殷欣欣，崔照領(lǐng)，馬麗靜，莫世嬌，楊永紅，莫中福

(石家莊市婦幼保健院1.產(chǎn)科；2.功能科；3.婦產(chǎn)急診ICU；4.產(chǎn)前診斷中心；5.婦產(chǎn)科，石家莊 050000)

胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)屬于臨床上妊娠疾病，指胎兒無法在子宮內(nèi)充分發(fā)揮其生長(zhǎng)潛能，導(dǎo)致足月妊娠胎兒出生體重<2 500 g或胎兒體重低于同孕齡平均體重的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或第10百分位數(shù)，其發(fā)病率高達(dá)5%～10%，是圍生兒發(fā)病及畸形的主要病因之一，嚴(yán)重者可威脅生命[1-3]。目前FGR臨床診斷困難，療效甚微，其病因多及機(jī)制復(fù)雜，迄今仍未完全明了，因此尋求分子生物學(xué)診斷指標(biāo)深入探尋其發(fā)病機(jī)制并監(jiān)測(cè)、評(píng)估胎兒生長(zhǎng)狀況對(duì)臨床及早采取相應(yīng)措施改善預(yù)后具有重要意義。胎盤是胎兒生長(zhǎng)發(fā)育、維持血運(yùn)充足及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取的重要保障，若其發(fā)生功能障礙則會(huì)對(duì)胎兒自身發(fā)育造成嚴(yán)重影響[4-5]。胰島素樣生長(zhǎng)因子-2(insulin-like growth factor-2，IGF-2)是胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)系統(tǒng)成員之一，血液中主要來自于肝臟，對(duì)人體細(xì)胞、器官的正常生長(zhǎng)、分化、發(fā)育有重要作用，可以通過自分泌或旁分泌方式結(jié)合相應(yīng)受體，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等[6]。蔡滿紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖尿病巨大兒患者胎盤組織中IGF-2水平顯著高于正常對(duì)照組，且提示IGF-2高表達(dá)水平與妊娠期糖尿病巨大兒發(fā)生關(guān)系密切。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein-3，IGFBP-3)是一種細(xì)胞外分泌蛋白，能與IGFs結(jié)合并調(diào)節(jié)游離IGFs活性參與胎兒生長(zhǎng)發(fā)育[8]。陶麗靜等[9]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期糖尿病巨大兒患者臍血中IGFBP-3水平顯著高于正常妊娠組，提示IGFBP-3水平與胎兒宮內(nèi)發(fā)育密切相關(guān)。目前關(guān)于IGF-2、IGFBP-3在產(chǎn)婦外周血及新生兒臍血中表達(dá)水平與胎兒生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系研究較多，而在FGR患者胎盤組織中的表達(dá)情況及意義少有報(bào)道，因此本研究同時(shí)分析二者在FGR患者胎盤組織中表達(dá)及意義，以期為深入研究FGR發(fā)病機(jī)制提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017年12月至2019年12月于本院經(jīng)超聲確診FGR并住院分娩的孕婦110例為FGR組，年齡22～36歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合樂杰主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》第9版教材[10]中有關(guān)FGR診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)一般資料完整；(3)單胎無合并癥孕婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)心臟、肝臟、腎臟功能異常者；(2)原發(fā)性高血壓患者；(3)患有妊娠合并癥如前置胎盤患者；(4)妊娠合并癥者；(5)胎兒染色體異常者。另選擇在本院同期分娩的正常單胎足月孕婦110例為對(duì)照組，年齡20～35歲。所有受試者均為單胎、初產(chǎn)婦，月經(jīng)周期規(guī)律、末次月經(jīng)明確。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批并通過。

二、主要試劑及儀器

TRIzol試劑(MN562J2)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(J6547M)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(N5643MJ)購自美國(guó)Sigma公司；TakaRa PrimeScript RT試劑盒(ND6527J)、SYBR Premix ExTaq試劑盒(GH8935K)均購自蘇州泓迅生物科技股份有限公司；IGF-2、IGFBP-3及內(nèi)參GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司合成；鼠抗人IGF-2多克隆抗體(ND4672-8)、鼠抗人IGFBP-3多克隆抗體(M9382-9)，購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑(627925)、正常山羊封閉血清(M78320J)、生物素標(biāo)記的IgG(O6721D)、DAB顯色試劑盒(67869NJ)，均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。熒光定量PCR分析儀(YFGB1022，Olympus，日本)。

三、研究方法

1.標(biāo)本采集及處理：兩組受試者均于剖宮產(chǎn)胎盤娩出后，于臍帶連接于母體面中央處(避開壞死及鈣化區(qū))立即切取胎盤組織(大小約1 cm×1 cm×1 cm)兩塊。其中一塊置于-80℃保存?zhèn)溆谩Ａ硪粔K經(jīng)生理鹽水洗凈后于10%甲醛溶液中固定，24 h后石蠟包埋，連續(xù)切片，制成3張切片(4 μm厚)，65℃烤箱過夜，保存于37℃溫箱，用于免疫組化測(cè)定。

2.qRT-PCR：從-80℃取出胎盤組織樣本，按照RNA試劑盒說明書提取總RNA后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。嚴(yán)格按照qRT-PCR試劑盒說明進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，所用引物序列見表1。反應(yīng)體系為20 μl：SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反應(yīng)程序：95℃ 20 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列

3.免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果判定：取FGR組及對(duì)照組胎盤組織切片，經(jīng)脫蠟復(fù)水，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加0.3%過氧化氫甲醇液以阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加5%正常山羊血清進(jìn)行封閉，室溫孵育10 min；滴加鼠抗人IGF-2(1∶500)、IGFBP-3(1∶500)抗體作為一抗，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加生物素標(biāo)記二抗(1∶1 000)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次(3 min/次)；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)溶液，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次(3 min/次)；滴加新鮮配置的DAB顯色液(0.04 DAB+0.03% H2O2)顯色，顯微鏡下控制，充分水洗；蘇木素復(fù)染2 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，應(yīng)用NIS Elements F 3.0圖像采集軟件和NIS Elements BR 3.0圖像分析軟件(日本Nikon公司)進(jìn)行圖像采集。

結(jié)果判定：IGF-2、IGFBP-3蛋白表達(dá)均以胞漿和/或胞膜呈棕黃(褐)色顆粒為陽性；從每個(gè)切片中隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野的500個(gè)細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。(1)按細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；(2)按陽性細(xì)胞所占的百分比計(jì)分：小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，大于75%為4分。取上述兩項(xiàng)結(jié)果的乘積：≤3分為蛋白在組織中陰性(-)表達(dá)，>3分為蛋白在組織中陽性(+)表達(dá)。蛋白的陽性表達(dá)率(%)=各組蛋白陽性表達(dá)人數(shù)/各組總?cè)藬?shù)×100%。

4.分析指標(biāo)：包括年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、終止孕周、胎兒體重、孕早期相關(guān)血漿蛋白A(Pregnancy-related plasma protein A，PAPP-A)及游離人絨毛膜促性腺激素(HCG)水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、一般資料比較

兩組間年齡、孕前BMI、終止孕周、HCG水平比較無顯著性差異(P>0.05)；FGR組的胎兒體重、PAPP-A水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組一般資料比較(-±s)

二、兩組胎盤組織IGF-2及IGFBP-3的mRNA表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，F(xiàn)GR組患者胎盤組織中IGF-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，IGFBP-3 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(表3)。

表3 兩組胎盤組織IGF-2、IGFBP-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(-±s)

三、兩組胎盤組織IGF-2、IGFBP-3蛋白表達(dá)情況

兩組胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3蛋白均有不同程度表達(dá)，IGF-2陽性染色呈橘黃色顆粒，位于胞漿；IGFBP-3陽性染色呈棕黃色/褐色顆粒，位于胞漿及胞膜(圖1)。

蛋白陽性表達(dá)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，F(xiàn)GR組患者胎盤組織中IGF-2蛋白陽性表達(dá)率顯著降低(P<0.05)，IGFBP-3蛋白陽性表達(dá)率顯著升高(P<0.05)(表4)。

四、FGR組患者胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，F(xiàn)GR患者胎盤組織中IGF-2和IGFBP-3的蛋白表達(dá)成顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.537，P=0.008)(表5)。

五、FGR影響因素的Logistic回歸分析

以是否發(fā)生FGR為因變量，排除年齡等混雜因素后，以孕早期血清PAPP-A水平、胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3 mRNA水平為自變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，孕早期血清PAPP-A水平及胎盤組織中IGF-2 mRNA異常低表達(dá)、IGFBP-3 mRNA異常高表達(dá)與FGR發(fā)生顯著相關(guān)(P<0.05)(表6)。

注：白色箭頭指胞漿和/或胞膜呈棕黃(褐)色顆粒處，即IGF-2、IGFBP-3蛋白的陽性表達(dá)。圖1 胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3的蛋白表達(dá)定位(SP染色法，×200)

表4 兩組胎盤組織IGF-2、IGFBP-3蛋白陽性率比較[n(%)]

表5 FGR患者胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

表6 FGR的影響因素的Logistic分析

討 論

FGR指由于受到各種不利因素的影響，胎兒的生長(zhǎng)未能達(dá)到潛在應(yīng)有的遺傳速率，是圍生期主要并發(fā)癥之一，給圍產(chǎn)兒、新生兒生命健康帶來嚴(yán)重威脅[11]。FGR病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床上缺乏對(duì)FGR的早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)及有效診斷手段，治療措施更是較為單一。因此，尋求可靠的生物學(xué)指標(biāo)及早合理監(jiān)測(cè)、準(zhǔn)確評(píng)估胎兒生長(zhǎng)發(fā)育情況并選擇合適分娩方式，適時(shí)終止妊娠對(duì)于改善FGR預(yù)后有重要意義。

胎盤是妊娠期特有器官，作為胎兒與母體進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)交換的重要場(chǎng)所，其正常結(jié)構(gòu)、功能發(fā)生改變則會(huì)對(duì)胎兒發(fā)育造成直接影響[12]。IGF-2是一種肽類生長(zhǎng)因子，其編碼基因位于11號(hào)染色體短臂，由67個(gè)氨基酸組成，屬于一種強(qiáng)有絲分裂源，能夠與相應(yīng)受體結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂及發(fā)揮抗凋亡作用，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等生物學(xué)行為；人體許多器官組織如胎盤、肝臟均能合成IGF-2。研究表明，IGF-2可以刺激葡萄糖在胎盤的合成及轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)胎盤功能、胎兒生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用[13]。柴涵婧等[14]研究發(fā)現(xiàn)，單絨毛膜雙羊膜囊雙胎選擇性宮內(nèi)生長(zhǎng)受限患者胎盤組織中IGF-2基因表達(dá)降低，提示胎盤組織中IGF-2基因異常低表達(dá)可能與FGR有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GR組患者胎盤組織中IGF-2 mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，兩組胎盤組織中IGF-2蛋白均主要存在于組織細(xì)胞胞漿中，呈橘黃(褐)色；FGR組患者胎盤組織中IGF-2蛋白陽性表達(dá)率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，與以往研究結(jié)果趨勢(shì)一致，提示胎盤組織中IGF-2 mRNA及蛋白異常低表達(dá)可能與FGR發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。原因可能是IGF-2基因低表達(dá)使胎盤營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能發(fā)生障礙，進(jìn)一步干擾胎兒正常生長(zhǎng)，導(dǎo)致胎兒發(fā)生宮內(nèi)生長(zhǎng)受限。

IGFBP-3是含有264個(gè)氨基酸的多肽類物質(zhì)，位于7號(hào)染色體上，主要由肝臟合成，人子宮內(nèi)膜、胎盤及胎兒肝臟均可以表達(dá)IGFBP-3 mRNA，是IGFs的主要載體調(diào)節(jié)蛋白，能夠與IGFs受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IGFs，從而減弱IGFs的生物學(xué)作用，如抑制細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等，進(jìn)一步抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等[15]。謝偉姣[16]研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，分娩巨大兒的妊娠期糖尿病產(chǎn)婦胎盤組織中IGFBP-3 mRNA水平明顯降低、IGF-2 mRNA水平明顯升高，提示二者可能與妊娠期糖尿病巨大兒發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)GR組患者胎盤組織中IGFBP-3 mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，兩組胎盤組織中IGFBP-3蛋白主要存在于胎盤組織細(xì)胞胞膜及胞漿中，呈棕黃(褐)色；且與對(duì)照組比較，F(xiàn)GR組患者胎盤組織中IGFBP-3蛋白陽性表達(dá)率顯著升高(P<0.05)。與謝偉姣研究結(jié)果趨勢(shì)一致，提示胎盤組織中IGFBP-3 mRNA及蛋白異常高表達(dá)可能與FGR發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。原因可能是IGFBP-3蛋白與IGF-2受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IGF-2，從而減弱IGF-2的生物學(xué)作用，進(jìn)一步抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化等，促進(jìn)FGR發(fā)生。進(jìn)一步相關(guān)性研究顯示，F(xiàn)GR患者胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3蛋白表達(dá)成負(fù)相關(guān)。提示二者可能相互作用并參與FGR的發(fā)生發(fā)展。

PAPP-A是一種從孕婦血清分離而得的來源于胎盤組織的鋅結(jié)合金屬蛋白酶，是孕婦血清學(xué)產(chǎn)前篩查的重要生化指標(biāo)，由合體滋養(yǎng)層細(xì)胞合成分泌，對(duì)早期配子發(fā)育、維持早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤(rùn)分化及胎兒在胎盤生長(zhǎng)有關(guān)鍵作用[17]。本研究二元Logistic回歸分析顯示，孕早期血清PAPP-A水平及胎盤組織中IGF-2 mRNA異常低表達(dá)、IGFBP-3 mRNA異常高表達(dá)可能與FGR發(fā)生顯著相關(guān)，提示孕早期血清PAPP-A水平及胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3 mRNA異常表達(dá)可能是FGR發(fā)生的重要影響因素，但是否是FGR發(fā)生的危險(xiǎn)因素有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，胎盤組織中IGF-2、IGFBP-3 mRNA異常表達(dá)可能在FGR發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，但具體作用機(jī)制及意義有待于后期深入探討。