曾兆華，湯保華，林濤，林嶺虹，楊廣，金菁，朱珍珍，方慧玲，游泳,*

1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，福州 350013 2. 蘇州華測安評技術(shù)服務(wù)有限公司，蘇州 215121 3. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002

水稻是我國重要的糧食作物。近年來，千金子、馬唐和旱稗等是我國南方稻田主要為害雜草[1]，主要依賴除草劑進(jìn)行防治。隨著除草劑使用量不斷加大，稻田附近水域中農(nóng)藥的檢出率也隨之增高。因此，需要對農(nóng)藥的使用進(jìn)行監(jiān)測和控制，并加強(qiáng)生態(tài)風(fēng)險評價。農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險評價是農(nóng)藥登記不可缺失的環(huán)節(jié)[2]，傳統(tǒng)的生態(tài)危害評估通常是基于室內(nèi)化學(xué)品對單一物種的急、慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果，而無法對自然生態(tài)系統(tǒng)中的種內(nèi)、種間關(guān)系進(jìn)行有效反映[3]。在2017年11月起施行的《農(nóng)藥登記資料要求》中，增加了化學(xué)農(nóng)藥制劑產(chǎn)品需提供環(huán)境風(fēng)險評估報告的要求[4]，運(yùn)用環(huán)境暴露模型評估化學(xué)農(nóng)藥制劑應(yīng)用后對水生生態(tài)系統(tǒng)的風(fēng)險是國際通行做法[5]。目前，國際上已建立了用于評估農(nóng)藥對地表水污染風(fēng)險的初級模型[6-7]和高級模型[8-12]；在2010年，我國與荷蘭科研人員合作研發(fā)出可用于我國農(nóng)藥暴露模擬的TOP-RICE模型[6,13]，但國內(nèi)外構(gòu)建的模型通常是基于實(shí)驗(yàn)室單一物種毒性測試結(jié)果而顯得過于保守，相反采用物種敏感度分布(SSD)研究等高級效應(yīng)分析方法能最大程度地接近實(shí)際環(huán)境條件，并確定初級評估中所識別風(fēng)險存在的可能性[14]。

大型溞(Daphniamagna)因?qū)Νh(huán)境中的多種化學(xué)物質(zhì)表現(xiàn)出高度敏感性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境污染的檢測和風(fēng)險評價中[15-17]，但其主要分布在我國北方，南方少見[18]，以其作為評價南方水田除草劑的環(huán)境風(fēng)險具有一定局限性。發(fā)頭裸腹溞(Moinairrasa)分布于我國各地，尤其是南方各省[11]，其內(nèi)稟增長率(rm)為大型溞等溞屬動物2倍～3倍以上[19]，是一種新的較為理想的試驗(yàn)材料[20]，但有關(guān)將發(fā)頭裸腹溞應(yīng)用于生態(tài)風(fēng)險評價的報道還很少。

五氟磺草胺是一種三唑并嘧啶磺酰胺類除草劑，通過抑制乙酰乳酸合成酶(ALS)發(fā)揮對雜草的控制作用[21-23]，可有效防除稗草、千金子等禾本科雜草以及一年生莎草科雜草，并對眾多闊葉雜草有效[24]，在世界各地水稻田中廣泛使用[25]。2004年9月24日五氟磺草胺在美國環(huán)境保護(hù)局(US EPA)正式注冊登記，2005年在美國南部稻區(qū)推廣應(yīng)用，2008年該藥在我國獲得登記。2014年在全球的銷售額達(dá)到2.6億美元，在我國也達(dá)到億元[26]；截至目前國內(nèi)已有180項(xiàng)含有五氟磺草胺有效成分的農(nóng)藥制劑獲得登記[27]，主要用于防治稻田一年生雜草。因ALS不存在于人和哺乳動物中，導(dǎo)致人們不太關(guān)注五氟磺草胺對非靶標(biāo)生物的影響[28]。有研究報道，五氟磺草胺制劑對斑馬魚3月齡幼魚毒性等級中等，且對斑馬魚胚胎和初孵幼魚均有一定的影響[29]；對黃河鯉仔魚、泥鰍幼魚均表現(xiàn)為高毒[30-31]等。與國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(IUPAC)報道的五氟磺草胺原藥對大型溞幼溞毒性等級為低毒，存在差異，而關(guān)于五氟磺草胺制劑對溞類毒力研究的報道還很少。因此，有必要探究五氟磺草胺制劑暴露對溞類存活、發(fā)育的影響。為進(jìn)一步開展五氟磺草胺對水生無脊椎動物的生態(tài)風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。

本文以25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑為例，通過急性活動抑制試驗(yàn)和繁殖試驗(yàn)，比較其對大型溞和發(fā)頭裸腹溞的毒力；并利用TOP-RICE暴露模型和SSD法對其進(jìn)行風(fēng)險評估。旨在比較25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對模式生物大型溞與南方常見物種發(fā)頭裸腹溞毒力差異，尋找較適合評價南方稻區(qū)農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)檢測的指示生物，為農(nóng)藥環(huán)境安全管理提供更可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)生物

本研究采用的受試大型溞(Daphniamagna)由中國科學(xué)院水生生物所提供，實(shí)驗(yàn)室自行保種繁育；發(fā)頭裸腹溞(Moinairrasa)采自福建省福州市閩侯縣南通鎮(zhèn)洲頭村小河，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室馴化，純系培養(yǎng)。取一頭健康親溞孤雌生殖3代以上形成室內(nèi)種群，選取出生24 h內(nèi)健康、活潑、大小一致的非頭胎健康溞作為實(shí)驗(yàn)材料。大型溞長期穩(wěn)定地培養(yǎng)于ISO標(biāo)準(zhǔn)稀釋水中，1 L燒杯中飼養(yǎng)20～30頭大型溞，培養(yǎng)溫度(20±2) ℃；發(fā)頭裸腹溞長期穩(wěn)定地培養(yǎng)于M4培養(yǎng)液中，1 L燒杯中飼養(yǎng)50～60頭發(fā)頭裸腹溞，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃，兩者培養(yǎng)液均每周更換3次，pH 7.0～9.0，光暗比16 h∶8 h，定期投放羊角月芽藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)作為餌料，每天于1 L燒杯中飼喂密度為5.00×105個·mL-1的藻液5～10 mL。

1.2 供試藥劑

五氟磺草胺(化學(xué)分子式為C16H14F5N5O5S，CAS號219714-96-2可分散油懸浮劑，陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技(中國)有限公司生產(chǎn)，有效成分含量25 g·L-1。

1.3 試驗(yàn)方法1.3.1 急性活動抑制試驗(yàn)

參照OECD 202標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行48 h急性活動抑制試驗(yàn)[32]。大型溞設(shè)0.19、0.42、0.93、2.05和4.50 mg a.i.·L-15個系列濃度，均用ISO標(biāo)準(zhǔn)稀釋水配制；發(fā)頭裸腹溞設(shè)4.90×10-2、0.15、4.44、1.33和4.00 mg a.i.·L-15個系列濃度，均用M4培養(yǎng)液配制。并設(shè)置不加藥劑的對照，每個處理和對照重復(fù)4次，實(shí)驗(yàn)時，在100 mL燒杯中裝入50 mL配制好的不同濃度藥液，每個燒杯中放入5頭幼溞，分別于24 h和48 h后記錄2種溞的中毒癥狀和受抑制數(shù)，輕晃試驗(yàn)燒杯，實(shí)驗(yàn)溞在15 s內(nèi)不能游動視為活動受抑制。在實(shí)驗(yàn)期間不投喂餌料，不更換試驗(yàn)溶液。試驗(yàn)分別在溫度(20±2) ℃、(25±2) ℃，光照周期L∶D=16 h∶8 h的人工氣候箱內(nèi)開展。

1.3.2 繁殖試驗(yàn)

參照OECD 211標(biāo)準(zhǔn)方法中21 d繁殖試驗(yàn)[33]。根據(jù)大型溞急性活動抑制試驗(yàn)結(jié)果，獲得供試農(nóng)藥對大型溞48 h-EC50(0.81 mg a.i.·L-1)，設(shè)3.82×10-4、1.22×10-3、3.91×10-3、1.25×10-2和4.00×10-2mg a.i.·L-15個系列濃度；根據(jù)發(fā)頭裸腹溞急性活動抑制試驗(yàn)結(jié)果，獲得供試農(nóng)藥對發(fā)頭裸腹溞48 h-EC50(0.52 mg a.i.·L-1)，設(shè)1.91×10-4、3.38×10-4、7.66×10-4、1.53×10-3、3.06×10-3和6.13×10-3mg a.i.·L-16個系列濃度；另設(shè)置不加藥劑的對照。每個處理和對照重復(fù)10次。試驗(yàn)時，用量筒量取不同濃度藥液各50 mL，放入100 mL燒杯中，在每個燒杯中放入1頭健康活潑的幼溞，分別在溫度(20±2) ℃、(25±2) ℃，光照周期L∶D=16 h∶8 h人工氣候箱中連續(xù)培養(yǎng)，大型溞試驗(yàn)時間持續(xù)21 d；發(fā)頭裸腹溞試驗(yàn)時間持續(xù)到所有受試個體全部死亡。試驗(yàn)期間采用半靜態(tài)試驗(yàn)系統(tǒng)，每隔1 d更換1次試驗(yàn)溶液，以保證試驗(yàn)期間藥劑濃度為起始濃度的80%以上。實(shí)驗(yàn)期間每天記錄2種溞的生存、蛻皮、懷卵和產(chǎn)子情況，及時移出蛻皮和新產(chǎn)幼溞，每天喂食羊角月芽藻。試驗(yàn)結(jié)束時，分別統(tǒng)計(jì)平均首次蛻皮時間、首胎時長、平均產(chǎn)幼溞數(shù)量和產(chǎn)幼溞胎數(shù)、平均存活時間及死亡率等。

1.3.3 供試物真實(shí)濃度檢測

在大型溞、發(fā)頭裸腹溞急性活動抑制試驗(yàn)中，于試驗(yàn)開始0、24和48 h分別取最低濃度組(處理1)、最高濃度組(處理5)的供試物水樣10 mL送至化學(xué)分析檢測室待測供試物的實(shí)際濃度；在大型溞繁殖試驗(yàn)中，所測得新舊溶液為試驗(yàn)開始0 h、第5天換水前后、第12天換水前后、第19天換水前后、第21天分別取濃度為3.82×10-4mg a.i.·L-1(處理1)、4.00×10-2mg a.i.·L-1(處理5)的供試物水樣10 mL送至化學(xué)分析檢測室待測供試物的實(shí)際濃度；在發(fā)頭裸腹溞繁殖試驗(yàn)中，所測得新舊溶液為試驗(yàn)開始0 h、第2天換水前后、第6天換水前后、第12天換水前后、第14天分別取1.91×10-4mg a.i.·L-1(處理1)、6.13×10-3mg a.i.·L-1(處理6)的供試物水樣10 mL送至化學(xué)分析檢測室待測供試物的實(shí)際濃度。

對于大型溞急性活動抑制試驗(yàn)水樣的前處理：水樣用0.45 μm濾膜過濾后，0.19 mg a.i.·L-1(處理1)的水樣取1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋10倍；4.50 mg a.i.·L-1(處理5)的水樣取0.1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋100倍。

對于發(fā)頭裸腹溞急性活動抑制試驗(yàn)水樣前處理：水樣用0.45 μm濾膜過濾后，4.90×10-2mg a.i.·L-1(處理1)的水樣取1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋10倍；4.00 mg a.i.·L-1(處理5)的水樣取0.1 mL，用乙腈定容至10 mL，稀釋100倍。

對于大型溞繁殖試驗(yàn)取處理1、處理5水樣；發(fā)頭裸腹溞繁殖試驗(yàn)取處理1、處理6水樣皆用0.22 μm濾膜過濾，上機(jī)待測。

五氟磺草胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：稱取99.47%的五氟磺草胺標(biāo)準(zhǔn)品2.50×10-3g，用乙腈定容至25 mL，得濃度為99.470 mg·L-1的母液，將母液用乙腈分別稀釋得到3.00×10-5、1.00×10-4、3.00×10-4、1.00×10-3、2.00×10-3、5.00×10-3、2.00×10-2和5.00×10-2mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。

添加回收：在對照樣品中添加一定量的乙基多殺菌素標(biāo)樣溶液，按照水樣檢測條件測定回收率。設(shè)1.00×10-4、1.00×10-3和1.00×10-2mg·L-13個添加濃度，每個添加濃度重復(fù)5次。

1.3.4 試驗(yàn)條件與濃度分析

本研究中對于五氟磺草胺在水溶液中的濃度分析采用超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters ACQUITY UPLC H-Class/Xevo TQ-S micro)，液相色譜條件：色譜柱為Waters UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，流動相為V(乙腈)∶V(0.1%甲酸水)=50∶50，流速0.3 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL，五氟磺草胺保留時間約為0.95 min。

質(zhì)譜條件：多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式掃描，電噴霧正離子模式(ESI+)，毛細(xì)管電壓1.0 kV，錐孔電壓42 V，離子源溫度150 ℃，錐孔反吹氣流量50 L·h-1，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量1 000 L·h-1，五氟磺草胺定量離子對m/z為 483.97/195.25，定性離子對m/z為483.97/164.23，定量離子碰撞能25 eV，定性離子碰撞能30 eV。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)溞類急性活動抑制試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件中的Probit(概率單位法)進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算出25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞、發(fā)頭裸腹溞的半效應(yīng)濃度(EC50)及其95%置信限。根據(jù)繁殖試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0軟件中的單因素方差(LSD法)分析各種指標(biāo)的組間差異。采用Excel 2007對各濃度組之間大型溞、發(fā)頭裸腹溞死亡率進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并用OriginPro 9.1軟件中的Line+symbol功能進(jìn)行制圖。

1.5 五氟磺草胺對水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生態(tài)效應(yīng)分析

對五氟磺草胺進(jìn)行農(nóng)藥環(huán)境風(fēng)險評估所需要的參數(shù)值主要來自農(nóng)藥性質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Pesticide Properties Database, PPDB)[34]、EFSA Journal數(shù)據(jù)庫[35](表1)。通過本研究獲得溞類急、慢性試驗(yàn)的EC50、無可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)值，并根據(jù)相應(yīng)的不確定因子(UF)，計(jì)算出溞類(急性)預(yù)測無效應(yīng)濃度(PNEC=EC50/UF)，溞類(慢性)預(yù)測無效應(yīng)濃度(PNEC=NOEC/UF)。其中，溞類急、慢性不確定因子(UF)分別選擇100和10[36]。

用TOP-RICE模型[13,37]分析得到連平、南昌預(yù)測環(huán)境濃度峰值(PECmax)中，選取PECmax數(shù)值最大的場景進(jìn)行初級風(fēng)險評估，根據(jù)溞類急、慢性試驗(yàn)周期，選擇相應(yīng)的時間加權(quán)平均預(yù)測環(huán)境濃度(PECtwa)作為預(yù)測環(huán)境濃度(PEC)，分別計(jì)算相應(yīng)的溞類急、慢性風(fēng)險商值(RQ=PEC/PNEC)。將本試驗(yàn)計(jì)算的RQ與US EPA建立的水生生物關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)(levels of concerns, LOCS)中RQ等級劃分進(jìn)行比較。若RQ≤1，表明風(fēng)險可接受；若RQ>1，表明風(fēng)險不可接受，則需要進(jìn)行更高級風(fēng)險評估。

1.6 五氟磺草胺對水生生態(tài)系統(tǒng)的高級生態(tài)效應(yīng)分析

當(dāng)五氟磺草胺對溞類的初級風(fēng)險評估不接受時，可收集多個物種的毒性數(shù)據(jù)采用SSD法進(jìn)行高級風(fēng)險評估。通過US EPA的ECOTOX數(shù)據(jù)庫[38]、高產(chǎn)量物質(zhì)信息系統(tǒng)(HPVIS)[39]和EFSA Journal[35]數(shù)據(jù)庫等獲取五氟磺草胺對無脊椎動物急、慢性毒性數(shù)據(jù)(表2)，對于同一物種有多個數(shù)據(jù)的情況，采用其所用濃度數(shù)據(jù)的幾何平均值。采用荷蘭國家公共衛(wèi)生與環(huán)境研究所(National Institute of Public Health and the Environment, RIVM)的RIVM研究小組開發(fā)的ETX 2.1模型構(gòu)建SSD曲線。以SSD計(jì)算出的5%物種危害濃度(HC5)，選擇3為不確定因子，計(jì)算預(yù)測無效應(yīng)濃度(PNEC=HC5/3)。

通過TOP-RICE模型分析得到連平、南昌預(yù)測環(huán)境濃度峰值(PECmax)作為預(yù)測環(huán)境濃度(PEC)，分別計(jì)算這2種場景下相應(yīng)的無脊椎動物風(fēng)險商值(RQ=PEC/PNEC)。如果RQ≤1，表明風(fēng)險可接受；RQ>1，表明風(fēng)險不可接受。

2 結(jié)果(Results)

2.1 供試物實(shí)測濃度

由表3可知，理論添加濃度≤1.00×10-2，回收率在60%～120%范圍內(nèi)，說明該方法能夠較為準(zhǔn)確地對25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑的含量進(jìn)行定量。

大型溞、發(fā)頭裸腹溞的急性活動抑制試驗(yàn)中，測得實(shí)測濃度皆在理論濃度的80%～120%范圍內(nèi)(表4)，其試驗(yàn)結(jié)果符合OECD 202標(biāo)準(zhǔn)[33]規(guī)定的試驗(yàn)要求，說明理論濃度是可重復(fù)且穩(wěn)定的，則以理論濃度計(jì)算本試驗(yàn)結(jié)果。

大型溞、發(fā)頭裸腹溞的繁殖試驗(yàn)中，測得實(shí)測濃度皆在理論濃度的80%～120%范圍內(nèi)(表5和表6)，其試驗(yàn)結(jié)果符合《化學(xué)品 大型溞繁殖試驗(yàn)》(GB/T21828—2008)[40]規(guī)定的試驗(yàn)要求，說明理論濃度是可重復(fù)且穩(wěn)定的，則以理論濃度計(jì)算本試驗(yàn)結(jié)果。

表1 TOP-RICE模型所需參數(shù)值Table 1 Parameter values for TOP-RICE model

表2 五氟磺草胺對無脊椎動物毒性數(shù)據(jù)Table 2 Toxicity data of penoxsulam to invertebrates

表3 分析方法準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Analysis of the accuracy of the test results

表4 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞、發(fā)頭裸腹溞急性毒性試驗(yàn)中藥液實(shí)測濃度Table 4 The actual concentration of 25 g·L-1 penoxsulam OD solution in acute toxicity test to Daphnia magna and Moina irrasa

表5 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞繁殖試驗(yàn)中藥液實(shí)測濃度Table 5 The actual concentration of 25 g·L-1 penoxsulam OD solution in reproduction test to Daphnia magna

2.2 五氟磺草胺對大型溞和發(fā)頭裸腹的急性毒性

25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞和發(fā)頭裸腹溞的48 h-EC50分別為0.81 mg a.i.·L-1和0.52 mg a.i.·L-1(表7)。參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗(yàn)準(zhǔn)則》[41]中農(nóng)藥對溞類的毒性等級劃分標(biāo)準(zhǔn)，該藥對大型溞及發(fā)頭裸腹溞的毒性等級皆為高毒。在試驗(yàn)過程中，對照組的大型溞及發(fā)頭裸腹溞死亡率<10%，生長狀況良好；不同濃度處理組的大型溞及發(fā)頭裸腹溞在接觸25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑后均受到不同程度抑制，抑制表現(xiàn)狀態(tài)為游動不積極、反應(yīng)遲鈍、沉底。

2.3 五氟磺草胺對溞類的慢性毒性效應(yīng)2.3.1 五氟磺草胺暴露對大型溞生長發(fā)育和繁殖的影響

由表8所示，不同濃度的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞的體長、平均存活個體產(chǎn)幼溞數(shù)及蛻皮次數(shù)有顯著的影響，隨著濃度提高，大型溞的體長、平均存活個體產(chǎn)幼溞數(shù)逐漸縮短或減少。當(dāng)高于濃度3.82×10-4mg a.i.·L-1時，大型溞的體長顯著縮短(P<0.05)。當(dāng)高于濃度3.91×10-3mg a.i.·L-1時，大型溞的產(chǎn)幼溞數(shù)顯著減少(P<0.05)。當(dāng)高于濃度1.25×10-2mg a.i.·L-1時，蛻皮次數(shù)顯著降低(P<0.05)。在試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍中，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞首次蛻皮時間、首胎時長、平均存活個體產(chǎn)幼溞胎數(shù)影響均不顯著。大型溞產(chǎn)幼溞數(shù)隨濃度提高逐漸減少。由圖1可知，前10 d，各濃度與對照中未出現(xiàn)大型溞的死亡；第10天時，僅濃度為1.25×10-2mg a.i.·L-1和4.00×10-2mg a.i.·L-1組開始出現(xiàn)大型溞的死亡；當(dāng)21 d試驗(yàn)結(jié)束時，對照與濃度3.82×10-4mg a.i.·L-1組未出現(xiàn)大型溞的死亡，高于濃度1.22×10-3mg a.i.·L-1處理組大型溞死亡率為10%～30%。綜合考慮本研究各項(xiàng)繁殖毒性終點(diǎn)指標(biāo)，以25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞的繁殖量(平均存活個體產(chǎn)幼溞數(shù))影響作為評價指標(biāo)，得到大型溞21 d-NOEC值為1.22×10-3mg a.i.·L-1。

2.3.2 五氟磺草胺暴露對發(fā)頭裸腹溞生長發(fā)育和繁殖的影響

如表9所示，不同濃度的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對發(fā)頭裸腹溞的首胎時長、平均存活個體產(chǎn)幼溞數(shù)和平均存活個體產(chǎn)幼溞胎數(shù)都有顯著的影響，隨著濃度升高，發(fā)頭裸腹溞的首胎時長、平均存活個體產(chǎn)幼溞數(shù)和平均存活個體產(chǎn)幼溞胎數(shù)呈縮短或減少趨勢。當(dāng)濃度為6.13×10-3mg a.i.·L-1時，與3.38×10-4mg a.i.·L-1和1.53×10-3mg a.i.·L-1相比，發(fā)頭裸腹溞首胎時長顯著縮短(P<0.05)；當(dāng)濃度為6.13×10-3mg a.i.·L-1時，平均存活個體產(chǎn)幼溞胎數(shù)顯著降低(P<0.05)。當(dāng)高于濃度1.53×10-3mg a.i.·L-1時，平均存活個體產(chǎn)幼溞胎數(shù)顯著降低(P<0.05)。在試驗(yàn)設(shè)定的濃度范圍中，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露對發(fā)頭裸腹溞首次蛻皮時間、平均存活時間影響不顯著。由圖1可知，前10 d，除對照和濃度為3.38×10-4mg a.i.·L-1處理組中未見到有發(fā)頭裸腹溞的死亡，其他各處理組皆存在死亡現(xiàn)象且死亡率較低；第10天時，對照和濃度為3.38×10-4mg a.i.·L-1處理組中開始出現(xiàn)發(fā)頭裸腹溞死亡現(xiàn)象，10 d后，隨作用濃度的增加存活率呈下降趨勢，存活時間也隨著濃度的增加而縮短。第14天時，濃度為3.06×10-3mg a.i.·L-1和6.13×10-3mg a.i.·L-1組的死亡率為100%，第16天，對照和其余處理組全部死亡。綜合考慮本研究各項(xiàng)繁殖毒性終點(diǎn)指標(biāo)，以25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對發(fā)頭裸腹溞的繁殖量(平均存活個體產(chǎn)幼溞數(shù))影響作為評價指標(biāo)，得到14 d-NOEC為7.66×10-4mg a.i.·L-1。

表6 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對發(fā)頭裸腹溞繁殖試驗(yàn)中藥液實(shí)測濃度Table 6 The actual concentration of 25 g·L-1 penoxsulam OD solution in reproduction test to Moina irrasa

表7 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞、發(fā)頭裸腹溞的急性毒性Table 7 Acute toxicity of 25 g·L-1 penoxsulam OD to Daphnia magna and Moina irrasa

2.4 五氟磺草胺對水生生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)效應(yīng)分析2.4.1 五氟磺草胺對溞類的初級效應(yīng)分析

通過TOP-RICE模型分析得到2種不同場景下的五氟磺草胺預(yù)測環(huán)境濃度峰值和時間加權(quán)平均預(yù)測環(huán)境濃度(表10)。結(jié)果顯示，連平-苗期場景與南昌-苗期場景相比，連平-苗期場景的預(yù)測環(huán)境濃度峰值最高，為8.11 μg·L-1，則選擇該場景下的時間加權(quán)平均預(yù)測環(huán)境濃度(PECtwa)作為預(yù)測環(huán)境濃度(PEC)，大型溞急、慢性的PEC分別取7.16 μg·L-1和4.53 μg·L-1；發(fā)頭裸腹溞急、慢性的PEC分別取7.16 μg·L-1和5.74 μg·L-1，用于下一步的急、慢性初級暴露分析。本研究獲得的大型溞48 h-EC50為0.81 mg a.i.·L-1，21 d-NOEC為1.22×10-3mg a.i.·L-1；發(fā)頭裸腹溞48 h-EC50為0.52 mg a.i.·L-1，14 d-NOEC為7.66×10-4mg a.i.·L-1，計(jì)算出大型溞急、慢性PNEC分別為8.10 μg·L-1和0.12 μg·L-1；發(fā)頭裸腹溞急、慢性PNEC分別為5.20 μg·L-1和7.66×10-2μg·L-1。由表11可知，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞急、慢性的RQ分別為0.88、37.13；對發(fā)頭裸腹溞急、慢性的RQ分別為1.38、74.93，故25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞(急性)風(fēng)險可接受，但對發(fā)頭裸腹溞(急性)風(fēng)險不可接受，且對溞類(慢性)風(fēng)險不可接受。因此，該藥需要進(jìn)一步高級效應(yīng)分析驗(yàn)證。

表9 25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對發(fā)頭裸腹溞生長發(fā)育和繁殖的影響Table 9 Effects of 25 g·L-1 penoxsulam OD on growth and reproduction of Moina irrasa

2.4.2 五氟磺草胺對無脊椎動物的高級效應(yīng)分析

以TOP-RICE模型分析得到的連平-苗期、南昌-苗期這2種場景下的五氟磺草胺預(yù)測環(huán)境濃度峰值(PECmax)分別為8.11 μg·L-1和4.00 μg·L-1作為進(jìn)一步無脊椎動物(急、慢性)高級效應(yīng)分析的預(yù)測環(huán)境濃度(PEC)(表10)。通過ECOTOX、HPVIS和EFSA Journal數(shù)據(jù)庫等獲取五氟磺草胺對8種無脊椎動物毒性數(shù)據(jù)(表2)，構(gòu)建了物種敏感性分布曲線，計(jì)算出該藥劑對無脊椎動物急、慢性的5%物種危害濃度(HC5)分別為37.89 μg·L-1和3.24 μg·L-1，因此無脊椎動物急、慢性PNEC分別為12.63 μg·L-1和1.08 μg·L-1。由表12可知，在連平-苗期五氟磺草胺對無脊椎動物急、慢性的RQ分別為0.64和7.51；在南昌-苗期五氟磺草胺對無脊椎動物急、慢性的RQ分別0.32和3.70，故五氟磺草胺對無脊椎動物(急性)風(fēng)險可接受，但對無脊椎動物(慢性)風(fēng)險不可接受。由圖2可知，同物種的無脊椎動物(急、慢性)對五氟磺草胺的敏感性排序存在明顯差異，大型溞(急、慢性)相對于其他物種而言對五氟磺草胺的敏感性較高。

圖1 25g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露條件下大型溞和發(fā)頭裸腹溞的存活率變化注：(a) 大型溞；(b) 發(fā)頭裸腹溞。Fig. 1 The survival rate of Daphnia magna and Moina irrasa exposed to 25 g·L-1 penoxsulam ODNote: (a) Daphnia magna; (b) Moina irrasa.

表10 五氟磺草胺初級暴露分析的峰值和時間加權(quán)平均濃度Table 10 Environmental exposure concentrations of penoxsulam by junior exposure analysis

3 討論(Discussion)

截至2017年，南方稻區(qū)約占我國水稻播種面積的94%，相應(yīng)地水稻種植期間農(nóng)藥的大規(guī)模使用對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的可能風(fēng)險值得關(guān)注[42]。尋找更加適合評價南方稻區(qū)農(nóng)藥生態(tài)毒理學(xué)的指示生物，為稻田系統(tǒng)精準(zhǔn)生態(tài)風(fēng)險評價提供更可靠的科學(xué)依據(jù)十分重要。在生態(tài)毒理學(xué)測試中，國際上最常用的無脊椎動物有鉤蝦、大型溞等[43]。大型溞作為一種模式生物，一直被我國廣泛應(yīng)用，卻忽視了我國幅員遼闊、南北地區(qū)地理和氣候差異、水環(huán)境中物種分布情況不一致等特點(diǎn)，因此在選擇稻區(qū)農(nóng)藥毒理學(xué)檢測指示生物要因地制宜，以便提供更加準(zhǔn)確的技術(shù)支持。

本研究對發(fā)頭裸腹溞試驗(yàn)采用25 ℃的試驗(yàn)條件，因有研究表明發(fā)頭裸腹溞的最適生殖溫度為25～30 ℃，25 ℃時累積生殖量最大[44]，且水稻生長發(fā)育最適溫度為25～30 ℃，綜合考慮采用25 ℃的試驗(yàn)條件能夠準(zhǔn)確體現(xiàn)發(fā)頭裸腹溞在自然水環(huán)境中受農(nóng)藥作用后的反應(yīng)，更符合田間實(shí)際情況。通過急性活動抑制試驗(yàn)結(jié)果可知，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞、發(fā)頭裸腹溞的急性毒性均為高毒，其對發(fā)頭裸腹溞的48 h-EC50(0.52 mg a.i.·L-1)低于對大型溞的48 h-EC50(0.81 mg a.i.·L-1)，表明對同一污染物發(fā)頭裸腹溞比大型溞更為敏感。

OECD 211標(biāo)準(zhǔn)[33]方法中規(guī)定了大型溞的繁殖試驗(yàn)為21 d，而對發(fā)頭裸腹溞的繁殖試驗(yàn)未見詳細(xì)規(guī)定。發(fā)頭裸腹溞與大型溞屬于2個溞屬，其生長和繁殖存在差異(表8和表9)。由圖1可知，發(fā)頭裸腹溞僅16 d就完成一個世代，其繁殖速度遠(yuǎn)快于大型溞，因第15天、第16天存活的母溞數(shù)量少且不產(chǎn)溞，故選擇14 d作為發(fā)頭裸腹溞試驗(yàn)周期，其更能反映出發(fā)頭裸腹溞在25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露水環(huán)境中的整個生長、繁殖周期情況。繁殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞及發(fā)頭裸腹溞的首次蛻殼時間、蛻皮數(shù)影響均不顯著，甲殼類動物等正常蛻皮是由蛻皮激素類生長調(diào)節(jié)劑所誘導(dǎo)，而五氟磺草胺主要是造成合成植物新組織所必需的支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)代謝障礙而致效[21-23]，并未對蛻皮激素起到抑制作用，從而未影響溞的蛻殼時間、蛻皮數(shù)。但本研究發(fā)現(xiàn)，濃度高于1.25×10-2mg a.i.·L-1時，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞的蛻皮數(shù)影響顯著，可能是因?yàn)樵囼?yàn)過程中大型溞存在死亡現(xiàn)象，導(dǎo)致濃度組的脫殼次數(shù)顯著下降。發(fā)頭裸腹溞的首胎時長比大型溞短，可能是因?yàn)榘l(fā)頭裸腹溞培養(yǎng)溫度高于大型溞。有研究表明，溫度升高可加快枝角類性成熟，從而縮短首胎時長[45]。25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞首胎時長影響不顯著，卻對發(fā)頭裸腹溞首胎時長影響顯著，發(fā)頭裸腹溞暴露在1.53×10-3～6.13×10-3mg a.i.·L-1的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑下，首胎時長隨著濃度提高逐漸縮短，可能是由于低劑量農(nóng)藥刺激性腺發(fā)育所致[46]。25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞平均存活個體產(chǎn)幼溞數(shù)影響顯著，但對平均存活個體產(chǎn)幼溞胎數(shù)、壽命影響不顯著；對發(fā)頭裸腹溞的平均存活個體產(chǎn)幼溞數(shù)、平均存活個體產(chǎn)幼溞胎數(shù)和首胎時長影響顯著，但對壽命影響不顯著。綜合結(jié)果可知，大型溞等溞類的繁殖能力是比壽命更加敏感的評價指標(biāo)[47-49]，而繁殖能力通常以首胎時長、產(chǎn)胎數(shù)和平均存活個體產(chǎn)幼溞數(shù)等端點(diǎn)值來考察[47,50]。而25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑暴露作用下，發(fā)頭裸腹溞所表現(xiàn)出繁殖能力的敏感性指標(biāo)比大型溞多。25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑雖對大型溞、發(fā)頭裸腹溞的平均存活時間影響不顯著，但在本試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨作用濃度增加發(fā)頭裸腹溞存活率逐漸下降，存活時間也隨著濃度的提高而縮短，說明25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對溞類存在慢性致死性(圖1)。如果溞類長期生存在本試驗(yàn)濃度的自然環(huán)境中，其種群數(shù)量將受到影響。

表11 五氟磺草胺初級風(fēng)險評估的風(fēng)險商值(RQ)(連平-苗期)Table 11 Risk quotient (RQ) of penoxsulam by junior exposure analysis (Lianping-seedling)

表12 五氟磺草胺高級風(fēng)險評估的風(fēng)險商值Table 12 Risk quotient of penoxsulam by advanced exposure analysis

圖2 五氟磺草胺暴露下無脊椎動物的物種敏感性分布注：(a) 無脊椎動物急性毒性；(b) 無脊椎動物慢性毒性。Fig. 2 Species sensitivity distribution of invertebrates exposed to penoxsulamNote: (a) Acute toxicity of invertebrates; (b) Chronic toxicity of invertebrates.

本研究經(jīng)TOP-RICE暴露模型初級評估發(fā)現(xiàn)，25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對大型溞的急性風(fēng)險可接受，但對發(fā)頭裸腹溞的急性、對無脊椎動物(慢性)風(fēng)險不可接受；進(jìn)一步采用SSD法高級評估可知，五氟磺草胺對無脊椎動物的急性風(fēng)險可接受，但對無脊椎動物的慢性風(fēng)險仍然不可接受，表明五氟磺草胺對南方溞種發(fā)頭裸腹溞的繁殖水平，即種群規(guī)模的發(fā)展有潛在生態(tài)風(fēng)險。可能是因?yàn)樵谒锘虻咎镏?，五氟磺草胺主要通過光解作用和生物方式降解[51]，其代謝產(chǎn)物主要有11種，其中有一些代謝物在環(huán)境中具有更長的殘留時間，并比母體更難被檢測[52]。Cattaneo等[53]研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚長時間暴露于含五氟磺草胺的稻田水后，其腦和肝會產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用，但在水中卻未檢測到五氟磺草胺，推測可能是緣于五氟磺草胺形成的代謝物。建議在稻田苗期施用五氟磺草胺時應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書的用藥量，切不可過量；應(yīng)較好地控制水稻在各時期的稻田用水量，以免農(nóng)藥在土壤中隨水快速下滲遷移，對無脊椎動物產(chǎn)生不良影響。

綜上可知，本研究通過急性活動抑制試驗(yàn)考察25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對溞類的毒性致死效應(yīng)，并通過繁殖試驗(yàn)深入評價其對溞類的毒性強(qiáng)度，結(jié)果顯示發(fā)頭裸腹溞比大型溞繁殖速度更快、敏感性更高，而從worst-case原則出發(fā)，在對廣泛分布于我國南方的稻區(qū)進(jìn)行水環(huán)境污染檢測和環(huán)境風(fēng)險評價時，建議采用分布于南方各省并對化學(xué)物質(zhì)更為敏感的發(fā)頭裸腹溞作為指示生物，但由于本研究僅采用稻田用量最大的25 g·L-1五氟磺草胺可分散油懸浮劑對模式生物大型溞和南方常見物種發(fā)頭裸腹溞進(jìn)行毒力差異比較，而不同作用機(jī)理的農(nóng)藥品種繁多，該推論可靠性還有待進(jìn)一步研究，以為今后開展不同氣候帶環(huán)境生物安全的精準(zhǔn)評價提供科學(xué)依據(jù)。