文婷，隋彥伯，周雅娜，張赟，魏晨曦

淡水魚發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長沙 410081

四氧化三鐵納米顆粒(Fe3O4NPs)大量應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)[1]和生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域[2]，存在廣泛需求，因此Fe3O4NPs在市場上被大規(guī)模生產(chǎn)。但是，F(xiàn)e3O4NPs的大規(guī)模生產(chǎn)及使用導(dǎo)致包含F(xiàn)e3O4NPs的生活廢水或工業(yè)廢水排放進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)。由于Fe3O4NPs不溶于水，并且具有很強(qiáng)的吸附性，最終會沉降進(jìn)入沉積物中積累起來，導(dǎo)致沉積物中所含污染物的濃度是水相中的數(shù)百倍甚至數(shù)十萬倍[3]。當(dāng)受到外界的干擾時(shí)，沉淀在沉積物中的污染物會通過重懸浮、轉(zhuǎn)運(yùn)等作用重新釋放出來，對環(huán)境形成二次污染[4]，從而對水生植物、底棲生物、浮游生物和魚類等造成一定的影響。諸多文獻(xiàn)表明，鐵系納米材料對生物具有一定的毒性作用[5-6]，細(xì)胞可通過胞飲、擴(kuò)散和吞噬等途徑攝入Fe3O4NPs。研究表明Fe3O4NPs具有細(xì)胞毒性[7]，對藻類的生長的也有抑制作用[8]。也有證據(jù)表明，斑馬魚胚胎及幼魚連續(xù)在Fe3O4NPs中暴露28 d后，繼續(xù)放入清水中排出Fe3O4NPs 24 d，與對照組相比，斑馬魚體內(nèi)依然有大量的鐵積累[9]，但斑馬魚胚胎短期暴露的積累量并沒有研究。

目前，大量的人工納米材料對水生生物的毒性研究大部分都是在水相中進(jìn)行的，而在沉積物中的研究很少[10-11]。美國環(huán)境保護(hù)局認(rèn)為，沉積物的質(zhì)量安全評價(jià)是研究和管理水質(zhì)的緊要任務(wù)[12]。歐洲環(huán)境毒理化學(xué)學(xué)會認(rèn)為，生物暴露實(shí)驗(yàn)是評價(jià)沉積物中污染物的唯一可靠途徑。進(jìn)行毒性暴露實(shí)驗(yàn)所需要的污染沉積物一般是通過2種方式獲得：(1)直接采樣；(2)在相對純凈的沉積物中，人工添加某種化學(xué)污染物，獲得所需污染沉積物，這種方法叫做“加標(biāo)”[13]。由于自然沉積物雜質(zhì)太多且不能完全控制成分變化，而加標(biāo)沉積物各種成分及理化性質(zhì)都可以由人工調(diào)控，所以可以在毒理學(xué)暴露實(shí)驗(yàn)中建立特定的“劑量-效應(yīng)”依賴關(guān)系。

本文參考已發(fā)表的文獻(xiàn)研究[14]確定起始加標(biāo)量后，設(shè)置濃度梯度，以斑馬魚胚胎作為受試動物，以沉積物表面作為受試場所，對斑馬魚的胚胎進(jìn)行了為期96 h的急性毒性測試。該測試評估了斑馬魚胚胎生活的沉積物表面，由含有不同含量Fe3O4NPs的沉積物釋放的Fe3O4NPs和經(jīng)自然沉降后游離在沉積物表面的Fe3O4NPs對斑馬魚發(fā)育以及氧化應(yīng)激的影響。暴露在Fe3O4NPs下產(chǎn)生的活性氧(ROS)可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，這是Fe3O4NPs產(chǎn)生毒性的機(jī)制之一[15]。最后，我們對斑馬魚幼魚組織中的Fe3O4NPs含量進(jìn)行了檢測，旨在了解Fe3O4NPs含量的增加與氧化應(yīng)激之間存在的關(guān)聯(lián)。與此同時(shí)，天然水體中關(guān)于Fe3O4NPs的含量還沒有報(bào)道，希望我們的研究能夠?yàn)槌练e物中Fe3O4NPs的含量給出一個(gè)安全參考范圍。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學(xué)藥品與試劑

活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)以及組織鐵的檢測均使用購買的試劑盒進(jìn)行。ROS試劑盒、MDA試劑盒、SOD試劑盒、T-AOC試劑盒、組織鐵試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。Folin-酚蛋白檢測試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。20 nm Fe3O4NPs、85 μm SiO2和高嶺土購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。海鹽購自Aquarium Systems公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 海鹽水的配制與作用

稱取60 mg鹽，加入1 L的超純水，充分溶解后制成濃度為60 mg·L-1的海鹽水。海鹽水用于胚胎的培養(yǎng)以及加標(biāo)沉積物的配制。

1.3 Fe3O4 NPs的TEM表征檢測

使用濃度為60 mg·L-1海鹽水配制20 mg·L-1的Fe3O4NPs溶液樣品，超聲30 min后，用FEI TECNAI G2 F20 200 kV場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)對樣品的形貌進(jìn)行表征，觀察Fe3O4NPs的形貌以及分散情況。用Nano measure統(tǒng)計(jì)Fe3O4NPs的粒徑。

1.4 斑馬魚養(yǎng)殖與胚胎收集

AB品系野生型斑馬魚購自中國科學(xué)院水生生物研究所。14 h光照、10 h黑暗光周期處理，飼養(yǎng)于水溫(28.5±0.3) ℃的循環(huán)水生系統(tǒng)中。每天喂食2次豐年蟲卵。收集胚胎的前一個(gè)晚上將雄魚和雌魚以2∶1的比例放入交配缸中，并用透明隔板將雄魚和雌魚隔離開來，第2天早上8∶30左右抽開透明擋板，使雄魚和雌魚交配產(chǎn)卵。交配1 h后收集魚卵至培養(yǎng)皿中，并用海鹽水清洗胚胎。清洗后的胚胎需要經(jīng)過顯微鏡觀察選擇，將劣質(zhì)的胚胎去除后再進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)。

1.5 人工沉積物配制

由于自然沉積物中雜質(zhì)太多，且成分不可控制，F(xiàn)e3O4NPs濃度也不能確定，所以本實(shí)驗(yàn)采用沉積物加標(biāo)的方法，根據(jù)OECD No.233配制人工純凈沉積物，通過定量添加Fe3O4NPs，對斑馬魚胚胎進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)。

純凈的人工沉積物按照OECD Test No.233[16]說明配制。配方為5%的泥炭土(pH 5.5～6.0)+20%的高嶺土+75%的二氧化硅(50～200 μm)。將泥炭土過篩(100目)處理，篩出雜質(zhì)以及大顆粒，將過篩后的泥炭土放入燒杯，加入適量的雙蒸水，使用磁力攪拌器攪拌2 d使之均勻。再加入高嶺土和石英砂，繼續(xù)攪拌至粘稠狀，最后用CaCO3調(diào)節(jié)pH至7.0±0.5，在通風(fēng)陰涼處風(fēng)干至干粉狀待用。

1.6 人工沉積物清洗

在開始加標(biāo)前，將風(fēng)干好的人工沉積物加入適量雙蒸水，放入搖床中搖動12 h，取下后靜置12 h，倒掉上層水。重復(fù)一遍以上操作，最后風(fēng)干待用。此步驟的目的是為了充分清洗人工沉積物，以免發(fā)生毒性作用。結(jié)果也表明經(jīng)過清洗后的純凈人工沉積物并未發(fā)現(xiàn)毒性作用，洗滌2次后的死亡率下降到2.2%左右，非常接近純凈胚胎培養(yǎng)液的死亡率。

1.7 純凈人工沉積物加標(biāo)

稱取64 mg球型Fe3O4NPs，倒入試劑瓶中，加50 mL海鹽水，超聲30 min使之分散，形成懸濁液。然后迅速倒入盛有10 g純凈人工沉積物的燒杯中，用少量雙蒸水清洗試劑瓶2次并倒入燒杯，使用磁力攪拌機(jī)充分?jǐn)嚢枞斯こ练e物3 d左右，使其成為凝固狀態(tài)，然后繼續(xù)人工攪拌4 d左右至干燥狀態(tài)，最后使用玻璃棒碾碎成為粉末狀備用。

按照實(shí)驗(yàn)所需的濃度按比例加入制備好(包含F(xiàn)e3O4NPs和純凈沉積物)的干粉和純凈沉積物(總質(zhì)量為2 g)，加入20 mL海鹽水，搖床搖動12 h，取下靜置24 h，便可用于斑馬魚胚胎染毒。

1.8 斑馬魚胚胎染毒

沉積物質(zhì)量與海鹽水比例為1∶10，即1 g沉積物添加10 mL的海鹽水。向100 mL燒杯中添加2 g沉積物，并加入20 mL的海鹽水，搖床搖動12 h，靜置沉降24 h。實(shí)驗(yàn)組所采用的沉積物中Fe3O4NPs濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.6和3.2 mg·g-1，對照組為不含F(xiàn)e3O4NPs的沉積物，每個(gè)燒杯中放入30枚斑馬魚胚胎。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組每次實(shí)驗(yàn)都包含5個(gè)平行的重復(fù)組。試驗(yàn)期間，每隔24 h需要挑出死亡胚胎及幼魚，避免污染其他胚胎。在72 hpf記錄孵化率，96 hpf在顯微鏡下觀察每一只魚，并統(tǒng)計(jì)斑馬魚畸形率、心率和自主活動次數(shù)。

1.9 斑馬魚樣品制備與檢測

收集暴露于不同濃度Fe3O4NPs中存活的96 hpf幼魚，再使用1×PBS清洗幼魚，一共清洗3次。按照每尾魚20 μL PBS的比例置于玻璃勻漿器中，冰上研磨。最后取勻漿后的斑馬魚幼魚樣品于4 ℃、13 000g，離心10 min，取上清。上清用于蛋白質(zhì)、ROS、MDA和T-AOC含量的檢測。用于組織鐵生物累積檢測樣品的制備略有不同，收集96 hpf存活的幼魚，用1×PBS清洗，一共清洗3次，按照每尾魚10 μL生理鹽水的比例勻漿。勻漿液于4 ℃、2 500g，離心10 min，取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)含量和組織鐵的檢測。以上指標(biāo)的檢測步驟均嚴(yán)格按照所購買的試劑盒說明書進(jìn)行，并按照說明書提供的方法進(jìn)行計(jì)算，得出結(jié)果。

1.10 斑馬魚組織鐵檢測

由于Fe3O4NPs沒有直接的方法可進(jìn)行檢測，故采用組織鐵試劑盒進(jìn)行檢測。在酸性溶液和還原劑的作用下，使運(yùn)鐵蛋白中鐵與蛋白分離，使血清中的高鐵還原成亞鐵，后者與雙吡啶結(jié)合成粉紅色的絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)，鐵離子的含量與色澤成正比。酶標(biāo)儀520 nm處測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得計(jì)算公式，求得Fe2+含量，從而反映Fe3O4NPs含量。

1.11 統(tǒng)計(jì)與分析

本實(shí)驗(yàn)所得數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS Statistics 25進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多個(gè)處理組使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，Dunnett檢驗(yàn)用于比較實(shí)驗(yàn)組與對照組之間均值的差異顯著性。顯著水平定為P<0.05。使用GraphPad Prism 8作圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 Fe3O4 NPs的TEM表征

海鹽水中Fe3O4NPs的TEM成像與粒徑分布如圖1所示，其粒徑分布主要在13 nm左右，顯示了超聲處理后Fe3O4NPs的良好分散性。TEM表征得出材料粒徑均在納米尺度范圍內(nèi)，與廠商提供粒徑相比略小，這可能是因?yàn)槌曁幚硎笷e3O4NPs的粒徑變小。

2.2 沉積物中的Fe3O4 NPs對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

0.2 mg·g-1與0.4 mg·g-1Fe3O4NPs組對斑馬魚胚胎的孵化率影響不大(圖2(a))，與對照組的97.66%孵化率相比，這2組的72 hpf孵化率分別為92.59%(P>0.05)和84.85%(P>0.05)。與對照組相比，斑馬魚胚胎在0.8、1.6和3.2 mg·g-1Fe3O4NPs暴露組中的孵化率顯著降低，分別降低了41.7%(P<0.05)、38.1%(P<0.05)和40.96%(P<0.05)。

96 hpf斑馬魚幼魚的死亡率如圖2(b)所示，與對照組相比，人工沉積物中低濃度(0.4 mg·g-1)Fe3O4NPs對斑馬魚幼魚的死亡率影響較小，而高濃度Fe3O4NPs則顯著增加了96 hpf斑馬魚幼魚的死亡率。其中，與對照組相比，0.8 mg·g-1組的死亡率上升了5.4%(P<0.05)，1.6 mg·g-1和3.2 mg·g-1組的死亡率分別上升了9.5%(P<0.01)和14.6%(P<0.01)。人工沉積物中Fe3O4NPs對96 hpf斑馬魚幼魚的心率影響如圖2(c)所示，0.2、0.4、0.8和1.6 mg·g-1的Fe3O4NPs對斑馬魚幼魚心率的影響并不顯著，只有輕微的下降(P>0.05)。而高濃度暴露組(3.2 mg·g-1Fe3O4NPs)的斑馬魚幼魚平均心率與對照組相比，下降了8.7%(P<0.05)，差異顯著。

96 hpf斑馬魚幼魚的自主運(yùn)動能力如圖2(d)所示，與對照組平均游動次數(shù)27 min-1相比，低濃度組(0.2 mg·g-1和0.4 mg·g-1Fe3O4NPs)斑馬魚幼魚平均游動次數(shù)分別為24.3 min-1和24 min-1，游動頻率分別下降了10%(P>0.05)和11.1%(P>0.05)。與對照組相比，中高濃度組(0.8、1.6和3.2 mg·g-1)中斑馬魚幼魚的平均游動次數(shù)分別為17.3、16.3和16.6 min-1，游動頻率分別下降了35.9%、39.6%和38.5%(P<0.05)。

人工沉積物中析出的Fe3O4NPs對斑馬魚所造成的畸形問題主要有脊柱彎曲和卵黃囊腫。少數(shù)的尾部畸形、心包水腫等其他畸形(圖3(a)～圖3(d))。斑馬魚的畸形率如圖3(f)所示，人工沉積物中析出的Fe3O4NPs對斑馬魚的發(fā)育影響比較明顯，呈現(xiàn)濃度梯度依賴。與對照組相比，除了0.2 mg·g-1的Fe3O4NPs組外，其他濃度暴露組的斑馬魚畸形率均顯著增加。其中，0.4 mg·g-1和0.8 mg·g-1的Fe3O4NPs組的畸形率分別為5%和5.3%(P<0.05)，1.6 mg·g-1和3.2 mg·g-1濃度組的畸形率分別為10.5%和11.2%(P<0.01)。

圖1 四氧化三鐵納米粒子(Fe3O4 NPs)的透射電鏡(TEM)表征(n=100)Fig. 1 Transmission electron microscope (TEM) characterization of Fe3O4 nanoparticles (Fe3O4 NPs) (n=100)

圖2 沉積物中Fe3O4 NPs對斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性注：(a)72 h斑馬魚胚胎的孵化率，(b)96 h斑馬魚的死亡率，(c)96 h斑馬魚30 s內(nèi)心率，(d)96 h斑馬魚每分鐘自主活動次數(shù)； 與對照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 2 Developmental toxicity of Fe3O4 NPs on zebrafish embryosNote: (a) Hatchability at 72 h, (b) The mortality rate at 96 h, (c) Heat rate of 96 h in 30 s, (d) Number of autonomous activities per minute in 96 h; compared with the control group, *represents P<0.05, **represents P<0.01.

2.3 沉積物中的Fe3O4 NPs對斑馬魚幼魚氧化應(yīng)激水平的影響

斑馬魚胚胎暴露于含有Fe3O4NPs的人工沉積物后，除了0.2 mg·g-1的Fe3O4NPs組外，96 hpf斑馬魚幼魚體內(nèi)的ROS水平均出現(xiàn)顯著上升(如圖4(a))。最高濃度(3.2 mg·g-1)時(shí)，斑馬魚幼魚體內(nèi)ROS水平與對照組相比上升了100%(P<0.01)。96 hpf斑馬魚幼魚體內(nèi)MDA含量如圖4(b)所示，與對照組相比，低濃度(0.2 mg·g-1)Fe3O4NPs組中斑馬魚幼魚體內(nèi)MDA含量略微升高，但差異并不顯著。中高濃度(0.4、0.8、1.6和3.2 mg·g-1)Fe3O4NPs組中，斑馬魚體內(nèi)MDA含量分別升高了260%、230%、200%(P<0.05)和373%(P<0.01)，差異顯著。

如圖4(c)所示，與對照組相比，低濃度(0.2 mg·g-1和0.4 mg·g-1)Fe3O4NPs組的斑馬魚幼魚SOD活性有輕微上升，但不顯著。而從0.8 mg·g-1的Fe3O4NPs組開始，斑馬魚幼魚SOD活性與對照組相比開始下降。高濃度1.6 mg·g-1和3.2 mg·g-1Fe3O4NPs組中斑馬魚幼魚SOD活性與對照組相比顯著下降，分別下降了約24%和25%(P<0.05)。在低中濃度(0.2、0.4和0.8 mg·g-1)的Fe3O4NPs組中，96 hpf斑馬魚幼魚的T-AOC總抗氧化能力與對照組相比有輕微下降，但是并不顯著(P>0.05)。在1.6 mg·g-1和3.2 mg·g-1的Fe3O4NPs組中，T-AOC分別下降了33.8%(P<0.05)和62%(P<0.01)，差異顯著(如圖4(d))，總抗氧化能力明顯下降，說明斑馬魚幼魚受到氧化損傷。

2.4 人工沉積物中的Fe3O4 NPs對斑馬魚幼魚的組織鐵含量的影響

斑馬魚胚胎暴露于含F(xiàn)e3O4NPs的人工沉積物的表面后，96 hpf斑馬魚幼魚體內(nèi)Fe3O4NPs含量劑量依賴性上升(圖5)。與對照組相比，低濃度(0.2 mg·g-1)Fe3O4NPs組的斑馬魚幼魚體內(nèi)Fe3O4NPs含量略有增加，但差異不顯著。與對照組相比，0.4 mg·g-1、0.8 mg·g-1、1.6 mg·g-1和3.2 mg·g-1Fe3O4NPs組的斑馬魚幼魚體內(nèi)Fe3O4NPs含量上升了130%(P<0.05)、540%(P<0.01)、620%(P<0.01)和1 150%(P<0.01)。因此，沉積物中的Fe3O4NPs在斑馬魚中的生物積累效應(yīng)明顯。

3 討論(Discussion)

沉積物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在調(diào)節(jié)水質(zhì)中起著至關(guān)重要的作用，影響重金屬和有機(jī)污染物的固定化和再活化的過程[17]。重金屬離子在水中不斷地沉降，被水中的沉積物吸附與凝聚，最終會進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)并不斷累積在沉積物中[18]。但這個(gè)過程是可逆的，所以沉積物中的重金屬污染物在一些特定的條件下會釋放到水體中從而形成二次污染[19]。因此，被大量使用的Fe3O4NPs進(jìn)入水生生態(tài)系統(tǒng)后不斷累積在沉積物中，成為一個(gè)危害水生生態(tài)系統(tǒng)安全潛在的威脅[20]。我們的研究也證明了，即使Fe3O4NPs經(jīng)過長時(shí)間的沉降，生活在沉積物表面的魚類也會遭受到沉積物中Fe3O4NPs的影響。

研究表明，納米粒子產(chǎn)生毒性的主要方式是發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[21]。Fe3O4NPs進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生活性氧簇后與過氧化氫酶反應(yīng)生成的過氧化氫(H2O2)，H2O2再與Fe2+發(fā)生芬頓反應(yīng)，產(chǎn)生無法被清除的羥基自由基(·OH)，導(dǎo)致毒性產(chǎn)生，這是Fe3O4NPs獨(dú)有的致毒機(jī)理[22]。

斑馬魚的胚胎是一顆受精卵，此時(shí)期只有一層卵膜包裹，胚胎膜相當(dāng)于細(xì)胞膜。有研究表明，附著在細(xì)胞膜上的納米顆粒引起氧化損傷從而導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失。納米粒子穿孔導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷和膜通透性增加從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的滲漏。同時(shí)，還觀察到細(xì)胞表面的粗糙度增加和膜損傷，納米顆?？梢匝杆俅┩干锬?，從而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[23]。研究表明，釋放到水生環(huán)境中的工程金屬納米粒子會在沉積物中積累[24-25]，且Fe3O4NPs具有磁性[26]，所以會比其他的金屬納米粒子更加容易聚集沉降。同時(shí)，在本研究中，沉積物經(jīng)過沉降后上覆水中的顆粒物減少，此時(shí)斑馬魚胚胎靜置在沉積物表面，未產(chǎn)生擾動。因此，大多數(shù)的Fe3O4NPs進(jìn)入到了沉積物當(dāng)中。所以，沉積物表面的Fe3O4NPs通過擴(kuò)散作用透過卵膜進(jìn)入斑馬魚胚胎中，這是斑馬魚胚胎時(shí)期Fe3O4NPs進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)的主要方式。胚胎在Fe3O4NPs的刺激下發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，刺激胚胎中生成多種活性氧簇，胚胎中活性氧在過氧化物酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2。然后，F(xiàn)e2+通過Fenton反應(yīng)催化H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘愿鼜?qiáng)的·OH，而·OH不能被體內(nèi)任何已知的酶清除，因此導(dǎo)致嚴(yán)重的體內(nèi)毒性。為了解Fe3O4NPs對斑馬魚可能造成的氧化損傷，檢測了斑馬魚體內(nèi)的氧化應(yīng)激指標(biāo)。隨著沉積物中Fe3O4NPs含量的增加，氧化應(yīng)激水平也相應(yīng)發(fā)生了變化，各指標(biāo)呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。這個(gè)結(jié)果與其他研究者已發(fā)表的結(jié)果一致[27]。

圖3 Fe3O4 NPs致斑馬魚胚胎畸形注：圖中箭頭所指為畸形部位；(a)為正常幼魚形態(tài)，(b)為卵黃腫大，尾巴彎曲，(c)為卵黃腫大，(d)為脊柱彎曲，心包水腫，卵黃腫大， (e)圓圈所圈的表示與土壤吸附團(tuán)聚的Fe3O4 NPs，(f) 96 h畸形率；與對照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 3 Deformity of zebrafish embryos induced by Fe3O4 NPsNote: The position indicated by the arrow is a deformed position; (a) Normal fish, (b) Yolk cyst, tail bending, (c) Yolk enlargement, (d) Spinal column curvature, pericardial edema, yolk cyst, (e) Soil agglomeration, (f) The deformity rate at 96 h; compared with the control group,*represents P<0.05, **represents P<0.01.

圖4 Fe3O4 NPs對斑馬魚胚胎的氧化應(yīng)激效應(yīng)注：與對照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 4 Effects of Fe3O4 NPs on oxidative stress in zebrafish embryosNote: Compared with the control group, *represents P<0.05, **represents P<0.01.

圖5 Fe3O4 NPs在斑馬魚胚胎中的蓄積注：與對照組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 5 Accumulation of Fe3O4 NPs in zebrafish embryosNote: Compared with the control group, *represents P<0.05, **represents P<0.01.

在本研究中，從0.8 mg·g-1的Fe3O4NPs開始，斑馬魚死亡率逐漸升高，孵化率降低。在斑馬魚胚胎時(shí)期，隨著沉積物中Fe3O4NPs濃度的增加，更多的Fe3O4NPs可以透過胚胎膜進(jìn)入到胚胎中產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。在斑馬魚幼魚時(shí)期，斑馬魚在沉積物表面休憩會攝取表面沉積物為食從而使Fe3O4NPs進(jìn)入體內(nèi)[28-29]。同時(shí)，鰓呼吸也會使納米粒子進(jìn)入幼魚體內(nèi)[29]。斑馬魚幼魚從底部相對靜止?fàn)顟B(tài)到水中游動狀態(tài)時(shí)會產(chǎn)生擾動，擾動效應(yīng)會使得沉積物表面攜帶Fe3O4NPs的沉積物顆粒被激起[28-29]。此時(shí)幼魚主要通過體表吸附以及呼吸作用攝入游離在水中的Fe3O4NPs顆粒，這都使斑馬魚的幼魚產(chǎn)生了大量的活性氧簇，導(dǎo)致死亡增加，組織中鐵離子含量的增加也印證了此推論。斑馬魚孵化率降低的原因除了Fe3O4NPs可以透過卵膜進(jìn)入胚胎產(chǎn)生氧化毒性之外，還因?yàn)镕e3O4NPs具有超順磁性[26]，F(xiàn)e3O4NPs可以和更多的沉積物結(jié)合吸附，部分形成土壤團(tuán)聚物，包裹在胚胎表面，使胚胎不能突破卵膜，導(dǎo)致胚胎窒息死亡。同時(shí)也有研究證明，高濃度的Fe3O4NPs可以使受精卵孵化延遲[30]。

Fe3O4NPs可使斑馬魚畸形率升高。斑馬魚出現(xiàn)的畸形情況主要有卵黃腫大、脊柱彎曲和心包水腫。卵黃腫大的原因是Fe3O4NPs進(jìn)入幼魚體內(nèi)，發(fā)生氧化應(yīng)激毒性，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生而使卵黃腫大，同樣心包水腫也有炎癥反應(yīng)的參與。另外，研究證明斑馬魚在高含量鐵環(huán)境下，Bmp2受到抑制作用，定量驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)鐵過載后runx2a、runx2b和sp7等成骨基因均下調(diào)，從而導(dǎo)致成骨代謝的異常[31]。因此，F(xiàn)e3O4NPs在體內(nèi)不斷積累，抑制斑馬魚魚骨的形成，導(dǎo)致斑馬魚骨骼畸形。

斑馬魚幼魚自主運(yùn)動能力、活力下降的一個(gè)原因是斑馬魚幼魚受到的氧化損傷會使機(jī)體發(fā)育遲緩從而導(dǎo)致運(yùn)動器官發(fā)育不足。在研究中觀察到Fe3O4NPs使斑馬魚孵化降低，這從側(cè)面佐證Fe3O4NPs導(dǎo)致的氧化損傷能夠造成發(fā)育遲緩，使胎膜內(nèi)的小魚無法突破卵膜。其活力下降的另一個(gè)原因：暴露在高濃度鐵環(huán)境下，鐵與活性氧中間物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生的自由基引起腦內(nèi)不同的細(xì)胞和血紅蛋白的防御反應(yīng)，導(dǎo)致了神經(jīng)元的毒性作用[32]。Zhang等[33]認(rèn)為鐵過載會引發(fā)鐵超負(fù)荷心肌疾病。我們在研究中也觀察到了心率下降的現(xiàn)象。

隨著沉積物中Fe3O4NPs含量的增加，斑馬魚體內(nèi)Fe3O4NPs也相應(yīng)增加。在本研究中，斑馬魚體內(nèi)Fe3O4NPs增加，尤其是中高濃度組(0.8 mg·g-1和1.6 mg·g-1)，增加量十分顯著，并出現(xiàn)一定的濃度劑量依賴。氧化應(yīng)激的指標(biāo)也會與斑馬魚體內(nèi)Fe3O4NPs的積累量呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系，即斑馬魚組織中檢測出的Fe2+濃度越高就意味著進(jìn)入到幼魚體內(nèi)的Fe3O4NPs越多，導(dǎo)致的氧化毒性就越劇烈。因此，可認(rèn)為，斑馬魚受到氧化損傷程度與沉積物中的Fe3O4NPs在斑馬魚體內(nèi)不斷積累有關(guān)。Fe3O4NPs的鐵積累在生物體內(nèi)的現(xiàn)象并不是孤例。Zhang等[9]采用為期52 d的連續(xù)半靜態(tài)水暴露方案，研究了2種氧化鐵納米材料(nano-Fe2O3和nano-Fe3O4)在斑馬魚體內(nèi)的累積和消除情況。成年斑馬魚暴露在初始濃度為4.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1的nano-Fe2O3、nano-Fe3O4懸浮液中持續(xù)28 d，然后將其轉(zhuǎn)移到清水中24 d以進(jìn)行消除實(shí)驗(yàn)。通過測量魚體和糞便中的鐵含量發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e在濃度4.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1的nano-Fe2O3處理組中最高累積量分別為1.32 mg·g-1和1.15 mg·g-1，F(xiàn)e在濃度為4.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1的nano-Fe3O4中最高累積量分別為1.25 mg·g-1和0.90 mg·g-1。在藻類的研究中，小球藻中累積的鐵含量隨著Fe3O4NPs的濃度和暴露時(shí)間的增加而增加[34]。經(jīng)72 h、濃度為400 μgmL-1的Fe3O4NPs處理的藻細(xì)胞，鐵的生物積累量是對照組的35倍。在此處理?xiàng)l件下，鐵的生物積累量從24 h至72 h增加了2.81倍。因此，經(jīng)Fe3O4NPs處理后，無論是植物還是動物都會表現(xiàn)出一定程度的鐵積累，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，所以鐵積累是一個(gè)普遍的現(xiàn)象。那么，F(xiàn)e3O4NPs進(jìn)入到生物體內(nèi)后產(chǎn)生氧化毒性從而導(dǎo)致生物體死亡也會成為一個(gè)普遍的現(xiàn)象。

綜上，沉積物中游離出來的Fe3O4NPs積累在斑馬魚幼魚體內(nèi)導(dǎo)致氧化損傷從而引起斑馬魚幼魚發(fā)育異常。這種氧化損傷也可能會通過食物鏈層層放大進(jìn)而對人類健康構(gòu)成一定威脅。除此之外，由于沉積物中物質(zhì)復(fù)雜多變，累積在沉積物中的Fe3O4NPs可能與其他污染物聯(lián)合作用從而導(dǎo)致巨大的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。