林淵源，趙崢,*

1. 昆明滇池(湖泊)污染防治合作研究中心，昆明學院，昆明 650214 2. 昆明市河湖生態(tài)健康評估與修復院士工作站，昆明 650214

近年來，經(jīng)濟全球化進程愈快，國家、地區(qū)間的貿(mào)易交往日益頻繁，主動和被動引入的外來生物愈多，為外來物種入侵創(chuàng)造了條件，同時也給全球環(huán)境帶來了生態(tài)風險[1-2]。外來水生生物隨著頻繁的航運、水產(chǎn)品養(yǎng)殖引種等直接和間接途徑引入新的棲息地，在新的生態(tài)系統(tǒng)迅速繁殖擴散，與本地物種競爭食物和空間或直接掠殺吞食本地種，導致本地生物群落結(jié)構改變、生物多樣性水平降低，正嚴重威脅水生生態(tài)系統(tǒng)的健康與穩(wěn)定，影響著入侵地的經(jīng)濟、社會發(fā)展和公眾健康[3-4]。比如臭名昭著的外來生物福壽螺，它們?nèi)∈扯喾N植物幼苗或根莖、危害作物生長，攜帶傳染病原物，不僅帶來直接經(jīng)濟損失和危害人類健康，而且其代謝物會改變水體環(huán)境、影響水體生物群落結(jié)構，影響入侵地生物多樣性，加劇了入侵地的生態(tài)風險[5]。據(jù)不完全統(tǒng)計，外來入侵生物構成的直接經(jīng)濟損失每年逾2 000億元[6]，由水生入侵藻類引發(fā)的赤潮爆發(fā)造成的經(jīng)濟損失每年高達5億元[7]，由巴西龜入侵造成的間接經(jīng)濟損失已達1 000億元[8]。

為了有效防控外來入侵有害生物，各國政府每年都要投入大量的人力、物力和財力對外來生物進行嚴格的檢疫、查封和堵截以及對入侵生物的滅殺清除[9-10]。但外來生物一旦構成入侵，再根除就非常困難，甚至不可能，以防為主、防治結(jié)合被認為是外來入侵生物防控最有效的策略，因此，外來生物的早期監(jiān)測和風險預警研究隨之興起。目前外來生物監(jiān)測主要依賴于形態(tài)學觀察和分類，不僅工作量大，而且要求監(jiān)測人員具備相關的形態(tài)、分類學經(jīng)驗，難以滿足快速大量監(jiān)測的需求[11]。且外來生物在引入初期通常群體規(guī)模極小，可能難以察覺或被忽略，尤其是外來水生生物，其物種繁多，多數(shù)形體微小、形態(tài)多變，與陸生外來生物相比隱蔽性更強、更易擴散，通常難以及時監(jiān)測和有效評估預警，進而構成入侵，危害生態(tài)環(huán)境及人類健康[3, 12]。因此，開發(fā)高效、靈敏的新技術應用于外來水生入侵生物監(jiān)測至關重要。

環(huán)境DNA(environmental DNA, eDNA)泛指從水、土壤和沉積物等環(huán)境介質(zhì)中提取出來的總DNA，其源于有機體本身或其生命過程中釋放的分泌物、內(nèi)含物、血液及孢子、花粉或脫落的器官等[13]。自Ficetola等[14]首次將環(huán)境DNA條形碼分析(eDNA barcoding)引入對入侵種美國牛蛙(Ranacatesbeiana)的檢測以來，環(huán)境DNA技術(eDNA technologies)為水生入侵生物監(jiān)測開辟了新路徑，在入侵生物的定性、定量及入侵機制探索方面都有廣泛應用(圖1)。普通聚合酶鏈式反應(PCR)主要用于物種的定性檢測，以eDNA為模板，通過對目標物種或種群的特異性基因擴增、測序，從而實現(xiàn)新種鑒定、外來種和瀕危種監(jiān)測。而定量PCR(qPCR)和微滴式數(shù)字PCR技術(ddPCR)則能對eDNA定量，量化表征物種的豐富度和生物量等，在物種種群大小估算、資源調(diào)查等方面極具潛力[15]。且隨著第二代測序技術(next -generation sequencing, NGS)的發(fā)展，eDNA整合宏條形碼分析深化發(fā)展為環(huán)境DNA宏條形碼技術(eDNA-metabarcoding)，通過提取環(huán)境介質(zhì)中的總DNA進行高通量測序以分析環(huán)境中生物物種組成及豐度，可實現(xiàn)生物物種的高效鑒別及多生物群落監(jiān)測，已應用于低豐度生物物種檢測、隱匿種發(fā)現(xiàn)、生物多樣性調(diào)查等方面[16-17]。與耗時費力的傳統(tǒng)形態(tài)學生物監(jiān)測、資源調(diào)查(比如圍網(wǎng)捕撈、電氣捕魚)相比，eDNA技術具有低耗、高效、高靈敏度及對生物體無損傷等特點，優(yōu)勢得天獨厚[18]，其在外來水生生物監(jiān)測方面具有十分廣闊的應用前景。

本文首先總結(jié)了eDNA結(jié)合條形碼或宏條形碼技術在水生入侵生物監(jiān)測研究中的應用實例；然后從eDNA的獲取、條形碼區(qū)域的PCR擴增和數(shù)據(jù)分析這3個方面探討了eDNA技術實施的方案、關鍵步驟；最后對促進eDNA在水生生物入侵監(jiān)測應用的方式及前景進行了展望，以期為水生生物入侵防控提供基礎理論和技術支撐。

圖1 環(huán)境DNA(eDNA)技術應用于入侵生物研究注：PCR表示聚合酶鏈式反應，qPCR表示熒光定量PCR，ddPCR表示微滴式數(shù)字PCR，NGS表示二代測序技術。Fig. 1 Environmental DNA (eDNA) technologies applied to the study of invasive speciesNote: PCR represents polymerase chain reaction; qPCR represents quantitative real time PCR; ddPCR represents droplet digital PCR; NGS represents next generation sequencing.

1 eDNA條形碼技術應用于水生入侵生物監(jiān)測及入侵機理研究(Exploring aquatic invasive species and invasion mechanism using eDNA barcoding)

1.1 目標入侵物種探查

對入侵生物采取控制措施的先決條件是迅速而準確地識別具有威脅性的外來物種，通過常規(guī)PCR方法對目標生物進行特異性擴增以檢測目標物種的存在是入侵生物監(jiān)測的主要方式之一。2008年，F(xiàn)icetola等[14]首次將eDNA與條形碼分析引入水生生物監(jiān)測，他們提取法國18個自然水體中的eDNA后利用基因特異性引物進行PCR擴增并測序，檢出了傳統(tǒng)方法未檢出的入侵物種美國牛蛙(Ranacatesbeiana)，為水生生物監(jiān)測引入了新的研究方法，開辟了水生入侵生物早期監(jiān)測的新視野，并將該技術逐漸拓展到魚類、爬行動物和軟體動物等多類生物監(jiān)測。Jerde等[19]將eDNA技術用于鳙魚(Hypophthalmichthysnobilis)和鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)的監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)連接密西西比河和大湖盆地的芝加哥水道面臨著外來魚類入侵的威脅。Piaggio等[20]開發(fā)了適用于檢測緬甸蟒蛇(Pythonbivittatus)的eDNA條形碼監(jiān)測方法，并在美國南佛羅里達的5個野外水域里檢出了該蛇。Ardura等[21]設計開發(fā)了北美楔蛤的物種特異性分子標記及eDNA監(jiān)測方法，并利用波羅的海和維斯瓦瀉湖水樣評估了該法的可行性，發(fā)現(xiàn)即使在種群稀少且規(guī)模較小的情況下，也能從eDNA中檢測到北美楔蛤的痕跡。總之，eDNA條形碼技術為快速精準探查目標入侵生物的存在提供了便利，從而促進管理部門能夠迅速做出反應、指導部署該物種的防控工作。

1.2 入侵機制研究

為了更有效地防控外來生物入侵，研究者們不僅著重于外來物種的早期監(jiān)測及預警，也越來越重視解析入侵生物的入侵機理。eDNA技術簡便高效，便于大規(guī)模、大尺度分析，已逐漸應用于探索入侵物種遺傳多樣性、種群擴散規(guī)律和生物量評估等?；诰€粒體DNA條形碼分析，Serrao等[22]對收集到的121個黑魚樣本和已有GenBank數(shù)據(jù)進行聚類分析，結(jié)果分成了49個分支，顯示其豐富的遺傳多樣性，為黑魚入侵路徑的推斷提供了有效依據(jù)。Takahara等[23]利用eDNA分析追蹤了藍鰓太陽魚(Lepomismacrochirus)在日本本土及周邊島嶼70個水域的分布情況，有19個水域監(jiān)測到了此入侵魚類的存在，主要分布在日本本土，周邊島嶼的擴散趨勢不明顯。通過qPCR或ddPCR法，eDNA技術不僅可以確定目標生物的存在，還能量化表征物種的豐富度和生物量，為入侵物種監(jiān)管治理提供更有效的基礎數(shù)據(jù)。Goldberg等[24]發(fā)現(xiàn)在清除新西蘭泥螺(Potamopyrgusantipodarum)21～44 d后還能在水體中檢測到其DNA的存在，通過qPCR檢測，他們發(fā)現(xiàn)此螺在波特納夫河的分布密度約為每平方米11～144個，說明eDNA調(diào)查在幫助早期發(fā)現(xiàn)入侵性水生無脊椎動物及其豐度計算、風險預警方面具有很高的潛力。Nathan等[25]利用傳統(tǒng)PCR、qPCR、ddPCR方法分別對環(huán)境中蝦虎魚DNA在24 h內(nèi)的存在和豐度進行了檢測，結(jié)果表明，即使在低目標生物密度，3種方法都能有效檢測到其DNA的存在，qPCR和ddPCR估算出了相似的DNA濃度，且ddPCR速度更快，花費更少。Jo等[26]利用多重實時熒光定量PCR技術對3種外來魚類和3種受威脅的本地魚類在日本99個池塘的季節(jié)分布進行了檢測，發(fā)現(xiàn)所有魚類的eDNA檢出率在初夏都較高，而且外來魚類的eDNA更容易在汽車更容易到達的池塘中檢測到。這都可為闡明入侵物種的擴散入侵過程，最終針對性地指導制定相關治理政策提供可靠證據(jù)。

2 eDNA宏條形碼技術應用于水生入侵生物監(jiān)測(Monitoring aquatic invasive species using eDNA metabarcoding)

隨著DNA測序技術的飛速發(fā)展，eDNA條形碼整合高通量測序技術深化發(fā)展為eDNA宏條形碼技術，其低耗、高效和高靈敏度的優(yōu)勢極大拓展了其在水生生態(tài)系統(tǒng)入侵生物的早期監(jiān)測與預警中的應用，在靶標和非靶標水生入侵生物監(jiān)測及壓艙水檢疫上都有長足應用。

2.1 靶標種監(jiān)測

針對靶標生物設計特異性引物對eDNA進行擴增和分析以檢測靶標物種的存在和豐度是利用eDNA宏條形碼技術進行入侵種監(jiān)測的重要方式，已涉及藻類、甲殼類和魚類等多類生物的監(jiān)測。為了解我國遼東灣海域是否存在甲藻(Stoeckeriaalgicida)的入侵風險，宋倫等[27]針對微型/微微型浮游植物設計18SrDNAV4區(qū)特異性引物對遼東灣浮游植物進行了檢測，發(fā)現(xiàn)夏季Stoeckeriaalgicida在遼東灣東、西兩岸密度較高，致災風險較高，必須加強監(jiān)管。Muha等[28]利用eDNA宏條形碼技術對比斯開灣和鄰近地區(qū)的入侵性海藻(Codiumfragile)進行定期監(jiān)測，為評估Codiumfragile的潛在擴張及其管理干預提供參考。利用eDNA宏條形碼技術檢測靶標水生入侵動物的研究較多，已應用于纓鰓蟲(Sabellaspallanzanii)[29]、貽貝(Dreissenapolymorpha、Dreissenarostriformisbugensis)[30-31]和克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[32]等生物。且隨著DNA提取技術、測序技術等的飛速發(fā)展，eDNA宏條形碼技術在入侵監(jiān)測的應用也越來越成熟、規(guī)范，比如Lin等[33]優(yōu)化了eDNA提取方法和檢測引物，并提出了利用eDNA分析監(jiān)測美國牛蛙地理分布的標準技術規(guī)范。

2.2 非靶標種監(jiān)測

通過設計高靈敏度通用引物對eDNA進行擴增和高通量測序分析以比較群落物種組成、對非靶標入侵生物進行監(jiān)測，可廣泛全面預警生態(tài)系統(tǒng)中各類外來生物的入侵風險。Brown等[34]利用通用引物Uni18S擴增出加拿大海岸線和五大湖主要港口浮游生物的18SrDNAV4區(qū)，經(jīng)系統(tǒng)進化分析，24個物種被鑒定為外來入侵種，其中11個種在該地區(qū)首次被檢出。Rey等[35]基于COI和18SrDNAV9區(qū)設計通用引物，在西班牙畢爾巴鄂港檢測到了79個外來種，其中包括了大多數(shù)之前生物調(diào)查已鑒定出的外來物種及7個從未檢出的物種。Westfall等[36]利用宏條形碼技術監(jiān)測了西北太平洋生物的群落組成，識別了12種已知的外來物種以及另外7種無記錄的外來物種，為外來物種的早期監(jiān)測和防控，減輕生物入侵的發(fā)生提供基礎數(shù)據(jù)。Chen等[37]同時利用eDNA宏條形碼技術和形態(tài)學監(jiān)測對我國青島海底世界水族館的非原生物種多樣性進行了調(diào)查研究，eDNA宏條形碼監(jiān)測鑒定出了24個非本地種及另外4個可能的非本地操作分類單元，而形態(tài)學監(jiān)測則只鑒定到20個非本地種，認為eDNA宏條形碼監(jiān)測較形態(tài)學監(jiān)測更靈敏，但同時為了提高物種的檢出率和降低假陽性率，建議利用eDNA宏條形碼監(jiān)測時應進行多方位的采樣和嚴格設置陰性對照。

2.3 壓艙水檢疫

船舶壓艙水及其淤泥被認為是外來生物傳播入侵的主要驅(qū)動力，壓艙水的檢疫監(jiān)管可為外來入侵生物的防控提供基礎數(shù)據(jù)和警示，eDNA宏條形碼技術作為一種新型監(jiān)測手段在船舶壓艙水及其淤泥中外來生物的檢疫監(jiān)管中已被廣泛應用。利用eDNA宏條形碼技術，Rey等[38]對抵達美國切薩皮克灣的11艘船舶的壓載水的生物物種組成進行了分析，并在其中發(fā)現(xiàn)了外來種長腹劍水蚤屬(Oithonadavisae)。Ardura等[39]從7艘抵達西班牙比斯開灣希洪港的船舶的壓載水中檢測出了72種藻類，其中22.2%為比斯開灣的外來物種，11.1%被歸類為有害物種。Lin等[40]利用eDNA宏條形碼技術對比了淡水、半咸水壓艙水及其氯處理壓艙水的浮游動物群落結(jié)構組成差異后認為氯處理壓艙水不能有效減少入侵風險，并呼吁進行氯處理、紫外滅殺等多方式聯(lián)用以降低壓艙水帶來的生物入侵風險。

3 eDNA技術實施流程的關鍵因素(The key factors of implementation scheme of eDNA technologies)

盡管eDNA技術為入侵生物學研究開辟了一條新的道路，但其應用實施尚處于探索階段，也還未形成一套廣譜通用的操作流程。比如由于不同生境下生物、物理和化學環(huán)境參數(shù)存在很大差異，這些差異會嚴重影響eDNA的來源、運輸和狀態(tài)等，并可能最終對eDNA檢測結(jié)果產(chǎn)生影響[41]；而進行eDNA實驗操作的各個環(huán)節(jié)比如標記基因的選擇、數(shù)據(jù)處理參數(shù)的設置等也都可能影響最終的結(jié)果[17]。因此，我們從eDNA的獲取、條形碼區(qū)域的PCR擴增和數(shù)據(jù)分析3個方面來系統(tǒng)綜述eDNA宏條形碼技術實施操作流程中的關鍵因素，并對各個環(huán)節(jié)需要注意的細節(jié)進行說明和討論。

3.1 eDNA的獲取

目前對于eDNA獲取的方法還未有統(tǒng)一的標準流程，而從環(huán)境中捕獲和提取eDNA的方法可能會強烈影響其最后的結(jié)果，現(xiàn)有研究一般從取樣方式、采樣介質(zhì)、DNA濃縮和抽提方法等方面進行優(yōu)化。首先，研究者會根據(jù)研究目的、目標物種的生活習性、潛在豐度及綜合考慮研究區(qū)域的自然地理環(huán)境比如水體面積、水源質(zhì)量等因素來選擇取樣的方式，且由于生物體DNA在環(huán)境中存在與否的隨機性較大，為提高檢出率、減少誤差，生物學重復十分必要，每個點位一般至少收集3個平行樣本[42-43]。在溪流和淺水系統(tǒng)檢測中可直接采集表層水提取eDNA進行分析而不影響其多樣性[44-45]；在深水系統(tǒng)(比如湖泊、深海)則需謹慎考慮，因為在生態(tài)系統(tǒng)中不同物種可能存在不同的空間分布特征，適當?shù)牟蓸由疃瓤梢愿纳莆锓N檢測度[46-47]，在防止eDNA分散的屏障下面或周圍采集水樣，并為每個樣本匯集不同層次的水以減少采樣引起的偏差不失為一個有效方式[43]。其次，對樣品進行有效的濃縮比如異丙醇或乙醇離心沉淀和過濾可提高eDNA的質(zhì)量，增加檢出率。離心沉淀一般只適用于濃縮小體積(～90 mL)水樣，而過濾則可大大增加樣品體積，且過濾器的保存比水樣更簡便，通?？蛇x擇使用纖維濾膜過濾水樣后經(jīng)Longmire緩沖液、乙醇或超低溫存儲過濾器處理以富集保存eDNA[43, 48]。最后，據(jù)研究目的使用相應DNA提取方法進行提取，除了少數(shù)研究中采用十六烷基三甲基溴化銨或苯酚-氯仿-異戊醇抽提法等提取DNA外，目前大多數(shù)研究都采用商品化DNA提取試劑盒來抽提樣品以獲得高質(zhì)量eDNA[49]。

楊江華[50]研究了采樣方法、采樣體積對浮游動物宏條形碼測序結(jié)果的影響，認為直接過濾1 L的水樣適于研究輪蟲的多樣性，用浮游動物網(wǎng)富集5～10 L的水樣適于研究枝角類和橈足類多樣性，初步實現(xiàn)了浮游動物宏條形碼監(jiān)測技術的標準化。Shu等[49]綜合比較了現(xiàn)有利用eDNA檢測魚類的文獻后認為，檢測魚類，可采集1 L或2 L的表層水，通過0.7 μm的玻璃纖維濾膜過濾收集eDNA，然后用DNeasy Blood and Tissue Kit或Power Water DNA Isolation Kit進行提取，可以得到高質(zhì)量的eDNA和可靠的結(jié)果。Kumar等[51]總結(jié)眾多研究中水eDNA樣品的收集和處理的方法流程后認為，雖然很難歸納一套適應于所有eDNA宏條形碼技術的操作規(guī)范，但多數(shù)情況下，在合適孔徑大小的硝酸纖維素過濾器上濃縮eDNA，并在Longmire緩沖液中存儲過濾器，然后用DNeasy Blood and Tissue Kit或類似試劑盒能夠獲得充足、高質(zhì)量的eDNA?？傊瑸楸M可能減少eDNA獲取操作過程所引起的偏差，應該選擇一個比較一致的、可靠的操作流程以便實現(xiàn)監(jiān)測技術的標準化。

3.2 條形碼區(qū)域的PCR擴增

eDNA分析得以實施的關鍵是條形碼序列的擴增，選擇合適的分子標記基因(即條形碼區(qū)域)并設計高分辨率的通用引物十分重要[17, 52]。分子標記基因的選擇一般遵循2個原則：(1)包含相對保守的區(qū)域來設計通用性強的引物以便于PCR擴增；(2)選定條形碼區(qū)域的種間差異大、種內(nèi)差異小，能有效鑒別物種，目前已開發(fā)出多個適于eDNA分析的標記基因(表1)。

線粒體和核基因區(qū)段都被報道可作為標記基因用于eDNA分析，但不同分子標記基因適用范圍不同，不同物種對引物的親和力也不同，其擴增效率也就可能不一致，經(jīng)擴增后一些物種的豐度可能會被“提高”或“降低”，或根本無法被擴增，進而導致錯誤結(jié)論，應據(jù)研究目的綜合選擇適當?shù)姆肿訕擞浕騕53-54]。核糖體小亞基16S核糖核酸(16SrRNA)基因既有高度保守性區(qū)域，又有多個高度變異性區(qū)域，是藍藻多樣性研究應用最廣泛的基因[55]。16-23SrRNA基因轉(zhuǎn)錄間隔序列(ITS)屬內(nèi)物種間差異顯著，基于ITS基因?qū)M圓孢藻屬進行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其3個物種可各自形成彼此區(qū)分的單系類群[56]。線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(COI)基因具有進化速度快和功能保守性強的特點，在區(qū)分近緣物種或亞種的鑒別中極具優(yōu)勢，是動物條形碼研究中的“黃金標志”[57]，常用來分析浮游動物[58]、甲殼動物[59]和魚類[60]等。但也研究表明COI基因較快的進化速度會導致較大的種內(nèi)多樣性，比如萼花臂尾輪蟲(Brachionuscalyciflorus)的COI就有多個不同的基因型[61]。核糖體18SrRNA基因序列進化速度較慢，覆蓋度高，能覆蓋大部分的真核生物群落，適用于研究親緣關系較遠的生物群落結(jié)構[62]。Zhan等[63]比較了COI、16SrRNA和18SrRNA等分子標記基因在浮游動物宏條形碼研究中的效果，發(fā)現(xiàn)其所用的COI引物無法擴增出高質(zhì)量的PCR產(chǎn)物，并建議使用18SrRNA基因和線粒體16SrRNA基因進行浮游動物條形碼研究。楊江華[50]比較了常用COI、18SV9及基于浮游動物16SrRNA基因序列設計的16S引物進行水體宏條形碼監(jiān)測的差別，認為在不考慮物種水平的多樣性并需要涵蓋盡可能多的生物類群時優(yōu)先選用18SV9引物，為研究浮游動物多樣性時選擇COI引物，而關注輪蟲群落多樣性時使用16S引物更合適。Shu等[49]比較分析了現(xiàn)有利用eDNA檢測魚類的文獻后認為，基于細胞色素B基因(Cytb)的特異性引物可有效鑒定目標魚類及評估其物種豐富度；聯(lián)合使用12S和16SrRNA的通用引物可使宏條形碼評估魚類生物多樣性的準確性與覆蓋度增加。

表1 eDNA分析常用標記基因簡述Table 1 Description of commonly used marker genes in eDNA studies

針對所選的分子標記基因進行引物設計及之后的PCR擴增過程則相對程序化。目前有一些工具如Primer 3、Primer Express和ecoPrimers，皆可基本滿足eDNA研究中引物設計的要求[64-65]。PCR擴增一般分為常規(guī)PCR和實時熒光定量PCR。宏條形碼分析基于通用引物來擴增多種生物的目標基因，屬常規(guī)PCR擴增；而為定量評估物種豐度則可利用特異性引物進行qPCR分析[32, 66]。在PCR過程中應嚴格設置陰性、陽性對照以排除假陰性與假陽性結(jié)果，且由于各方面因素的干擾比如eDNA的降解程度、PCR的擴增偏向性、基因的多拷貝等，定量分析評估物種豐度的方法還有待探索完善[67]。

3.3 數(shù)據(jù)分析

eDNA分析的首要目標是識別環(huán)境樣品中存在的各類生物。qPCR、ddPCR分析是對特定序列的鑒定和定量，一般針對特定物種。而宏條形碼分析中，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)高通量測序獲得大量序列信息，對這些序列進行物種注釋及進一步個性化分析極具挑戰(zhàn)。數(shù)據(jù)處理過程主要包括：(1)對原始數(shù)據(jù)進行預處理以去除低質(zhì)量的污染序列，比如引物中錯配的序列、長度過短的序列及PCR嵌合體等，綜合計算平臺QIIME、SeqClean和UCHIME等都可以用來去除污染得到高質(zhì)量優(yōu)化序列[52, 65]。然而嚴格的質(zhì)量修剪雖然可以有效地去除低質(zhì)量短序列，但過于保守的參數(shù)設置可能會刪除過多的低豐度序列，從而導致稀有種被丟失、外來種被忽略、生物多樣性被低估[52, 68]。(2)序列聚類，即將擴增子序列聚類為操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)。通過距離度量方法計算不同序列之間的相似性，并設定物種間分類閾值，將相似度超過閾值的序列聚類為相同OTU，一個理想的OTU只包含來自一個物種的序列，從而可用OTU來鑒別物種、評價其生物多樣性。一般97%的相似性被認為代表了種間和種內(nèi)之間變異，可被用來區(qū)分不同類群，因此，在宏條形碼分析中，OTU聚類的分類閾值通常設置為97%[52, 57]。然而分類閾值的設置易使序列信息差異太小的物種被掩蓋，導致生物多樣性被低估，尤其給序列相似性較高的本地種和外來種鑒別帶來干擾[63, 68]，在外來入侵生物監(jiān)測中造成假陰性結(jié)果，失去防控的有利時機。近年來，基于熵值在單核苷酸的精度上來區(qū)分序列之間差異的處理方法即準確序列變異(exact sequence variant, ESV)被提出，可檢出序列高度相似但屬于不同種屬的物種和生態(tài)型，克服物種丟失的弊端，為入侵生物的早期監(jiān)測和風險預警提供助力[69-71]。(3)物種注釋，即通過DNA序列相似性來鑒別環(huán)境中存在的物種，其過程主要依靠與參考數(shù)據(jù)庫的比對，參考數(shù)據(jù)庫的大小和質(zhì)量決定了宏條形碼技術分析結(jié)果的可靠性[52, 72]。NCBI的Genebank數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)、生命條形碼(BOLD)數(shù)據(jù)庫(http://www.boldsystems.org)和綜合席爾瓦(SILVA)數(shù)據(jù)庫(http://www.arb-silva.de/)是目前使用最為廣泛、物種序列信息較為完整的參考數(shù)據(jù)庫。然也存在序列注釋的物種名稱未由分類學家精確鑒定、許多序列未注釋物種名稱、許多物種無參考序列等問題，導致eDNA宏條形碼序列比對注釋結(jié)果通常存在一定比例未注釋的序列。參考數(shù)據(jù)庫的不準確性和不完整性是目前利用eDNA進行生物多樣性評估的主要障礙。相信隨著研究的深入，參考數(shù)據(jù)庫物種序列的不斷豐富和完善，利用宏條形碼技術注釋物種也將越來越準確。(4)個性化分析。獲得物種信息后可以針對研究的具體內(nèi)容進行個性化分析，比如α、β多樣性分析、系統(tǒng)進化分析、物種豐度分析及稀有種、入侵種鑒定等[18, 55, 73]。總之，數(shù)據(jù)分析的每一步都需要對稀有分類單元的保留或刪除、序列數(shù)量及計算時間等因素之間進行權衡以確保所得結(jié)果的準確性和可靠性。

4 促進eDNA技術應用于水生入侵生物監(jiān)測的方式(The direction that promotes eDNA technologies application in aquatic invasion species monitoring)

水生入侵生物的監(jiān)測是有效防控生物入侵的長期性工作，其監(jiān)測成本、效率至關重要。與傳統(tǒng)形態(tài)觀察和分類法相比，eDNA技術操作流程簡化，監(jiān)測成本大大縮減，且只采集棲息地環(huán)境樣品，對生物及其生境無損傷，在入侵生物監(jiān)測研究中具多方面顯著優(yōu)勢[18]。但eDNA分析作為一項新興技術，還存在一些不足，科學家們也正從各個方向努力以彌補缺陷，促進其應用推廣。Sepulveda等[74]沿用Daubert標準從5個方面評估了eDNA分析作為一種新興技術應用于入侵生物監(jiān)測的可靠性，認為阻礙其發(fā)展最重要的因素是eDNA分析本身的不確定性及環(huán)境科學家和管理者之間的協(xié)調(diào)和溝通障礙，研究者和管理者應從eDNA分析流程、管理者行為、風險容忍度評估和公眾參與等方面構建決策樹以做出正確決策。作為eDNA研究人員，我們可以從以下方面促進其發(fā)展與應用。

(1)eDNA獲取過程的優(yōu)化及其標準化操作流程的建立。盡可能完整獲取環(huán)境中的總DNA對后續(xù)全面、真實地反映物種在環(huán)境中的分布至關重要，在外來生物的早期監(jiān)測和預警中亦如此。雖然許多eDNA技術標準已在國際期刊上發(fā)表，但是影響eDNA研究的因素很多，比如由于不同生物類群適于棲息的環(huán)境不同而導致不同環(huán)境介質(zhì)中留存的DNA種類可能大不相同[35]；不同自然地理環(huán)境及理化指標的差異導致DNA的降解差異[43]等。為提升eDNA監(jiān)測結(jié)果與實際分布的一致性，更廣泛全面地發(fā)現(xiàn)生態(tài)系統(tǒng)中的各類外來生物，我們可以嘗試同時從不同環(huán)境介質(zhì)中提取DNA以獲得更加全面的物種分布信息，并應進一步優(yōu)化樣品收集保存技術(比如濾膜材料的更新、保存液的優(yōu)化)及DNA提取方法；應有效地規(guī)避樣品間交叉污染、設置陰性對照以提升其準確性和可靠性。(2)不同的數(shù)據(jù)分析方式也可能產(chǎn)生不同的監(jiān)測結(jié)果，比如分類閾值的不同設置可能會帶來假陰性結(jié)果，影響外來物種的鑒別檢出，應慎重選擇和設置生物信息學工具及參數(shù)[68]，致力于開發(fā)性能準確、流程簡化的軟件工具包以增強不同研究結(jié)果的可對比性及準確性。(3)參考數(shù)據(jù)庫的不完整性和不準確性是限制eDNA宏條形碼技術進行物種鑒定的主要障礙[72]，應齊心協(xié)力構建完善的物種DNA條形碼參考數(shù)據(jù)庫、建立全球范圍的資源信息共享和應用平臺以推動該技術的應用與推廣。(4)把握技術進步與跨學科合作的機遇。隨著測序技術的進一步發(fā)展，第三代測序技術即單分子讀取技術應運而生[75]，不僅進一步降低了測序成本、提高了測序長度和準確性，而且不依賴于PCR擴增，解決了PCR擴增偏向性問題，可極大地提高檢出準確度及物種豐度的計算準確性，將大大助力于外來生物的入侵防控；而遙感技術為標準化獲得時空尺度的全球性數(shù)據(jù)提供可能，機器學習可通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計和邏輯推理計算大量數(shù)據(jù)并科學預測，eDNA宏條形碼技術與衛(wèi)星遙感、機器學習的聯(lián)合使用可評估生態(tài)系統(tǒng)和生物多樣性隨時間的變化趨勢，重構生物網(wǎng)絡關系，為其在入侵生物學領域的發(fā)展和應用提供更了廣闊的空間[73]；且隨著公眾對生態(tài)環(huán)境保護的日益關注，公民科學團體正越來越多地在生態(tài)環(huán)境保護中發(fā)揮作用，未來可致力于開發(fā)商業(yè)化的eDNA分析試劑盒并推廣于全民參與的生物多樣性監(jiān)測、入侵生物發(fā)現(xiàn)檢測中，促進生態(tài)環(huán)境保護。

利用eDNA技術對特定外來生物的入侵機制研究也是未來生物入侵研究的重要方向，其在特定入侵物種的遺傳多樣性分析、生物量估算、入侵路徑以及外來物種在入侵過程中各種影響因素的相互作用等方面極具潛力，可為準確調(diào)查入侵生物種群大小、分布狀況、擴散模式及對本地生物遺傳多樣性的影響，制定科學合理的控制策略提供依據(jù)。未來可從開發(fā)能準確鑒別特定外來物種和相關近緣物種的特異性條形碼，探索影響eDNA與生物量線性關系的生物和非生物因素，校正優(yōu)化eDNA定量方法(比如考慮使用靈敏度較高ddPCR[15])等方面促進eDNA技術在入侵生物治理中的應用。

總之，生物入侵嚴重威脅入侵地的生態(tài)系統(tǒng)平衡，如不及時采取有效措施，越來越多的本地物種將瀕臨滅絕，生物多樣性水平將持續(xù)降低。eDNA技術具有低耗、高效、高靈敏度等優(yōu)勢，可高效監(jiān)測易遭受生物入侵的區(qū)域，為入侵生物的預警和防治提供基礎數(shù)據(jù)和技術支持，在水生入侵生物研究中的前景十分廣闊。此外，eDNA技術的便捷和可操作性也可為公民科學團體參與入侵生物的快速監(jiān)測提供可能，將大大提升公眾的生物保護興趣和熱情。相信隨著分子生物學技術的發(fā)展和相關操作流程的標準化，eDNA技術將越來越廣泛地運用于入侵生物學、保護生物學等生態(tài)學領域當中，為相關監(jiān)管部門針對具體情況制定相應的防治措施提供參考，助力全球生物多樣性保護。