患者，數(shù)據(jù)結(jié)果不能直接反映其他患者群體，尤其是高齡患者。意大利多中心數(shù)據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，新鮮卵母細胞的臨床結(jié)局優(yōu)于慢速冷凍卵母細胞，每周期移植兩枚胚胎時，冷凍卵母細胞周期的受精率、種植率、妊娠率和活產(chǎn)率均低于新鮮卵母細胞周期[16]；來源于193家生殖中心共計120 000個IVF周期的大數(shù)據(jù)分析也表明新鮮卵母細胞移植周期的種植率和臨床妊娠率高于冷凍卵母細胞[17]。中華醫(yī)學會中國專家共識也提出卵母細胞冷凍技術(shù)還不成熟，臨床應用時間較短，安全性有待觀察，應謹慎應用[18]。

冷凍卵母細胞臨床結(jié)局的差異可能是由于各項研究中患者群體的選擇和卵母細胞冷凍方案的差異造成的。Ubaldi等[19]研究表明年齡是影響冷凍卵母細胞成功率的重要因素，高齡患者(女方年齡>38歲)冷凍卵母細胞的種植率、臨床妊娠率和持續(xù)妊娠率明顯低于年輕患者，不同年齡段患者(女方年齡<34歲、35～37歲、38～40歲、41～43歲)的移植周期臨床妊娠率分別為48.6%、24.1%、23.3%和22.2%，冷凍復蘇卵母細胞移植周期的妊娠率隨著女方年齡的增加而逐漸降低；冷凍方案的選擇也會影響冷凍卵母細胞復蘇存活率和臨床結(jié)局，玻璃化冷凍卵母細胞的復蘇存活率、受精率、囊胚發(fā)育和臨床妊娠率明顯高于慢速冷凍。但也有研究表明卵母細胞玻璃化冷凍和慢速冷凍的成功率相似，且卵母細胞玻璃化冷凍也會對卵母細胞的染色體、紡錘體和透明帶等造成一定程度的損傷，因此患者群體、冷凍方案、冷凍保護劑的選擇和濃度、封閉式或開放式冷凍載桿和復蘇速率均會影響冷凍卵母細胞的妊娠率[9]。

本研究中冷凍組和新鮮組間流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、低出生體重率、巨大兒率、新生兒出生缺陷率、圍產(chǎn)兒死亡率等妊娠產(chǎn)科結(jié)局比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。據(jù)相關(guān)文獻報道，冷凍和新鮮卵母細胞在胎兒及圍產(chǎn)期并發(fā)癥和先天異常的發(fā)生率上并沒有顯著差異[20]。卵母細胞的玻璃化冷凍并不會降低患者臨床妊娠率，也不會導致胎兒圍產(chǎn)期并發(fā)癥和先天異常的增加，在輔助生殖治療中，可作為取精失敗或腫瘤患者生育力保存等有效的補救措施[21]。

目前臨床上缺乏標準的卵母細胞玻璃化冷凍方案。本生殖中心中收集的冷凍卵母細胞數(shù)據(jù)均來源于年輕患者，HCG注射后36 h取卵，卵母細胞取出后短暫培養(yǎng)2 h，用透明質(zhì)酸酶消化后脫掉卵母細胞周圍大部分的顆粒細胞，注意勿過度消化；脫顆粒細胞后培養(yǎng)30 min行卵母細胞玻璃化冷凍，采用連線法在冷凍保護劑ES液滴中平衡10～15 min，待卵母細胞皺縮復原后轉(zhuǎn)入VS液滴中，平衡90 s，此處平衡時間不能過短，要使卵母細胞與VS液滴充分作用，迅速裝入冷凍載桿中投入液氮；卵母細胞復蘇后培養(yǎng)2 h，即可進行ICSI授精。玻璃化冷凍方法可提高卵母細胞受精率，降低卵母細胞退化率。雖然卵母細胞玻璃化冷凍復蘇后可獲得良好的受精率和臨床結(jié)局，但也無法避免ICSI本身存在的風險。卵母細胞玻璃化冷凍技術(shù)對母體和子代的短期風險較低，但與其他輔助生殖技術(shù)應用一樣，仍需要注意其對人類遠期健康影響的數(shù)據(jù)積累和研究。