覃悅　祝友朋　韓長志　

摘要： 黃單胞菌（Xanthomonas campestris）作為諸多革蘭氏陰性細(xì)菌之一，主要危害十字花科農(nóng)作物和核桃、杧果等經(jīng)濟(jì)林植物。前人對植物病原細(xì)菌、真菌等的分泌蛋白和相關(guān)蛋白質(zhì)開展了預(yù)測及分析研究，明確其分泌蛋白在致病過程中具有非常重要的作用。本研究以已經(jīng)公布全基因組序列的黃單胞菌X.campestris B100、X. campestris pv.campestris str.8004、X. campestris CN14中的蛋白質(zhì)序列為基礎(chǔ)，結(jié)合細(xì)菌中分泌蛋白的基本特征，采用在線分析程序（包括SignalP v5.0、ProtComp v9.0等）對上述3個黃單胞菌的分泌蛋白序列進(jìn)行預(yù)測和分析，明確上述細(xì)菌中分別含有135個、128個、135個分泌蛋白，并對分泌蛋白所具有的基本特征開展分析，為深入研究黃單胞菌分泌蛋白的功能打下理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 黃單胞菌;全基因組;信號肽;生物信息學(xué)

中圖分類號： S435.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1000-4440（2021）01-0053-07

Prediction and characteristic analysis of Xanthomonas campestris secretory protein based on whole genome sequence

QIN Yue1， ZHU You-peng1， HAN Chang-zhi1，2

（1.College of Biodiversity Conservation and Utilization， Southwest Forestry University， Kunming 650224，China;2.Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control of Yunnan Province， Kunming 650224， China）

Abstract： As a kind of many Gram-negative bacteria， Xanthomonas campestris mainly harms cruciferous crops and economic forest plants such as walnut and mango. Some academic predecessors discovered that secretory proteins played an important role in the pathogenic process by predicting and analyzing the secreted proteins and related proteins of plant pathogenic bacteria and fungi. This study was based on the protein sequences of X. campestris B100， X. campestris pv. campestris str.8004 and X. campestris CN14 whose whole genome sequences had been published， combined with the basic characteristics of secretory proteins， using online analysis programs （such as SignalP v5.0， ProtComp v9.0， etc.） to predict and analyze the above three protein sequences， it was found that the bacteria contained 135， 128 and 135 secretory proteins， respectively， and analysis on the basic characteristics of secretory proteins was carried out， thus made theoretical foundation for the in-depth study of the function of X. campestris secretory proteins.

Key words： Xanthomonas campestris;genome;signal peptide;bioinformatics

植物作為生物界的重要生產(chǎn)者，其在生長過程中始終面臨著諸如真菌、細(xì)菌等微生物的侵害[1]。在危害茄科、十字花科以及胡桃科等多種重要經(jīng)濟(jì)作物的諸多病原細(xì)菌中，尤以黃單胞菌（Xanthomonas campestris）造成的危害較重，該病菌在分類上屬于假單胞菌科（Pseudomonadaceae）黃單胞菌屬（Xanthomonas）[2]。國內(nèi)外學(xué)者對于該菌的研究主要集中于基因功能[3]、效應(yīng)蛋白[4]、該菌與黃原膠的作用關(guān)系[5]以及分類[6]等方面。前人研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的致病機(jī)制主要是通過分泌系統(tǒng)將其分泌蛋白輸入植物組織中，其效應(yīng)分子蛋白質(zhì)往往通過與植物防衛(wèi)反應(yīng)的相關(guān)分子發(fā)生作用，進(jìn)一步促進(jìn)其在植物中的定殖、擴(kuò)展以及對植物產(chǎn)生危害。

近些年，學(xué)術(shù)界對植物病原菌（真菌、細(xì)菌以及卵菌等）分泌蛋白開展了諸多研究工作[7]，例如，稻瘟病菌[8]、致病疫霉[9]、大麗輪枝菌[10]、黃單胞菌VI型分泌蛋白[11]以及細(xì)菌性黑斑病菌[12]的分泌蛋白等。作為危害農(nóng)林生產(chǎn)的非常重要的黃單胞菌屬細(xì)菌，其全基因組序列已經(jīng)被測序，然而，尚未見關(guān)于黃單胞菌分泌蛋白的預(yù)測及特性的研究報道，嚴(yán)重影響著學(xué)術(shù)界對于該病菌致病機(jī)制的解析。

為了更好地明確黃單胞菌中分泌蛋白的數(shù)量及特征情況，本研究選擇全基因組序列已經(jīng)公布的3種黃單胞菌X. campestris B100、X. campestris CN14、X. campestris pv.campestris str.8004（分別簡稱為XCB100、XCCN14、XC8004），根據(jù)分泌蛋白具有的典型特征，從信號肽、亞細(xì)胞定位以及跨膜結(jié)構(gòu)等方面入手，利用生物信息學(xué)分析軟件，對上述黃單胞菌中的分泌蛋白進(jìn)行預(yù)測并對其信號肽、氨基酸殘基等性質(zhì)進(jìn)行特征分析，同時與同屬不同種的細(xì)菌性黑斑病菌分泌蛋白[12]進(jìn)行對比和分析，以期為深入開展黃單胞菌侵入寄主植物過程中分泌蛋白的作用解析奠定堅實的理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)開展生物學(xué)試驗驗證打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 分泌蛋白序列來源

黃單胞菌X. campestris B100（XCB100）、X. campestris CN14（XCCN14）、X. campestris pv.campestris str.8004（XC8004）的全蛋白質(zhì)組序列來源于美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI），上述菌株登錄號分別為GCA_000070605.1、GCA_000401735.2、GCA_000012105.1。

1.2 分泌蛋白的預(yù)測

根據(jù)分泌蛋白的基本特征，利用SignalP v5.0[13]、ProtComp v9.0[14]、TMHMM v2.0[15]、Phobius[16]分別預(yù)測分析蛋白質(zhì)信號肽并預(yù)測其亞細(xì)胞定位，同時排除具有跨膜結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。再利用TargetP v2.0[17]、TatP v1.0[18]和LipoP v1.0[19]預(yù)測分析轉(zhuǎn)運肽、信號肽酶識別位點和脂蛋白等，排除定位在胞內(nèi)細(xì)胞器的蛋白質(zhì)。關(guān)于黃單胞菌中分泌蛋白的獲取方法，具體規(guī)則及步驟參考文獻(xiàn)[20]。

1.3 分泌蛋白基本特征分析

利用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計和分析分泌蛋白中的氨基酸殘基和信號肽特征，并用Origin 2019作圖軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分泌蛋白的數(shù)量預(yù)測及所占比例

基于細(xì)菌中分泌蛋白所具有的典型特征（在N端含有信號肽、無跨膜結(jié)構(gòu)域、無糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定位點，且不定位于胞內(nèi)細(xì)胞器等），采用多種生物信息學(xué)分析軟件對3個黃單胞菌（XCB100、XCCN14、XC8004）中的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，通過SignalP v5.0預(yù)測，黃單胞菌XCB100、XCCN14和XC8004中具有典型信號肽序列的蛋白質(zhì)數(shù)量分別為714個、712個和646個，占總蛋白質(zhì)數(shù)量的比例分別為17.10%、17.26%和15.02%（圖1）。進(jìn)一步通過ProtComp v9.0預(yù)測軟件對上述蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示，XCB100中136個蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞外，其余578個蛋白質(zhì)分別定位在細(xì)胞質(zhì)膜、胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì);XCCN14中135個蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞外，其余577個蛋白質(zhì)則分布在細(xì)胞質(zhì)膜、胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)中;XC8004中128個蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞外，其余518個蛋白質(zhì)分布在細(xì)胞質(zhì)膜、胞內(nèi)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)（圖1）。

由于上述分析結(jié)果尚不能完全確定細(xì)菌中的分泌蛋白，進(jìn)一步利用TMHMM v2.0、Phobius以及TatP、LipoP等生物信息學(xué)分析軟件對上述獲得的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析篩選。結(jié)果表明，黃單胞菌XCB100、XCCN14和XC8004中不具有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)數(shù)量分別為135個、135個和128個，含有脂蛋白信號肽的蛋白質(zhì)數(shù)量則分別有59個、58個和52個，含有信號肽酶的蛋白質(zhì)數(shù)量分別為10個、13個和14個。經(jīng)過上述分析，最終明確黃單胞菌XCB100、XCCN14和XC8004中具有典型特征的分泌蛋白數(shù)量分別為135個、135個、128個（表1）。

2.2 分泌蛋白的氨基酸序列長度及組成分析

為了更加清晰地明確分泌蛋白的氨基酸序列長度及組成，本研究對黃單胞菌XCB100、XCCN14和XC8004中分泌蛋白的氨基酸長度進(jìn)行進(jìn)一步統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，XCB100中的分泌蛋白大小多集中于100～300 aa，所占比例為76.3%;XC8004中的分泌蛋白大小多集中于100～300 aa，所占比例為78.52%;而XCCN14中的分泌蛋白大小多集中于100～250 aa，所占比例為69.53%（圖2）。上述分析結(jié)果表明，黃單胞菌中的分泌蛋白的氨基酸長度主要集中在100～250 aa，屬于小分子蛋白質(zhì)。

同時，對上述3種黃單胞菌中分泌蛋白的氨基酸組成情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明，3種黃單胞菌中分泌蛋白的氨基酸組成情況較為相似，其中尤以A（丙氨酸）在分泌蛋白中的含量最高，所占比例為12.5%，而以C（半胱氨酸）在分泌蛋白中的含量最低，所占比例為1.5%，另外，諸如G（甘氨酸）、L（亮氨酸）、R（精氨酸）、V（纈氨酸）等含量也具有較高的比例，分別為8.7%、8.8%、7.0%、6.9%（圖3）。

2.3 分泌蛋白的信號肽特征分析

對上述分泌蛋白信號肽開展進(jìn)一步分析，結(jié)果表明，黃單胞菌XCB100、XCCN14和XC8004中的分泌蛋白信號肽長度多集中于19～26 aa，所占比例分別為77.94%、76.47%和74.42%，尤以長度為21 aa和22 aa的蛋白質(zhì)數(shù)量居多（圖4）。

2.4 信號肽切割位點特征分析

進(jìn)一步對3種黃單胞菌分泌蛋白中所具有的信號肽切割位點進(jìn)行特征分析，結(jié)果表明，黃單胞菌XCB100中分泌蛋白的氨基酸殘基數(shù)量占比以丙氨酸最高，為21.75%，谷氨酸的數(shù)量占比最低，僅為0.13%，其他氨基酸殘基數(shù)量占比由高到低依次為亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、色氨酸、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、天冬氨酸（圖5）。此外，在信號肽切割位點-3、-2、-1、1、2處，丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸的數(shù)量占比最高，分別為69.63%、14.81%、72.59%、32.59%、17.78%（圖5）。氨基酸的組成在-3和-1位點上相對比較保守，屬于丙氨酸-任意氨基酸-丙氨酸（A-X-A）類型，在-3位點上，除丙氨酸之外，半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸的數(shù)量占比分別為7.41%、3.70%、2.96%、2.96%、4.44%、8.89%，而天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、色氨酸、酪氨酸數(shù)量所占比例均為0;在-1位點，除了丙氨酸外，半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸數(shù)量所占比例分別為11.11%、10.37%、0.74%、2.06%、2.22%（圖5）。

黃單胞菌XCCN14分泌蛋白氨基酸組成成分中，尤以丙氨酸數(shù)量所占比例最高，為21.44%;谷氨酸的數(shù)量占比最低，僅為0.07%，其他氨基酸殘基的數(shù)量占比由高到低依次為亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、酪氨酸、天冬氨酸。此外，在信號肽切割位點-3、-2、-1、1、2處，丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸的數(shù)量占比最高，分別為67.41%、13.33%、74.07%、31.85%、17.03%（圖6）。氨基酸的組成在-3和-1位點上相對比較保守，屬于A-X-A類型，在-3位點上，除丙氨酸之外，半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸數(shù)量所占比例分別為7.41%、4.44%、3.70%、3.70%、5.19%、8.15%，而天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、色氨酸、酪氨酸數(shù)量所占比例均為0;在-1位點除了丙氨酸之外，半胱氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸數(shù)量所占比例分別為8.89%、9.63%、4.44%、2.96%（圖6）。

黃單胞菌XC8004分泌蛋白氨基酸殘基組成中，尤以丙氨酸數(shù)量所占比例最高，為20.41%，谷氨酸數(shù)量占比最低，僅為0.17%，其他氨基酸按數(shù)量占比由高到低排序依次為亮氨酸、絲氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、組氨酸、天冬酰胺、色氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、天冬氨酸。此外，在信號肽切割位點-3、-2、-1、1、2處，丙氨酸、絲氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸的數(shù)量占比最高，分別為64.84%、16.41%、74.22%、29.69%、16.41%（圖7）。氨基酸殘基的組成在-3和-1位點上相對比較保守，屬于A-X-A類型，在-3位點上，除丙氨酸之外，半胱氨酸、甘氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸數(shù)量所占比例分別為10.94%、3.13%、2.34%、1.56%、3.91%、4.96%、8.59%，而天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、色氨酸、酪氨酸數(shù)量所占比例均為0;在-1位點除了丙氨酸外，半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸數(shù)量所占比例分別為8.59%、8.59%、0.78%、5.47%、2.34%（圖7）。

3 討論

近年來，關(guān)于植物病原菌分泌蛋白和碳水化合物活性酶、效應(yīng)分子等的研究已經(jīng)成為植物病理學(xué)研究的重點和難點[7]。隨著諸多植物病原菌全基因組序列被測序，為深入開展上述病原菌致病基因的研究提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。目前，包括本研究小組在內(nèi)的諸多國內(nèi)外研究者對植物生物（如真菌[8，10，21-23]和卵菌[24]）分泌蛋白進(jìn)行了大量的生物信息學(xué)分析和預(yù)測工作，并對枯草芽孢桿菌、細(xì)菌性黑斑病病菌等植物病原菌的分泌蛋白展開了預(yù)測工作[12]。前人的研究結(jié)果表明，各類植物中的不同真菌和細(xì)菌及卵菌中所含分泌蛋白的數(shù)量和所占比例不完全相同[20]。其中，植物病原真菌分泌蛋白數(shù)量占總蛋白質(zhì)數(shù)量的比例約為3.65%～9.58%[25-26]，且不同活體營養(yǎng)型病原菌之間存在著一定差異;卵菌中含有的分泌蛋白數(shù)量占總蛋白質(zhì)數(shù)量的比例約為2.96%～4.01%[25];細(xì)菌分泌蛋白數(shù)量占總蛋白質(zhì)數(shù)量的比例約為5.05%～5.41%[12]。

本研究通過生物信息學(xué)分析工具，對XCB100、XCCN14、XC8004等3個黃單胞菌菌株中的分泌蛋白數(shù)量及所占比例進(jìn)行分析，明確其所占比例為2.98%～3.27%，分泌蛋白數(shù)量和所占比例明顯高于細(xì)菌性黑斑病病菌[12]，是什么原因最終造成上述現(xiàn)象發(fā)生，有待于進(jìn)一步對細(xì)菌的分泌蛋白展開更加深入的研究。上述分析結(jié)果與前人的研究成果表明，植物病原真菌、卵菌以及細(xì)菌等不同物種之間，甚至在不同群體不同物種之間以及同一群體不同物種之間，分泌蛋白的數(shù)量占比較為接近，這為未來學(xué)術(shù)界進(jìn)一步開展不同物種、不同群體以及同一群體不同種之間分泌蛋白的功能共性化和差異化研究提供了重要的參考。

無論是XCB100、XCCN14、XC8004等3個黃單胞菌菌株，還是前期開展的7個核桃細(xì)菌性黑斑病病菌（X. arboricola pv. juglandis），均屬于黃單胞菌屬細(xì)菌，本研究首次明確同一屬不同種內(nèi)細(xì)菌分泌蛋白數(shù)量及所占比例存在差別，為進(jìn)一步進(jìn)行不同種內(nèi)細(xì)菌分泌蛋白功能解析提供了重要的研究思路。本研究選擇3個黃單胞菌菌株開展分泌蛋白找尋及特征分析工作，所獲得的結(jié)果具有一定的典型性和代表性，黃單胞菌屬細(xì)菌作為危害植物的一大類革蘭氏陰性細(xì)菌，目前已經(jīng)有多個黃單胞菌屬細(xì)菌種完成了全基因組序列測定工作，為未來進(jìn)一步實現(xiàn)該屬細(xì)菌分泌蛋白預(yù)測及功能解析提供了重要保障。特別值得說明的是，在病原細(xì)菌侵染植物的過程中，分泌蛋白發(fā)揮著極其重要的作用，而通過本研究所獲取的分泌蛋白在黃單胞菌侵染茄科和十字花科等植物的過程中，是否全部蛋白質(zhì)均發(fā)揮重要作用，是否存在冗余性問題，均有待于后續(xù)科學(xué)研究驗證。

本研究基于黃單胞菌3個不同菌種中所具有的4 175條、4 124條、4 299條蛋白質(zhì)序列，利用SignalP、ProtComp、TMHMM、Phobius、LipoP、TatP等生物信息學(xué)分析軟件分別獲得了135個、135個、128個分泌蛋白，結(jié)果顯示黃單胞菌中的分泌蛋白數(shù)量明顯高于細(xì)菌性黑斑病病菌中的分泌蛋白數(shù)量。進(jìn)一步對比分析上述3個不同黃單胞菌菌株，明確了其所含的分泌蛋白在氨基酸長度及組成、信號肽特征方面的差異并不大，氨基酸數(shù)量所占比例與7個核桃細(xì)菌性黑斑病病菌分泌蛋白也較為相似，信號肽長度多集中于19～26 aa，且丙氨酸含量最多，為20%～22%，在信號肽切割位點處，均屬于A-X-A類型。研究發(fā)現(xiàn)，在病原細(xì)菌侵染植物的過程中分泌蛋白發(fā)揮著極其重要的作用，即植物病原真菌、卵菌以及細(xì)菌等不同物種之間，甚至在同一群體不同物種之間，以及不同群體不同物種之間，所含有的分泌蛋白數(shù)量占比較為接近，這為今后進(jìn)一步開展不同物種、不同群體以及同一群體不同物種之間分泌蛋白的功能共性化和差異化研究提供了重要的參考，并為深入開展上述病原菌致病基因的研究提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。這些研究結(jié)果將為十字花科、茄科等植物病理學(xué)研究提供參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2020-04-28

基金項目：云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目（2018FG001-028）;國家自然科學(xué)基金項目（31960314）;西南林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（201825）

作者簡介：覃 悅（1992-），云南昆明人，碩士研究生，研究方向為經(jīng)濟(jì)林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)。（E-mail）453276403@qq.com

通訊作者：韓長志，（E-mail）hanchangzhi2010@163.com